Name: Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilität in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden. Diese zeitsparende Bildanalyse erleichtert die Untersuchung von Membrantrafficking im Nervensystem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, jetzige Zugehörigkeit: Novartis Institute for Biomedical Research) für die Entwicklung dieser Analyse und Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara und Dongsook Kim für ihre kritische Lektüre des Manuskripts.

Alle Tierverfahren wurden mit der Genehmigung des Tsukuba Tierpflege- und -nutzungsausschusses (IACUC) durchgeführt. 1. Dissektion <ol><li> Zur Vorbereitung embryonalen Tag 13-14 ICR oder C57BL / 6 Föten, euthanisieren schwangere Mäuse durch zervikale Versetzung. Entfernen Sie den Uterus und legen Sie ihn in eine Petrischale mit Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Spülen Sie es gut, um das Blut zu entfernen. </li><li> Mit Pinzette, übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit 70% Ethanol zu sterilisieren. </li><li> Übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit HBSS. Entfernen Sie die Föten aus dem Uterus mit sterilisierten Sezierzangen und chirurgischen Scheren. </li><li> Entschlüsseln Sie die Föten mit chirurgischen Scheren. Legen Sie sie in eine neue Petrischale mit HBSS. </li><li> Entfernen Sie die Haut und den Schädel und nehmen Sie die Gehirne mit sterilisierter Sezierzange heraus. Setzen Sie sie in eine Petrischale mit HBSS. HINWEIS: Von diesem Schritt an ist es am besten, das Verfahren auf einem sauberen durchzuführenBank. </li><li> Entfernen Sie die Meninges mit sterilisierter Sezierzange unter einem Stereomikroskop. Schneide die Basalganglien, Hippocampus und Kleinhirn mit Pinzette ab. Mit gebogenen Pinzetten, übertragen Sie die Cortices auf eine neue Petrischale mit HBSS. </li><li> Sammeln Sie alle Cortices mit einer Einweg-Tropfmaschine oder einer 25-ml-Pipette. Setzen Sie sie in eine 15-ml-Röhre und entfernen Sie dann die HBSS durch Pipettieren. </li><li> Füge 3 ml der zerebralen kortikalen Enzymlösung zu dem Röhrchen hinzu, das die Cortices enthält. Setzen Sie diese Röhre in ein Wasserbad und inkubieren bei 37 ° C für 5 min. ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturenzyms, bestehend aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,25% Trypsin und 1 mM EDTA. Sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. </li><li> Fügen Sie weitere 3 ml zerebrale kortikale Enzymlösung in das Röhrchen hinzu, das die Kortizes enthält, und bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 5 min inkubieren. </li><li> Entfernen Sie die zerebrale kortikale Enzymlösung mit einer 5-ml-Pipette und fügen Sie 5 ml Dulbe hinzuCco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Dissoziieren Sie die Cortices durch sanftes Pipettieren auf und ab mit einer 5-ml-Pipette mit einer sterilen P1000-Spitze. Mit einer 5-ml-Pipette mit einer P200-Spitze erneut pipettieren. </li><li> Setzen Sie ein 40 μm Nylon-Zellsieb auf ein 50 mL-Röhrchen und filtrieren Sie die Suspension, um den Schmutz zu entfernen. </li><li> Bei 420 xg für 5 min bei RT zentrifugieren und dann das DMEM-Medium entfernen. </li><li> Fügen Sie 5 ml zerebrales kortikales Kulturmedium hinzu und lassen Sie das Zellpellet vorsichtig resuspendieren. ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturmediums, bestehend aus Neuron-Basalmedium, ergänzt mit 1x B-27 Ergänzungen, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und stellen Sie die Zellkonzentration (wie gewünscht) mit dem zerebralen kortikalen Kulturmedium ein. </li><li> Tafel 3,0 × 10 6 kortikale Neuronen in 2,0 ml pro beschichtetem 35 mm Glasboden. HINWEIS: Vor dem Überziehen, beschichten35mmm Glasboden mit 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid (PDL) oder 0,01% Poly-L-Ornithin (PLO). Inkubieren für 3 h - O / N bei 37 ° C und Waschen mit PBS mindestens 3x. </li></ol> 2. Imaging Vesicle Motility <ol><li> Bereiten Sie die Plasmide, die jede Art von Vesikel zu etikettieren. Verwenden Sie zum Beispiel EGFP-Rab5 für frühe Endosomen, EGFP-Rab7 für späte Endosomen, LAMP-EGFP für Lysosomen und EGFP-LC3 für Autophagosomen 8 , 13 . HINWEIS: Diese Plasmide sind auf Anfrage von tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp erhältlich. Typischerweise können 3 -5 Tage in vitro (DIV) Neuronen mit diesen Plasmiden unter Verwendung von Transfektionsreagenzien transfiziert werden. </li><li> Mischen Sie 4,0 μg Plasmide mit 200 μl serumfreiem Medium durch Pipettieren. In einem separaten Röhrchen 8 μl Transfektionsreagenz (siehe Tabelle der Materialien ) in 200 μl serumfreies Medium verdünnen . 5 min bei RT inkubieren. </li><li> Mischen Sie die Plasmidlösung und die Transfektionsregentlösung in Schritt 2.2 durch Pipettieren. Inkubieren für 20 min bei RT. </li><li> Fügen Sie serumfreies Medium und 400 μl der Plasmidlösung aus Schritt 2.3 zu jeder beschichteten Glasbodenschale hinzu. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator für 30 min. Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml zerebrales kortikales Kulturmedium. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator für 1-2 Tage. </li><li> Nach 1 - 2 d Transfektion wählen Sie die transfizierten Zellen zur Bildaufnahme aus. HINWEIS: Vorzeitige Neuronen weniger als 7 DIV neigen dazu, dynamische Vesikelmotilität zu zeigen. Wählen Sie Neuronen aus, die die Fluoreszenzsonde mäßig exprimieren, da keine klare Bilder erhalten werden können, wenn ein hochexprimierendes Neuron ausgewählt wird. Wählen Sie auch eine typische neuronale Form, wie zyramidenförmige Neuronen, die lange Axone und komplizierte Dendriten aufweisen, um die Identifizierung des Axons und der Dendriten zu erleichtern (siehe Abbildung 1A)). </li><li> Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem: Für die Bildgebung, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Charge-Coupled Device (CCD) Kamera mit 40X Plan Apo 0.95NA oder 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektiv Linsen ausgestattet. Kontrollieren Sie die Temperatur bei 37 ° C mit einem Inkubationssystem. Erwerben Sie Neuronenbilder an einem Rahmen / 5 s über einen Zeitraum von 100 s, der von der Bilderfassungssoftware gesteuert wird. Alternativ können Bilder in kürzeren Intervallen und für längere Zeiträume, wie z. B. bei einem Rahmen pro 2 s über einen Zeitraum von 300 s, aufgenommen werden. HINWEIS: Für die Aufnahme von aufeinanderfolgenden Bildern stehen viele Anwendungen zur Verfügung, von denen viele für diese Methode geeignet sind. Daher wird keine besondere Anwendung empfohlen; Vielmehr sollte jeder Forscher verwenden, welche Anwendung verfügbar ist. </li></ol> 3. Bildanalyse <ol><li> Öffnen Sie alle aufeinanderfolgenden Bilder in der ImageJ Software mit manueller Tracking 14 . HINWEIS: Bisher war das manuelle Tracking mit wiDie in den Verfolgungsversuchen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 verwendet wurden . Manuelles Tracking wurde von Dr. Fabrice Cordelières entwickelt. Detaillierte schriftliche Anweisungen sind online verfügbar 20 . Für die Analyse wird die Qualität der Bilddaten mit einer ausreichenden Anzahl von Bildern verbessert. Es wird empfohlen, mehr als 20 Bilder zu verwenden. </li><li> Um die sequentiellen Bilder zu kombinieren, wählen Sie &lt;Bild&gt; → &lt;Stapel&gt; → &lt;Bilder zum Stapeln&gt;. Klicken Sie auf &lt;OK&gt;. </li><li> Wählen Sie &lt;Plugins&gt; → &lt;Manual Tracking&gt;; Ein Tracking-Fenster wird auftauchen. </li><li> Klicken Sie auf das Kontrollkästchen &lt;Parameter anzeigen&gt; und definieren Sie die Verfolgungsparameter im Parameterbereich. HINWEIS: Es können mehrere Parameter eingestellt werden, einschließlich Zeitintervall, x / y-Kalibrierung, z-Kalibrierung, Suchquadratgröße für MitteIng, Punktgröße, Linienbreite und Schriftgröße. In diesem vereinfachten Assay wurden sowohl das Zeitintervall als auch die x / y-Kalibrierung definiert. Unter anderen experimentellen Umständen kann es notwendig sein, auch andere Parameter zu definieren. Die hier verwendeten Parameter sind wie folgt: Das &lt;Zeitintervall&gt; ist 5 s und die &lt;x / y-Kalibrierung&gt; ist entweder 0,2662 μm für eine 40X Plan Apo 0,95NA Objektiv oder 0,10657 μm für einen 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektivlinse. </li><li> Nachdem die Parameter definiert sind, klicken Sie auf &lt;add Track&gt;, um einen neuen Track zu starten. </li><li> Nach der Bestimmung der Vesikel von Interesse ( z. B. die Vesikel , die durch blaue und rote Pfeilspitzen in Abbildung 1A (rechte Seite) angezeigt werden, klicken Sie auf die Mitte der Signale in den sequentiellen Bildern, um die xy-Koordinaten aufzuzeichnen. Die Ergebnisse der aufgezeichneten xy-Koordinaten, Entfernung und Geschwindigkeit erscheinen in einem neuen Fenster. HINWEIS: Im Falle von Lysosomen werden große helle Fluoreszenzsignale ( z. B. AbbUre 1A (rechte Tafel), orange Pfeilspitze) werden oft in Neuronen beobachtet. Da diese Signale gelegentlich entweder akkumulierte Vesikel oder pathologische Variationen aufweisen, sollten diese Signale zur Quantifizierung der Motilität vermieden werden. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6, um die xy-Koordinaten der Vesikel aus allen sequentiellen Bildern zu sammeln; Jedes Bild wechselt automatisch zum aufeinanderfolgenden Bild, nachdem der Referenzpunkt ausgewählt ist. </li><li> Exportieren Sie diese Daten in eine neue Tabelle ( zB eine Tabellenkalkulation). Verwenden Sie eine entsprechende Software, um einen geeigneten Graphen zu erstellen (siehe Tabelle der Materialien ). HINWEIS: Um die Daten zu analysieren, wählen Sie die Spalte &lt;Abstand&gt;, summieren alle Werte dieser Spalte und zeigen einen Motilitätsabstand als Balkendiagramm wie in Abbildung 1B . Zusätzlich wiederholen Sie diesen Schritt, berechnen Sie den Durchschnitt des gesamten Motilitätsabstandes und zeigen Sie als Balkendiagramm wie in Abbildung 1C . Die Software zur Erstellung eines Balkendiagramms und Wellenformdaten wird angezeigtDie Tabelle der Materialien. </li></ol>

