Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden
22. Mai 2017
Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser bildgebenden Analyse ist es, die Vesikelmotilität in Neuronen zu beobachten und leicht zu quantifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht es, den Membrantransport in Neuronen auf einfache und zeitsparende Weise zu analysieren. Um diesen Vorgang zu beginnen, übertragen Sie die Gebärmutter in eine neue Petrischale mit 70 % Ethanol.
Übertragen Sie als Nächstes die Gebärmutter mit HBSS in eine andere Petrischale. Entfernen Sie dann die Föten mit einer sterilisierten Präparierzange und einer chirurgischen Schere aus der Gebärmutter. Setzen Sie sie danach in eine neue Petrischale mit HBSS.
Unter einem Stereomikroskop werden die Haut und die Schädel entfernt und das Gehirn mit der sterilisierten Präparierzange herausgenommen. Übertragen Sie sie dann mit HBSS in eine andere Petrischale. Entfernen Sie die Hirnhäute mit einer sterilisierten Präparierzange.
Schneiden Sie dann die überschüssigen Regionen ab. Übertragen Sie als Nächstes die Kortikale mit HBSS in eine neue Petrischale. Sammeln Sie alle Kortexe mit einer Einwegpipette oder einer 25-Milliliter-Pipette und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Entfernen Sie anschließend das HBSS durch Pipettieren. Geben Sie dann drei Milliliter zerebrale kortikale Enzymlösung in das Röhrchen, das die Kortexe enthält. Legen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Danach geben Sie weitere drei Milliliter zerebrale kortikale Enzymlösung in das Röhrchen mit den Kortikalen und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad für weitere fünf Minuten. Nach fünf Minuten wird die Lösung des zerebralen kortikalen Enzyms entfernt und fünf Milliliter DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum hinzugefügt. Dissoziieren Sie die Kortex, indem Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette und einer sterilen P1000-Spitze vorsichtig auf und ab pipettieren.
Pipettieren Sie dann die Kortikale erneut mit einer Fünf-Milliliter-Pipette mit einer P200-Spitze. Legen Sie ein 40-Mikrometer-Nylon-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Röhrchen und filtern Sie die Suspension, um die Rückstände zu entfernen. Anschließend wird die Suspension fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 420 mal g zentrifugiert und dann das DMEM-Medium entfernt.
Fügen Sie anschließend fünf Milliliter zerebrales kortikales Kulturmedium hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Zellkonzentration mit dem zerebralen kortikalen Kulturmedium ein. Als nächstes wird die sechs kortikalen Neuronen dreimal 10 in zwei Milliliter Zellsuspension für jede kodierte 35-Milliliter-Glasbodenschale aufgetischt.
Mischen Sie bei diesem Verfahren vier Mikrogramm Plasmid mit 200 Mikrolitern serumfreiem Medium. In einem separaten Röhrchen verdünnen Sie acht Mikroliter des Transfektionsreagenzes in 200 Mikrolitern serumfreiem Medium. Inkubieren Sie die Lösung dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Nach fünf Minuten werden die Plasmidlösung und die Transfektionsreagenzlösung gemischt und die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend die Mischung in die codierten Glasbodenschalen geben. Inkubieren Sie die Neuronen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Ersetzen Sie anschließend das Medium durch zwei Milliliter Großhirnrinden-Kulturmedium und inkubieren Sie die Neuronen ein bis zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie für die Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera mit 40-fachen Objektiven ausgestattet ist. Halten Sie die Temperatur mit einem Inkubationssystem bei 37 Grad Celsius.
Erfassen Sie Neuronenbilder mit einem Frame alle fünf Sekunden über einen Zeitraum von 100 Sekunden, der von der Bilderfassungssoftware gesteuert wird. Um die Bilder zu analysieren, öffnen Sie alle sequenziellen Bilder in der ImageJ-Software mit manueller Nachverfolgung. Um die sequenziellen Bilder zu kombinieren, wählen Sie Bild, dann Stapel, gefolgt von Bildern zum Stapeln und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie danach Plugins und dann Manuelles Tracking.
Es öffnet sich ein Tracking-Fenster. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen "Parameter anzeigen" und definieren Sie die Tracking-Parameter im Abschnitt "Parameter". Klicken Sie dann auf Spur hinzufügen, um eine neue Spur zu starten.
Nachdem Sie die interessierenden Vesikel bestimmt haben, klicken Sie auf die Mitte der Signale in den sequenziellen Bildern, um die xy-Koordinaten aufzuzeichnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die xy-Koordinaten der Vesikel aus allen sequenziellen Bildern zu erfassen. Jedes Bild wechselt automatisch zum nachfolgenden Bild, nachdem der Referenzpunkt ausgewählt wurde. Dieses Bild zeigt die Motilität von LAMP-EGFP-haltigen Vesikeln in den Dendriten der kortikalen Neuronen der Maus nach zweitägiger Transfektion, beginnend bei vier DIV.
Das Bild zeigt das Zeitrafferbild der LAMP-EGFP-positiven Vesikel. Die rote Pfeilspitze zeigt ein sich bewegendes Vesikel und die blaue Pfeilspitze ein ruhendes Bläschen an. Die orangefarbenen Pfeilspitzen deuten auf höhere Fluoreszenzsignale hin.
Hier ist die zeitabhängige X-Achsen-Position der LAMP-EGFP-positiven Vesikel. Das Vesikel im roten Kreis mit der Bezeichnung b bewegt sich und das Vesikel im blauen Kreis mit der Bezeichnung a ruht. Dieses Balkendiagramm zeigt die Gesamtstrecke der LAMP-EGFP-Bewegung an.
