Name: Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die In vivo Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie die nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung zur Langzeitüberwachung von Lungenentzündungen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht wiederholte Messungen am gleichen Tier über zwei Monate.

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Diese Arbeit wurde von der italienischen zystischen Fibrose-Stiftung Projekt FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 und von der italienischen zystischen Fibrose Liga durch die Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus unterstützt.

Alle beschriebenen Tierversuche wurden von dem intramuralen Tierschutzkomitee für Tierversuche durch das interdepartementale Zentrum für experimentelle Forschungsservice an der Universität von Verona genehmigt und entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63 UE, Italienisch D.Lgs 26/2014 und dem überarbeiteten &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot;, Washington, DC: National Academy Press, 1996. Dieses Protokoll und Experimente wurden von den National Institutes of Health (n 273/15) genehmigt. Die Tiere hatten freien Zugang zu Standard-Nagetier-Chow und weichem Leitungswasser und wurden für mindestens 5 Tage auf die lokalen Vivarium-Bedingungen (Raumtemperatur: 20 - 24 ° C, relative Feuchtigkeit: 40 - 70%, Hell-Dunkel-Zyklus: 12 h akklimatisiert ) Vor jeder Behandlung. 1. In vivo Gen Lieferung <ol><li> Verwenden Sie eine laminare Strömungshaube, um die in vivo- Zufuhrreagenz / Nukleinsäurekomplexe herzustellen. </li><li> Definiere das experimentelle Protokoll aNd-Parameter nach den Anweisungen des Herstellers in vivo . <ol><li> Verwenden Sie ein Gesamtinjektionsvolumen von 200 μl Komplexen pro Maus. </li><li> Beginne mit 40 μg DNA, suspendiert in endotoxinfreiem Wasser; Der Optimierungsbereich kann 60 μg erreichen. HINWEIS: Die Endkonzentration der Nukleinsäure im Injektionsvolumen darf nach den Anweisungen des Herstellers 0,5 μg / μL nicht überschreiten. </li><li> Verwenden Sie ein N / P-Verhältnis von 6 - 8 (0,12 - 0,16 μl Lieferreagenz pro μg Nukleinsäure). Berechnen Sie das entsprechende Reagenzvolumen. HINWEIS: Die Komplexe sollten für eine effektive Zelleingabe kationisch sein. Das N / P-Verhältnis ist definiert als die Anzahl der Stickstoffreste (N) auf dem in vivo- Zustellreagenz pro Nukleinsäurephosphat (P) und stellt das Maß für die Ionenbilanz innerhalb der Komplexe dar. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die berechnete Menge (siehe Schritt 1.2.1) der Nukleinsäure in 5% Glukose (endgültig konzentriertRation) unter Verwendung von 10% Glucose-Stammlösung (mitgeliefert) und sterilem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Verdünnungsvolumen die Hälfte des Endeinspritzvolumens ist. Vortex sanft oder mischen durch Pipettieren auf und ab. </li><li> Verdünnen Sie die berechnete Menge (siehe Schritt 1.2.3) des Lieferreagenzes in die Hälfte des Injektionsvolumens von 5% Glukose (Endkonzentration) mit der 10% igen Glucose-Stammlösung (mitgeliefert) und sterilem Wasser. Vortex sanft und drehen bei 13.000 xg für 15 s. </li><li> Füge die obigen verdünnten Abgabereagenzien auf die verdünnte Nukleinsäure auf einmal hinzu. Mischen Sie sie durch sanftes Vortexen und drehen Sie sich bei 13.000 xg für 15 s. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung aus Schritt 1.5 für 15 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sind die Komplexe für 4 h bei Raumtemperatur und für bis zu 7 Tage bei Lagerung bei 4 ° C stabil. </li><li> Führen Sie Schwanz-Vene-Injektionen unter Verwendung von Komplexen, die bei Raumtemperatur äquilibriert wurden. Legen Sie den Maus-Schwanz in warmes Wasser (50 - 53 ° C) für 30 s, um Vene-Dilatation zu ermöglichen. <ol><li> Legen Sie die Maus in das Rückhaltegerät. Setzen Sie eine 27- bis 30-Gauge-Nadel in die Schwanzvene in einem Winkel von 20 - 30 ° ein und ziehen Sie langsam 200 μl ein. Nach Beendigung die Nadel entfernen und Druck auf die Injektionsstelle ausüben. HINWEIS: Eine leichte Ausbuchtung im Schwanz während der Injektion zeigt eine falsche Positionierung an. Wenn dies der Fall ist, entfernen Sie die Nadel und wiederholen Sie den Prozess proximal zur vorherigen Seite. </li></ol></li><li> Visualisierung der Genexpression durch Durchführung von in vivo BLI (siehe Schritt 2) bei 24 und 48 h nach der intravenösen Injektion. </li></ol> 2. In vivo BLI HINWEIS: Im Vorfeld eine frische Stammlösung von 15 mg / ml D-Luciferin in DPBS vorbereiten, mit einer 0,22 μm Filtereinheit filtrieren und bei -20 ° C aufbewahren. <ol><li> Legen Sie die Mäuse in eine klare Plexiglas-Anästhesiekammer. Stellen Sie sicher, dass die Isoflurakammer voll ist. Wenn sie bereit sind, die Tiere zu betäuben, stellen Sie sicher, dass die Pumpe (lEft) und Kammer (rechts) sind eingeschaltet. Drehen Sie das Isofluran-Zifferblatt auf 2,5% für die Induktion und 2% für die Wartung. Tiere innerhalb der IVIS-Kammer werden während der Bildaufnahme unter 2,5% Isofluoran-Anästhesie gehalten. </li><li> Nachdem die Mäuse vollständig betäubt wurden, injizieren Sie 10 ml / kg Körpergewicht der D-Luciferin-Lösung 15 min vor der Bildgebung in einer intraperitonealen Route. ANMERKUNG: Eine kinetische Studie über D-Luciferin sollte durchgeführt werden, um die Zeit des Signalpeaks nach der Verabreichung von D-Luciferin zu bestimmen. </li><li> Öffnen Sie das In-vivo- Bildgebungssystem und bereiten Sie die Bilderzeugungskammer vor, indem Sie es mit einem Stück schwarzem Karton verkleiden (nach Fertigstellung entsorgen). Legen Sie die Nasenkonus nach Bedarf für eine korrekte Anästhesie (verwenden Sie einen Kegel pro Maus). ANMERKUNG: Die Röhre, die die Anästhesie an das Instrument liefert, ist aufgeteilt, so dass die gleiche Anästhesiekonzentration an die im Anbausystem befindlichen Anästhesieverteiler angetrieben wird. </li><li> Übertragen Sie die Mäuse (bis zu 5) aus dem bOchse an die Nasenkegel, die an der Mannigfaltigkeit im Abbildungssystem angebracht sind und die Tür schließen. Bildaufnahme dauert 5 min. </li><li> Erwerben Sie ein BLI mit der Software des Herstellers wie folgt. <ol><li> Initialisieren der Software. In der In-vivo- Bildgebung System Akquisition Control Panel, setzen Sie ein Häkchen neben Luminescent . Vergewissern Sie sich, dass die Einstellung des Erregungsfilters blockiert ist und die Einstellung des Emissionsfilters geöffnet ist. </li><li> Klicken Sie auf die Pfeile: Für den Lumineszenz-Imaging-Modus wählen Sie eine 5-Minuten-Belichtungszeit, Binning 8 und F / Stop 1; Wählen Sie für den Photograph Imaging-Modus Binning 4 und F / Stop 8 aus. </li><li> Wählen Sie aus der Dropdown-Liste &quot;Gesichtsfeld&quot; D, 19 cm und eine Betreffhöhe von 1,5 cm aus. Klicken Sie auf Erwerben, wenn Sie bereit sind, das Bild zu erwerben. </li></ol></li><li> Wenn die Bilderfassung abgeschlossen ist, legen Sie die Mäuse wieder in ihre Käfige. </li><li> Quantifizierung der aus bestimmten Regionen ausgesendeten Photonen mit der Software des Herstellers. <ol><li> Klicken <stRong&gt; ROI Tools in der Werkzeugpalette. Wählen Sie im ROI Tools die Option ROI aus der Dropdown-Liste Typ aus. </li><li> Klicken Sie auf das Quadrat-Symbol und zeichnen Sie einen quadratischen ROI mit den richtigen Dimensionen, um den Thorax eines Tieres zu decken. Kopiere und füge den ROI für jedes Tier ein, um ROIs mit den gleichen Dimensionen zu erhalten. Klicken Sie im ROI Tools-Panel auf ROM messen , um die Messungen der Gesamtintensität in den ROIs zu erhalten. </li><li> Beachten Sie die ROI-Messdaten für alle ROIs, die in den Bildern oder Sequenzen während einer Sitzung erstellt wurden (ein ROI pro Zeile). Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Datei gespeichert wird. </li></ol></li></ol> 3. Mäuse-Herausforderung mit pro-entzündlichen Stimuli ANMERKUNG: Vor der Maus-Herausforderung mit pro-inflammatorischen Reizen, überprüfen Sie die Baseline-Aktivierung durch i n vivo BLI (siehe Schritt 2). Mindestens 7 Tage müssen zwischen In-vivo- Gen-Lieferung und Mous passierenHerausforderung, um die milde und vorübergehende Entzündung zu verschwinden. <ol><li> Bereiten Sie die Ausrüstung für die intratracheale Instillation vor (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 ). <ol><li> Verbinden Sie die 5-ml-Einwegspritzen mit der Feder (C, E), einer 100 μl Spritze (B) und einem Einweg-Messgerät (D) mit dem 3-Wege-Hahn (A). Stellen Sie das System auf den Träger (H). Stellen Sie das System auf den Träger (H). </li><li> Verbinden Sie den PE190 Mikro-Schlauch (F) mit dem Einweg-Messgerät (D) und dem Stift-Jahrhundert (G). </li><li> Füllen Sie die 5-ml-Spritze mit 800 μl Luft und drehen Sie den 3-Wege-Hahn. HINWEIS: Füllen Sie das Röhrchen mit Pseudomonas aeruginosa Kulturüberstand durch Absaugen von 50 μl in die 100 μl Spritze. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische RepreseEine einzelne Komponente des intratrachealen Gerätes. (A) 3-Wege-Hahn, (B) 100-μL Hamilton-Spritze, (C) Einweg-5-ml-Spritze, (D) Einweg-Messgerät, (E) Einweg-5-ml-Spritze mit Feder, (F) PE190 Mikro-medizinischen Schlauch , (G) pen Jahrhundert und (H) Unterstützung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig2.jpg" /> Abbildung 2: Darstellung des zusammengesetzten intratrachealen Gerätes. Die Identifikationen sind die gleichen wie in Abbildung 1 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig2large.jpg" target="_blank">bitte klicken</a>Hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="2"><li> Anästhesieren der Mäuse unter Verwendung einer Isofluran-Verdampferkammer, die auf 2,5% Isofluran mit Sauerstoff gemischt ist. </li><li> Überwachen Sie das Tier, um die Auswirkungen des Anästhetikums nach 3 - 5 min zu bewerten. HINWEIS: Um zu bestätigen, dass die Maus vollständig betäubt ist, überwachen Sie die folgenden Zeichen sorgfältig: Die verlangsamte Atemfrequenz sollte sich verlangsamen, mangelnde Armdehnung beim Aufheben am Hals und ein Mangel an Reaktion, wenn die Hinterbeine angeregt werden. Warten Sie noch einige Minuten und überprüfen Sie noch einmal, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind. </li><li> Legen Sie die anästhesierte Maus auf die Plexiglas-Intubationsplattform und hängen sie mit ihren Schneidezähnen, die auf den Draht gelegt werden. </li><li> Schalte das Laryngoskop mit der linken Hand ein (für rechtshändige Forscher) und packe ein paar stumpfen Pinzetten. Verwenden Sie die Spitze des Laryngoskops und die Pinzette, um vorsichtig den Mund zu öffnen. </li><li> Zieh die Zunge heraus und hAlt mit der Pinzette zur Seite. Führen Sie die Laryngoskop Klinge in Richtung der Rückseite des Mundes. Halten Sie das Laryngoskop sehr sanft in einem 90 ° Winkel, bis die Öffnung der Trachea sichtbar ist. Halten Sie das Laryngoskop an Ort und Stelle. </li><li> Benutzen Sie die andere Hand, nehmen Sie das Abgaberohr mit dem Ende des PE-Schlauches und stecken Sie es in die Trachea ein. Drehen Sie das Dreiwegeventil, um das Inokulum zu liefern. Ziehen Sie den Schlauch so schnell wie möglich aus der Trachea. Halten Sie die Maus für ein paar Sekunden aufrecht, um das Inokulum in die Lunge einatmen zu lassen. HINWEIS: Mäuse werden ersticken und sterben, wenn die Trachea zu lange blockiert ist. </li><li> Entfernen Sie die Maus von der Plattform. Die Erholungszeit kann je nach Belastung variieren. Überwachen Sie die Maus sorgfältig, um sicherzustellen, dass das Tier innerhalb von 30 Minuten nach dem Eingriff vollständig wach ist. </li><li> Intraperitoneal injizieren 150 mg / kg D-Luciferin und Bild der Lunge mit einem in vivo Bildgebung System 4, 24 und 48 h nach der intratrachealInstillation der Reize. Quantifizierung der aus bestimmten Regionen ausgesendeten Photonen mit der Software des Herstellers. </li></ol>