<ol><li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li>
<li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra0910494">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li>
<li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+transport+along+the+lysosomal+pathway+in+mucolipidosis%2C+type+IV+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).</li>
<li>Venugopal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurologic%2C+gastric%2C+and+opthalmologic+pathologies+in+a+murine+model+of+mucolipidosis+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV.</a> Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+mechanism+to+regulate+lysosome+motility+for+lysosome+positioning+and+tubulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation.</a> Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).</li>
<li>Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIKfyve+regulates+CaV1.2+degradation+and+prevents+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death.</a> J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).</li>
<li>Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIKfyve+mediates+the+motility+of+late+endosomes+and+lysosomes+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites.</a> Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).</li>
<li>McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3%2C5-bisphosphate%3A+low+abundance%2C+high+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance.</a> Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).</li>
<li>Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plentiful+PtdIns5P+from+scanty+PtdIns%283%2C5%29P2+or+from+ample+PtdIns%3F+PIKfyve-dependent+models%3A+Evidence+and+speculation+%28response+to%3A+DOI+10.1002%2Fbies.201300012%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012).</a> Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).</li>
<li>Chow, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Vac14%2C+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3%2C5-bisphosphate%2C+results+in+neurodegeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017).</li>
<li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102(2011).</li>
<li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105(2013).</li>
<li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li>
<li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails%3A+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Ecol%22%5BJournal%5D)">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li>
<li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790(2016).</li>
<li>Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf</a> (2017).</li>
<li>ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498(2013).</li>
<li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+solutions%3A+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll führt die Vorgehensweise zur Quantifizierung der Vesikelmotilität ein. In primären Neuronen, Endosomen und Lysosomen neigen dazu, hohe Motilität in jüngeren Neuronen (4-6 DIV) zu zeigen. Angesichts der Tatsache, dass Neuronen einige Komponenten an die Vorderkanten liefern müssen, um neuronale Prozesse zu verlängern, sollte der Membranhandel in diesem Stadium dynamisch auftreten. So ist es wichtig, jüngere Neuronen zu verwenden, um die dynamische Motilität in neuronalen Dendriten zu beobachten. Darüber h...