Und dieses Balkendiagramm zeigt die durchschnittliche Motilitätsdistanz eines LAMP-EGFP, das Vesikel enthält.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelbeweglichkeit in Neuronen vor, die für das Verständnis neuronaler Funktionen unerlässlich ist. Der Ansatz ermöglicht eine einfache Analyse des Membrantransports im Nervensystem.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Membranverkehr
Hintergrund
- Der Membranverkehr ist entscheidend für die neuronale Funktion.
- Die Vesikelmotilität spielt dabei eine Schlüsselrolle.
- Das Verständnis dieser Mechanismen kann Erkenntnisse über die neuronale Gesundheit liefern.
- Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Vesikelbewegung sind oft komplex.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer praktischen Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität.
- Vereinfachung der Analyse des Membrantransports in Neuronen.
- Verbesserung des Verständnisses neuronaler Funktionen durch fortschrittlichere Methoden.
Verwendete Methoden
- Bildgebungsanalyse zur Beobachtung der Vesikelbeweglichkeit.
- Übertragung biologischer Proben in geeignete Medien zur Analyse.
- Verwendung sterilisierter Werkzeuge für die Probennahme.
- Zeiteffiziente Verfahren zur Quantifizierung.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine einfache Quantifizierung der Vesikelbeweglichkeit.
- Sie bietet einen unkomplizierten Ansatz zur Analyse des Membrantransports.
- Die Ergebnisse können zu einem besseren Verständnis neuronaler Funktionen beitragen.
- Mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Neurowissenschaftsforschung.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode vereinfacht die Untersuchung der Vesikelbeweglichkeit in Neuronen.
- Sie kann für verschiedene Anwendungen in der Neurowissenschaft angepasst werden.
- Weitere Forschungsarbeiten können auf diesem Ansatz aufbauen, um die neuronale Gesundheit zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der Vesikelmotilität liefert entscheidende Einblicke in Membrantransportmechanismen, die die neuronale Gesundheit und Krankheitsphänotypen beeinflussen. Diese Methode ermöglicht eine Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium, indem sie subzelluläre Dynamiken mit funktionellen Ergebnissen in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen verknüpft. Der Ansatz erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei der präklinischen Untersuchung, indem er quantitative und reproduzierbare Messgrößen des vesikulären Transports in für Krankheiten relevante neuronale Systeme bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Messung der Beweglichkeit von Endosomen und Lysosomen als funktionelle Parameter für die neuronale Gesundheit.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch standardisierte Quantifizierung der Vesikelbewegung in krankheitsrelevanten zellulären Modellen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem Beweglichkeitsstörungen mit mechanistischen Wegen bei neuronalen Erkrankungen korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative Messungen der Bewegungsstrecke und -geschwindigkeit für die Wirkstoffscreening an Neuriten und Soma.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Reproduzierbarkeit des Assays durch eine auf ImageJ basierende Verfolgung mit definierten Parametern und Zeitrafferaufnahmen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit verschiedenen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten und endothelialen Zellen, was die Nutzung über verschiedene Plattformen hinweg ermöglicht.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht translative Biomarker-Strategien, indem vesikuläre Dynamik mit neuronalem Überleben und synaptischer Funktion verknüpft wird.
- Operativer Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente Beweglichkeitsmessungen über verschiedene Modelle hinweg.
- Risikominderung: Hilft bei risikoadjustierten Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Verbindungen identifiziert werden, die Transportdefekte beheben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie quantitative Beweglichkeitsdaten bereitstellt, die Aufschluss über die Zielinteraktion und die Modulation von Signalwegen in neuronalen Systemen geben.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Vesikelbewegung als funktioneller Endpunkt zur Beurteilung der Integrität des Membrantransports quantifiziert wird.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Bildgebung und Nachverfolgungsprotokolle zur zeitaufgelösten Analyse von Vesikeln.
- Analytik: Erzeugt Metriken zur Bewegungsstrecke und durchschnittlichen Motilität, die einen vergleichenden Abgleich zwischen experimentellen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem Defekte im vesikulären Transport mit Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen verknüpft werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die auf verschiedene neuronale und nicht-neuronale Zelllinien anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem Mehrdeutigkeiten bei den mechanistischen Zusammenhängen zwischen Transportdefekten und neuronalen Phänotypen verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch eine Plug-in-basierte Analyse und definierte Verfolgungsparameter.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem objektive, quantitative Daten zur Zielinteraktion in Vesikelbeweglichkeitswegen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen identifiziert werden, die die Endosom-Lysosom-Dynamik in Krankheitsmodellen modulieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Expertise in der neuronalen Kultur, Transfektion und Fluoreszenzmikroskopie für eine genaue Vesikelmarkierung und -abbildung.
- Basiert auf der ImageJ-Plattform mit dem Manual Tracking-Plugin und der Fähigkeit zur sequenziellen Bildverarbeitung.
- Erfordert die Standardisierung der Transfektionseffizienz, der Bildaufnahmeintervalle und der Nachverfolgungsparameter über verschiedene Experimente hinweg.
- Die Anpassung an verschiedene Zelllinien kann eine Optimierung der Markerexpression und der Messungen der Beweglichkeits-Grundwerte erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz und mögliche Phototoxizität bei langen zeitraffenden Aufnahmen.