<ol><li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+approaches+to+asthma-chronic+obstructive+pulmonary+disease+overlap+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).</li>
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<li>Stellari, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transiently+transgenized+mice+with+a+bovine+interleukin+8+%28CXCL8%29+promoter%2Fluciferase+reporter+construct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct.</a> PLoS One. 7 (6), e39716(2012).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+lung+inflammatory+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+and+its+modulation+by+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin.</a> J Transl Med. 13, 251(2015).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+lung+inflammation+in+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice.</a> J Transl Med. 14 (1), 226(2016).</li>
<li>De Simone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genetic+background+influences+the+response+to+the+opportunistic+Pseudomonas+aeruginosa+infection+altering+cell-mediated+immunity+and+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication.</a> PLoS One. 9 (9), e106873(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In einer früheren Arbeit 11 wurde ein Kontrast zwischen bIL-8-Luc-abhängigen BLI- und BAL-Markern gezeigt. Es beruhte auf dem differenzierten Grad der Empfindlichkeit innerhalb der Mäusestämme 12 . Aus diesem Grund erfordert die erste Anwendung des bIL-8-Luc-Modells auf einen anderen Mausstamm eine anfängliche Untersuchung der entzündlichen Reaktion sowohl in Bezug auf BLI als auch auf standardisierte entzündliche Marker. Die Mäusentransfektion...

