Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die In vivo Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Lungenentzündung bei Mäusen nach einer nicht-invasiven Provokation mit einem proinflammatorischen Stimulus wie einem Bakterienkulturüberstand in Echtzeit zu überwachen. Diese Methode kann helfen, spezifische Fragen zu Wirt-Erreger-Interaktionen zu beantworten, z. B. welche bakteriellen Produkte für Atemwegsinfektionskrankheiten verantwortlich sind. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie nicht invasiv ist und dass dieselben Tiere über einen längeren Zeitraum wiederholt überwacht werden können.

visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da Installationsschritte allein durch Text schwer zu erlernen sind. Francesca Ruscitti, Angela Sandri und Federico Boschi, alle externe Mitarbeiter meiner Forschungsgruppe, werden das Verfahren vorführen. Für die In-vivo-Genverabreichung erwärmen Sie zunächst den Nukleinsäurekomplex auf Raumtemperatur.

Als nächstes erwärmen Sie den Schwanz des Versuchstieres für 30 Sekunden in 50 bis 53 Grad Celsius heißem Wasser. Wenn sich die Schwanzvenen erweitert haben, legen Sie die Maus in eine geeignete Rückhaltevorrichtung und führen Sie eine 27- bis 30-Gauge-Nadel in einem Winkel von 20 bis 30 Grad in eine erweiterte Schwanzvene ein, um 200 Mikroliter des Komplexes zu injizieren. Wenn das gesamte Volumen verabreicht wurde, entfernen Sie die Nadel und üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus.

Vierundzwanzig bis 48 Stunden später injizieren Sie intraperitoneal 10 Milliliter pro Kilogramm frisch zubereitetes D-Luciferin in bis zu fünf vollständig anästhesierte, komplexinjizierte Tiere, 15 Minuten vor der biolumineszierenden Bildgebung. Öffnen Sie das In-vivo-Bildgebungssystem und legen Sie ein Stück schwarzen Karton in die Bildgebungskammer und setzen Sie dann die Mäuse in die Bildgebungskammer ein. Öffnen Sie die In-vivo-Bildgebungssystemsoftware und initialisieren Sie das System.

Fügen Sie ein Häkchen neben Lumineszierend hinzu, und vergewissern Sie sich, dass der Anregungsfilter auf Blockieren und der Emissionsfilter auf Öffnen eingestellt ist. Wählen Sie für den Lumineszenz-Bildgebungsmodus eine Belichtungszeit von fünf Minuten, ein Binning von acht und eine Blende von eins. Wählen Sie für den Foto-Imaging-Modus ein Binning von vier und eine Blende von acht.

Wählen Sie im Menü Sichtfeld das Sichtfeld D mit einer Fläche von 19 x 19 Zentimetern und einer Motivhöhe von 1,5 Zentimetern aus. Wenn alle Parameter eingestellt sind, klicken Sie auf Erfassen, um ein Bild der Tiere zu erstellen. Sobald das Bild aufgenommen wurde, bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück und werden bis zur vollständigen Genesung überwacht.

Um Photonen zu quantifizieren, die von bestimmten Interessenbereichen emittiert werden, öffnen Sie die Software des Bildgebungssystems und wählen Sie das Werkzeug für den Interessenbereich aus. Wählen Sie im Menü "Typ" die Option "Messbereich von Interesse" aus und verwenden Sie das Quadratwerkzeug, um einen quadratischen Interessenbereich um den Brustkorb eines Tieres zu zeichnen. Kopieren Sie diesen Interessenbereich, fügen Sie ihn in jedes der anderen Tiere ein, um Interessenbereiche mit denselben Dimensionen zu generieren, und klicken Sie auf Interessenbereich messen, um die Gesamtintensität aller Interessenbereiche zu messen.

Klicken Sie dann auf Exportieren und wählen Sie den Ordner aus, in dem die Messdaten der Interessenbereiche gespeichert werden sollen. Verbinden Sie die Fünf-Milliliter-Spritzen mindestens sieben Tage nach der In-vivo-Genabgabe mit einer Feder, einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze und einem Einwegmessgerät mit einem Drei-Wege-Stopphahn. Verbinden Sie ein Stück PE 190 Mikro-Medizinschlauch mit dem Einwegmessgerät und mit der Stiftwachnadel

Füllen Sie die Fünf-Milliliter-Spritze mit 800 Mikrolitern Luft. Drehen Sie den Absperrhahn und ziehen Sie den Überstand im Röhrchen auf, indem Sie die 100-Mikroliter-Spritze füllen, und setzen Sie dann die betäubte Versuchsmaus in die Plexiglas-Intubationsplattform ein und sichern Sie das Tier an seinen Schneidezähnen. Schalten Sie das Laryngoskop mit der nicht-dominanten Hand ein und hebeln Sie mit der stumpfen Pinzette in der anderen Hand und der Spitze des Laryngoskops den Mund vorsichtig auf.

Ziehen Sie die Zunge mit der Pinzette zur Seite und führen Sie die Laryngoskopklinge in Richtung Mundrücken. Drücken Sie das Laryngoskop ganz sanft in einem 90-Grad-Winkel nach unten, bis die Öffnung der Luftröhre sichtbar ist. Führen Sie mit der anderen Hand den mit dem Ende des PE-Schlauchs verbundenen Einführschlauch in die Luftröhre ein und drehen Sie das Dreiwegeventil, um das Inokulum von Pseudomonas aeruginosa abzugeben, und entfernen Sie den Schlauch schnell, sobald das gesamte Inokulum abgegeben wurde.

Halten Sie die Maus einige Sekunden lang aufrecht, damit das Inokulum in die Lunge eingeatmet werden kann. Schließlich injizieren Sie den geimpften Tieren intraperitoneal 150 Milligramm pro Kilogramm D-Luciferin und bilden die Lunge vier, 24 und 48 Stunden nach der intratrachealen Stimulationsinstallation im In-vivo-Bildgebungssystem ab, gefolgt von der Photonenquantifizierung, wie gerade gezeigt. Hier wurde biolumineszierende Bildgebung für die Echtzeit-In-vivo-Überwachung von Lungenentzündungen in bovinen Interleukin-8-Luziferase-transienten transgenen BALB/c-Mäusen verwendet, die mit konzentrierten bakteriellen Überständen konfrontiert waren, die sezernierte Virulenzfaktoren enthielten, wie gerade gezeigt wurde.

Die induzierte Entzündungsreaktion wurde bereits 2,5 Stunden nach der Installation als Anstieg des Biolumineszenzsignals festgestellt, wobei die Photonenemission zwischen fünf und 24 Stunden ihren Höhepunkt erreichte und bis mindestens 48 Stunden nach der Stimulation nachweisbar blieb. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die bronchoalveoläre Lavage durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Anzahl und Art der Immunzellen zu beantworten, die während der Behandlung gebildet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lungenentzündungen bei Mäusen einsetzt und sie in vivo mit Hilfe von Biolumineszenz-Bildgebung überwacht.