Die präzise Kontrolle des Endosom-Lysosomen-Traffickings ist für die Regulierung der neuronalen Funktion unentbehrlich. Bemerkenswerterweise sind die dynamischen Bewegungen dieser Vesikel ein Schlüsselfaktor für die Regulierung der neuronalen Morphologie, der Entwicklung und des Überlebens. Defekte in diesem System verursachen schwere neuronale Störungen 1 , 2 . Die molekularen Mechanismen, die den Vesikelhandel mit neuronalen Erkrankungen verknüpfen, gelten als kompliziert, und mehrere Gruppen haben versucht, diese Relevanz zu untersuchen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die gestörte späte Endosom-Motilität signifikant mit der Niemann-Pick-C-Krankheit 3 assoziiert ist, einer erblichen neurodegenerativen Störung, die durch Lysosomendefekte verursacht wird. Ein weiteres Beispiel ist eine Mutation in einem lysosomalen Ca 2+ -Kanal, trpml 1, der die lysosomale Motilität beeinträchtigt, was zu lysosomalen Speicherkrankheiten 4 , 5 , </Sup&gt; 6 Unsere Gruppe hat berichtet, dass die Dysregulation des PtdIns (3,5) P 2 Umsatzes die Endosom- und Lysosommotilität in Neuronen unterdrückt, was zu einer Erhöhung der Anfälligkeit gegenüber der Stressreaktion 7 , 8 führt . Die metabolische Regulation von PtdIns (3,5) P 2 , die sich meist auf späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert, spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von zellulären Funktionen, darunter Vesikelhandels- und Fusionsspaltungsverfahren 9 , 10 . Da beeinträchtigte PtdIns (3,5) P 2 -Verwender eine schwere Neurodegeneration 11 , 12 verursachen , könnte die abweichende Regulation der Endosom-Lysosom-Motilität ein Schlüsselfaktor für das Verständnis der Pathogenese der Neurodegeneration sein. Eine Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Vesikelmotilität zugrunde liegen, kann so vielversprechende Hinweise liefern, die unsere Ungerechtigkeit vertiefen könnenVerständnis von mehreren neuronalen Störungen. In dieser Arbeit stellen wir eine wertvolle Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen mit einem kostenlosen Softwarepaket namens Manual Tracking vor. Ziel war es, eine schnelle Quantifizierungsmethode zur Analyse der Vesikelmotilität zu entwickeln. Diese Quantifizierung wird durch einen Standardansatz des Klickens auf einen Referenzpunkt in jedem Rahmen eines Zeitrafferfilms gelenkt. Die Verwendung der manuellen Tracking-Software macht diesen Ansatz im Gegensatz zu anderen Anwendungen ganz einfach und von weitem Nutzen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auch auf andere Zellen, wie Gliazellen, anwendbar. Obwohl diese Methode primitiv ist, kann sie auf verschiedene Analysen angewendet werden, einschließlich der zellulären Motilität und der morphologischen Veränderung. Beispielsweise können nach der Definition eines Referenzpunktes über eine Sequenz von Bildern Informationen über die Positionen der Referenzpunkte und die Zeit an jeder Position aus sequentiellen Bildern unter Verwendung von Datenanalyse und Bildverarbeitung weich extrahiert werdenWare. Zusammengenommen ist diese Methode einfach, aber leistungsfähig und trägt zur Entwicklung einer verbesserten Effizienz in Studien auf der Grundlage von Membran-Trafficking, wie die untersucht Endosom-Lysosom-Funktion.

<table><tbody><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td>Serum freies Medium</td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptmycin</td><td>Thermo Fisher 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzungen</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Nylon-Zellsieb</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Polyethylenimin "Max" (PEI)</td><td>polysciences</td><td>24765</td><td>Transfektionsreagenz. Als Alternative zu Lipofectamine2000 stehen 0,1 mg/ml Polyethylenimin in sterilisiertem Wasser gelöst. Aber es ist ein geringer Wirkungsgrad und eine hohe Toxizität.</td></tr><tr><td>BIOREVO BZ-9000</td><td>Keyence</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationssystem INUG2-K13</td><td>Tokay Hit</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Version 6.0</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Excel Version 15</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ verion 1.47</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung von endosom- und lysosom-motilen in kultivierten neuronen mit fluoreszierenden sonden