Chronische Lungenerkrankungen wie Asthma, chronisch obstruktive Lungenkrankheit (COPD), zystische Fibrose (CF) und Bronchiektase sind durch eine Atemwegsentzündung gekennzeichnet. Atemwegsentzündung ist gekennzeichnet durch Ödeme, zelluläre Infiltration, T-Lymphozyten- und Mastzellaktivierung, erhöhte Atemwegssekretionen und übermäßige Kollagenablagerung. CF ist eine Multisystem-Störung, und seine Hauptursache für Mortalität und Morbidität ist die lungenbakterielle Infektion mit zunehmender pulmonaler Exazerbation. Der Rückgang der Lungenfunktion prognostiziert ein deutlich schlechteres Ergebnis 1 , 2 , 3 , 4 . Der Entzündungszustand der Atemwege wird gewöhnlich durch die Auswertung von immunologischen Markern beobachtet, die während des entzündlichen Prozesses in dem von den unteren und oberen Atemwegen abgeleiteten Material, wie z. B. Sputum,Ults Bronchoskopien werden auch durchgeführt 5 . Murine Modelle sind wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung der Pathogenese und Evolution von Krankheiten, die durch eine Atemwegsentzündung gekennzeichnet sind und für die wirksame Behandlungen oder Kuren noch nicht identifiziert wurden. Tiermodelle der Lungeninfektion und -entzündung wurden verwendet, um Asthma- und Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen, einschließlich der Rolle von Chemikalien, die menschliche Zustände simulieren ( z. B. Zigarettenrauchbelastung, LPS, Elastase, Ovalbumin, Poly I: C usw.) Ebenso wie Kombinationen der oben genannten) 6 . Die Messung von entzündungsbezogenen Parametern erfordert das Opfer der Tiere, da invasive Ansätze erforderlich sind, um Faktoren wie Bakterienbelastung, Zytokine in der Lunge und gesammelte bronchoalveoläre Spülung (BAL) Flüssigkeit zu messen. Auch histologische Untersuchungen sind oft erforderlich. Die Möglichkeit, Informationen über die entzündliche Reaktionskinetik zu erhalten, erfordert die Verwendung von numErous Mäuse. Daher ist eine Technik, die es ermöglicht, solche Informationen ohne die Notwendigkeit zu erhalten, die Tiere zu opfern, auf technischen, ethischen, ökonomischen und operativen Grundlagen wertvoll. IL-8 ist ein wesentlicher Spieler im Entzündungsprozess und rekrutiert Leukozyten an das entzündete Gewebe. Es stellt eine molekulare Auslesung für die Untersuchung der Entzündungswegaktivierung dar. MIP-2 und KC können funktionelle Homologe von humanem IL-8 bei Mäusen sein. Mäuse exprimieren nur einen potentiellen IL-8-Rezeptor, ein Homolog von humanem CXCR2 7 , 8 , aber sie sind in der Lage, einen heterologen IL-8-Genpromotor zu modulieren, der ein Reportergen antreibt. Ein Lungenentzündungsmurinmodell wurde kürzlich nach der Beobachtung entwickelt, dass ein Rinder-IL-8-Promotor / Luciferase-Reporter-Konstrukt in Mäusen transaktiviert werden kann. Diese Funktion ermöglicht die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) zur Überwachung der entzündlichen Reaktion im Leben aNimals 9 Dieses Modell wurde angepasst, um Entzündungen zu untersuchen, die durch bakterielle Exoprodukte ausgelöst wurden ( z. B. LPS oder Produkte, die durch Bakterienstämme freigesetzt wurden) oder TNFalpha 10 , 11 . Der Wirkstoffforschungsprozess konzentriert sich auf die Entwicklung und Optimierung von alten und neuen entzündungshemmenden Molekülen, die Lungenerkrankungen wie CF, Asthma und COPD behandeln können. Diese neuen chemischen Einheiten müssen schnell und bequem in Tiermodellen getestet werden, die mit spezifischen klinischen Phänotypen verknüpft werden können, um das Design von intelligenten klinischen Studien zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>FMT 2500 Fluoreszenztomographie-System</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimenteller Builder</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina Serie II Präklinisches In Vivo; Bildgebungssystem</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimenteller Builder</td><td></td></tr><tr><td>MMPsense 750 FAST</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>NEV10001EX</td><td>Schützen Sie die Sonde vor Licht, lagern Sie sie bei 4 Grad; C</td></tr><tr><td>Weibliche Inzucht BalbC</td><td>Harlan Laboratories Italien</td><td></td><td>Vor der Anwendung wurden die Tiere mindestens 5 Tage lang an die lokalen Vivariumbedingungen akklimatisiert</td></tr><tr><td>bIL-8-Luc Plasmid</td><td>Abteilung für Medizinische Veterinärwissenschaften, Universität Parma, Italien</td><td></td><td>Lagern Sie das Plasmid bei -20 μg; C</td></tr><tr><td>pGL3basic vector</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>Speichern Sie den Vektor bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>JetPEI Reagenz für DNA-Transfektion</td><td>Polyplus Transfektion</td><td>201B-001G</td><td>Die DNA- und JetPEI-Mischung wurde mit einem endgültigen N/P-Verhältnis von 7</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Kaliumsalz, 1 g</td>, <td>Perkin Elmer, Inc. formuliert.</td><td>122796</td><td>Vor Licht schützen, bei -20 ° C lagern; C</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Caliper Life Sciences,Experimental</td> <td>Builder</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>ESTEVE spa</td><td>571329.8</td> Nicht <td>einatmen</td></tr><tr><td>Bio-Plex Cytokine Assay Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>M60-009RDPD</td><td>Lagern Sie das ungeöffnete Kit bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>Dasit XT 1800J</td><td>Experimenteller Builder</td><td></td></tr><tr><td>Penn-Jahrhundert Modell DP-4M Trockener Insufflator</td><td>Penn-Jahrhundert</td><td>DPM-EXT</td><td></td></tr><tr><td>Gasanästhesiesystem XGI-8</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>PE190 mikromedizinischer Schlauch</td><td>2biologische Instrumente snc</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Spritze ohne Nadel 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS*05SE1</td><td>Schneiden Sie die Bretter des Kolbens mit einer Schere</td></tr><tr><td>Hamilton 0,10 mL (Modell 1710)</td><td>Gasdicht</td><td>81022</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3-Wege Hahn</td><td>Braun</td><td>4095111</td><td></td></tr><tr><td>Spritze mit Nadel 1 mL</td><td>Pic Lösung</td><td>3,071,260,300,320</td><td>Ohne Nadel verwenden</td></tr><tr><td>Kunststoff-Ernährungsschläuche 18ga x 50 mm</td><td>2biologische Instrumente snc</td><td>FTP-18-50</td><td>Schräg die Spitze schneiden&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ein il-8 transientes transgenisiertes mausmodell für die<em&gt; in vivo</em&gt; langzeitüberwachung von entzündlichen reaktionen

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Atemwegsentzündung ist oft mit bakteriellen Infektionen assoziiert und stellt eine wichtige Determinante der Lungenerkrankung dar. Die in vivo- Bestimmung der entzündungshemmenden Fähigkeiten verschiedener Faktoren ist anspruchsvoll und erfordert terminale Verfahren wie die bronchoalveoläre Spülung und die Entfernung von Lungen für die In-situ- Analyse, wobei die Längsvisualisierung in derselben Maus verhindert wird. Hier wird die Lungenentzündung durch die intratracheale Instillation von Pseudomonas aeruginosa Kulturüberstand (SN) bei transient transgenisierten Mäusen induziert, die das Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle eines heterologen IL-8-Rinder-Promotors exprimieren. Die Luciferase-Expression in der Lunge wird durch in vivo- Biolumineszenzbild (BLI) -Analyse über einen Zeitabschnitt von 2,5 bis 48 Stunden nach der Instillation überwacht. Die Prozedur kann mehrmals innerhalb von 2 - 3 Monaten wiederholt werden, so dass die Auswertung der Entzündungsreaktion bei denselben Mäusen möglich istDie Notwendigkeit, die Tiere zu beenden. Dieser Ansatz erlaubt die Überwachung von pro- und entzündungshemmenden Faktoren, die in der Lunge in Echtzeit wirken und für funktionelle und pharmakologische Studien geeignet erscheinen.