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Im Gehirn spielen Membran-Trafficking-Systeme eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Funktionen wie neuronaler Morphologie, synaptischer Plastizität, Überleben und Glia-Kommunikation. Bisher haben zahlreiche Studien berichtet, dass Defekte in diesen Systemen verschiedene neuronale Erkrankungen verursachen. So kann das Verständnis der Mechanismen, die der Vesikeldynamik zugrunde liegen, einflussreiche Hinweise liefern, die bei der Behandlung von mehreren neuronalen Störungen helfen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Vesikelmotazitäten, wie Motilitätsabstand und Bewegungsgeschwindigkeit, mit einem Software-Plug-In für die ImageJ-Plattform. Um Bilder zur Quantifizierung zu erhalten, markierten wir neuronale Endosom-Lysosomenstrukturen mit EGFP-markierten Vesikelmarkerproteinen und beobachteten die Bewegung von Vesikeln mit einer Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Methode ist sehr nützlich und vereinfacht die Messung der Vesikelmotilität in Neuriten wie Axonen und Dendriten sowie im Soma von Neuronen und Gliazellen. WeiterDiese Methode kann auf andere Zelllinien, wie Fibroblasten und Endothelzellen, angewendet werden. Dieser Ansatz könnte einen wertvollen Fortschritt für unser Verständnis des Membranhandels darstellen.

Dieser Assay wurde entwickelt, um die Vesikeldynamik in der in vitro Kultur zu messen. Dieser Assay wurde verwendet, um die Vesikelmotilität zu bestimmen, die mit der neuronalen Morphologie und dem Überleben assoziiert ist. Abbildung 1A und B zeigen repräsentative Daten, die die Lysosomenmotilität in Neuronen zeigen. Kortikale Neuronen wurden mit dem Lysosommarker, LAMP-EGFP, transfiziert und unter Verwendung eines Standard-Fluoreszenzmikroskops...

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Bildanalyse besteht darin, die Vesikelmotilität in Neuronen zu beobachten und einfach zu quantifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht eine unkomplizierte und zeiteffiziente Analyse des Membrantransports in Neuronen. Um dieses Verfahren zu beginnen, überführen Sie die Gebärmutter in eine neue Petrischale mit 70 % Ethanol.Überführen Sie danach den Uterus in eine andere Petrischale mit HBSS. Entfernen Sie anschließend die Feten aus dem Uterus mithilfe sterilisierter Präparationspinzetten und chirurgischer Scheren. Danach legen Sie sie in eine neue Petrischale mit HBSS.Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop die Haut und die Schädel und entnehmen Sie die Gehirne mit sterilisierten anatomischen Pinzetten. Überführen Sie diese anschließend in eine andere Petrischale mit HBSS. Entfernen Sie die Hirnhäute mit sterilisierten anatomischen Pinzetten.Danach schneiden Sie die überschüssigen Bereiche ab. Überführen Sie anschließend die Kortizes in eine neue Petrischale mit HBSS. Sammeln Sie alle Kortizes mithilfe einer Einwegpipette oder einer 25-Milliliter-Pipette und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Danach das HBSS durch Pipettieren entfernen. Anschließen

quantification-endosome-lysosome-motilities-cultured-neurons-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Live-Fluoreszenz-Imaging-Technik, um den Nachschub und die Mobilisierung der spezifischen synaptischen Vesikel (SV)-Pools in zentralen Nervenendigungen quantifizieren beschrieben. Zwei Runden SV Recycling sind in der gleichen Nervenenden Bereitstellung eines internen Kontrollsystems überwacht.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von Live Cell Imaging und Photobleichmittels Techniken, um die Oberfläche Ausdruck, Transportwege und-handel Kinetik der exogen exprimiert, pH-sensitiven GFP-markierten Proteine ​​an der Plasmamembran von Nervenzellen zu ermitteln.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Die Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an den Synapsen stark beeinflusst geclusterten synaptischen Stärke. Diese Methode quantifiziert fluoreszenzmarkierten Neurotransmitter-Rezeptoren in drei Dimensionen mit Single-Auflösung in...

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Intrazellulärer Transport von Frachten, wie Vesikeln oder Organellen, wird von molekularen Motorproteinen durchgeführt, die auf polarisierten Mikrotubuli verfolgen. Dieses Protokoll beschreibt die Korrelation der Transportrichtung einzelner Frachtpartikel, die sich innerhalb von Neuronen bewegen, mit der relativen Menge und Art der assoziierten Motorproteine.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Die Arbeit beschreibt die Optimierung von Fluoreszenzmikroskopie-Erfassungsparametern, um den axonalen Transport von endogenen markierten Frachten mit Einzelneuronenauflösung in einem lebenden Fadenwurm sichtbar zu machen.

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Lernen Sie eine Methode zur Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilität in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden. Diese zeitsparende Bildanalyse erleichtert die Untersuchung von Membrantrafficking im Nervensystem.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Weitere Videos entdecken