Für die in vivo- Überwachung der Lungenentzündung bei Mäusen, die mit konzentriertem Bakterienüberstand (30x) mit abgesonderten Virulenzfaktoren herausgefordert wurden, wurde das trans-transgene Mausmodell von bIL-8-Luc verwendet. Die induzierte Entzündungsreaktion wurde durch in vivo- Bildgebung als eine Erhöhung des BLI-Signals nachweisbar. Pro-inflammatorische Aktivität war deutlich nachweisbar 2,5 h nach der Instillation, obwohl das BLI-Signal erreichte den höchsten...

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Visualisierung der IL-8-Promotor-abhängigen Entzündungsaktivierung in den Lungen von Mäusen durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Das gleiche Tier kann BLI mehrmals für bis zu zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Auslieferung des Luciferase-Reporter-Konstrukts unterworfen werden.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lungentzündung bei Mäusen in Echtzeit nach einer nichtinvasiven Herausforderung mit einem proinflammatorischen Stimulus, wie beispielsweise einem bakteriellen Kulturüberstand, zu überwachen. Diese Methode kann dabei helfen, spezifische Fragen zu Wirt-Pathogen-Interaktionen zu beantworten, etwa welche bakteriellen Produkte für Atemwegserkrankungen verantwortlich sind. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind ihre Nichtinvasivität und die Möglichkeit, dieselben Tiere im Zeitverlauf wiederholt zu beobachten.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Installationsschritte allein anhand von Text schwer zu erlernen sind. Die Durchführung der Prozedur übernehmen Francesca Ruscitti, Angela Sandri und Federico Boschi, allesamt externe Mitarbeiter meiner Forschungsgruppe. Für die in-vivo-Genübertragung erwärmen Sie zunächst den Nukleinsäure-Komplex auf Raumtemperatur.Als Nächstes erwärmen Sie den Schwanz des Versuchstieres für 30 Sekunden in Wasser mit einer Temperatur von 50 bis 53 Grad Celsius. Sobald die Schwanzvenen erweitert sind, platzieren Sie die Maus in einer geeigneten Fixiervorrichtung und führen eine Nadel mit einer Größe von 27 bis 30 Gauge unter einem Winkel von 20 bis 30 Grad in eine erweiterte Schwanzvene ein, um 200 Mikroliter des Komplexes zu injizieren. Nach vollständiger Applikation der Flüssigkeitsmenge ziehen Sie die Nadel heraus und üben Druck auf die Injektionsstelle aus.24 bis 48 Stunden später, 10 Milliliter pro Kilogramm frisch zubereitetes D-Luciferin intraperitoneal in bis zu fünf vollständig anästhesierte, komplex injizierte Tiere spritzen, 15 Minuten vor der Biolumineszenz-Bildgebung. Öffnen Sie das In-vivo-Bildgebungssystem und legen Sie ein Stück schwarzes Kartonpapier in die Bildgebungskammer, anschließend platzieren Sie die Mäuse in die Bildgebungskammer. Öffnen Sie die Software des In-vivo-Bildgebungssystems und initialisieren Sie das System.Setzen Sie ein Häkchen bei lumineszent und vergewissern Sie sich, dass der Anregungsfilter auf „blockieren“ und der Emissionsfilter auf „geöffnet“ eingestellt ist. Wählen Sie für den lumineszenten Bildgebungsmodus eine Belichtungszeit von fünf Minuten, eine Binning-Stufe von acht und eine Blende von eins. Wählen Sie für den fotografischen Bildgebungsmodus eine Binning-Stufe von vier und eine Blende von acht.Wählen Sie im Menü „Feld der Ansicht“ das D-Feld der Ansicht mit einem Bereich von 19 mal 19 Zentimeter und einer Objekthöhe von 1,5 Zentimetern aus. Sobald alle Parameter eingestellt sind, klicken Sie auf „Acquire“, um die Tiere abzubilden. Nachdem das Bild aufgenommen wurde, bringen Sie die Tiere zurück in ihre Käfige und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Erholung.Um die von bestimmten interessierenden Bereichen emittierten Photonen zu quantifizieren, öffnen Sie die Software des Bildgebungssystems und wählen Sie das Werkzeug für den interessierenden Bereich. Wählen Sie im Typmenü „Messbereich des interessierenden Bereichs“ aus und verwenden Sie das quadratische Werkzeug, um einen quadratischen interessierenden Bereich um den Thorax eines Tieres zu zeichnen. Kopieren und fügen Sie diesen interessierenden Bereich in jedes der anderen Tiere ein, um interessierende Bereiche mit denselben Abmessungen zu erzeugen, und klicken Sie auf „Messbereich des interessierenden Bereichs“, um die Gesamtintensität aller interessierenden Bereiche zu messen.Klicken Sie anschließend auf „Exportieren“ und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Messdaten der interessierenden Bereiche gespeichert werden sollen. Mindestens sieben Tage nach der Gendosierung in vivo verbinden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer Feder, einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze und einer Einwegkanüle mit einem Dreiweghahn. Verbinden Sie ein Stück PE-190-Mikroschlauch mit der Einwegkanüle und mit der Pen-Sentry-Nadel.Füllen Sie die Fünf-Milliliter-Spritze mit 800 Mikrolitern Luft. Drehen Sie den Hahn und ziehen Sie den Überstand im Reagenzglas auf, indem Sie die 100-Mikroliter-Spritze füllen, und legen Sie die anästhetisierte Versuchsmaus dann in die Plexiglas-Intubationsplattform, wobei Sie das Tier an den Schneidezähnen fixieren. Schalten Sie mit der nichtdominanten Hand das Laryngoskop ein und verwenden Sie in der anderen Hand stumpfe Pinzette sowie die Spitze des Laryngoskops, um den Mund vorsichtig zu öffnen.Verwenden Sie die Pinzette, um die Zunge zur Seite zu ziehen, und führen Sie die Klinge des Laryngoskops in Richtung des hinteren Mundteils. Drücken Sie das Laryngoskop ganz leicht in einem 90-Grad-Winkel nach unten, bis die Öffnung der Luftröhre sichtbar ist. Führen Sie mit der anderen Hand das Lieferrohr, das mit dem Ende des PE-Schlauchs verbunden ist, in die Luftröhre ein und drehen Sie das Drei-Wege-Ventil, um den Inokulum von Pseudomonas aeruginosa zu verabreichen; entfernen Sie das Rohr anschließend schnell, sobald der gesamte Inokulum verabreicht wurde.Halten Sie die Maus einige Sekunden aufrecht, damit das Inokulum in die Lunge inhaliert werden kann. Schließlich injizieren Sie den infizierten Tieren 150 Milligramm pro Kilogramm D-Luciferin intraperitoneal und nehmen die Lungen im In-vivo-Bildgebungssystem vier, 24 und 48 Stunden nach der intratrachealen Stimulationsapplikation auf, gefolgt von der Quantifizierung der Photonen, wie gerade gezeigt. Hier wurde die biolumineszente Bildgebung zur Echtzeit-In-vivo-Überwachung der Lungentzündung bei bovinem Interleukin-8-Luciferase-transient transgenen BALB/c-Mäusen verwendet, die mit konzentriertem bakteriellem Überstand, der sekretierte Virulenzfaktoren enthält, herausgefordert wurden, wie gerade gezeigt.Die ausgelöste entzündliche Reaktion zeigte sich bereits 2,5 Stunden nach der Applikation als Zunahme des Biolumineszenzsignals, wobei die Photonenemission zwischen fünf und 24 Stunden ihren Höhepunkt erreichte und bis mindestens 48 Stunden nach der Stimulation nachweisbar blieb. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Bronchoalveoläre Lavage durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Anzahl und den Typen der nach der Behandlung gebildeten Immunzellen zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Lungenentzündung bei Mäusen erzeugt und mittels Biolumineszenzbildgebung in vivo überwacht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden...

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu...

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

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Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

&lt;p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Quelle: Schmitz, K., et al., Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Hirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose bei Mäusen. J. Vis. (2017).Dieses Video zeigt die Methode zur Visualisierung und Überwachung von experimenteller Autoimmun-Enzephalomyelitis oder EAE-induzierter Entzündung im Sehnerv mit Biolumineszenz-Bildgebung. Dazu gehören die Positionierung der Maus, die Injektion von...

Biolumineszenz-Bildgebung in einem EAE-Mausmodell

Das enterische Nervensystem wird von Neuralleistenzellen gebildet, die sich vermehren, wandern und den Darm besiedeln. Neuralleistenzellen differenzieren sich in Neuronen mit Markern, die spezifisch für ihren Neurotransmitter-Phänotyp sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zum Präparieren, Fixieren und Immunfärben des embryonalen Magen-Darm-Trakts der Maus, um die Expression von Neurotransmittern des enterischen Nervensystems sichtbar zu machen.

Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren

Dieses Manuskript bietet eine Beschreibung der Methodik, die zur Etablierung von Transduktions-Transplantations-Mausmodellen verwendet wurde. Es wird detailliert über technische Fehler berichtet, die bei der Durchführung von Knochenmarktransplantationen vermieden werden sollten. Es sollte ein klares Verständnis für die Bedeutung eines hohen Virustiters, Transfektion/Transduktion und Bestrahlung gewonnen werden.

Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Wir beschreiben hier ein transgenes Reporter-Mausmodell, um die IL-22-produzierenden Zellen in verschiedenen Mausgeweben sichtbar zu machen. Mit dieser Methode kann die Position anderer Zytokine oder Sekretärsproteine in der Maus verfolgt werden.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für live-Aufnahmen von Eindringmittel beschriftete menschliche endometrialen Fragmente bei Mäusen verpflanzt. Die Methode ermöglicht das untersuchen die Auswirkungen der Medikamente der Wahl auf die Größe der nichtmalignem Läsion durch Überwachung und Quantifizierung der Fluoreszenz emittiert von fluoreszierenden Reporter in...

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Ein Ansatz ist für Echtzeit-Erkennung der angeborenen Immunantwort zu kutanen Verwundung und Staphylococcus Aureus Infektion der Mäuse beschrieben. Durch Vergleich LysM EGFP Mäuse (die fluoreszierenden Neutrophile besitzen) mit einem LysM EGFP immungeschwächte Maus Sorte gekreuzt, wir vorab unser Verständnis der Infektion und der Entwicklung von Ansätzen zur Bekämpfung der Infektion.

Ein Mausmodell zu beurteilen, angeborene Immunantwort auf Staphylococcus Aureus -Infektion

Präsentiert wird hier eine mikroskopische Multiphotonen-Plattform für die Live-Maus-Augenoberflächenbildgebung. Fluoreszierende transgene Maus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Nichtlineare Signale der zweiten harmonischen Generation, die von kollagenen Strukturen abgeleitet werden, bieten eine etikettenfreie Bildgebung für stromale Architekturen.

Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

Der Artikel bietet ein umfassendes Protokoll zur Erstellung eines mütterlichen Immunaktivierungsmodells (MIA), das die Auswirkungen früher Schwangerschafts-Entzündungen auf die Neuroentwicklung untersucht, einschließlich wichtiger Kennzahlen zur Gewährleistung von Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit.

Erzeugung des frühgestationalen mütterlichen Immunaktivierungsmodells zur Beurteilung pränataler Entzündungen auf die Neuroentwicklung

Erfahren Sie die nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung zur Langzeitüberwachung von Lungenentzündungen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht wiederholte Messungen am gleichen Tier über zwei Monate.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die

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