Name: Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie Biolumineszenz-Bildgebung Neuroinflammation in einem Parkinson-Mausmodell nach peripherer Alpha-Synuclein-Injektion quantifiziert. Diese nichtinvasive Methode ermöglicht frühe Diagnose neurologischer Erkrankungen.

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Die Autoren danken Olga Sharma, Theresa Hundt, und die Mitarbeiter der DZNE-Mikroskopie und Tieranlagen für den technischen Support.

Alle Verfahren einschließlich der Tiere wurden mit Genehmigung des Tierschutzausschusses des Landes Nordrhein-Westfalen Landesumweltamt (LANUV) durchgeführt. Die Tiere wurden untergebracht und gepflegt nach Standardbedingungen mit einem 12 h Hell / Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser. 1. Tiermodell <ol><li> Einander kreuzen hemizygot Tg (GFAP -Luc +/-) -Mäusen mit hemizygot Tg (M83 +/-) -Mäusen hemizygot bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) zu erzeugen Mäuse 15, 16. </li><li> Genotypisierung der Nachkommenschaft mit Echtzeit - PCR auf die Anwesenheit des Transgens , kodierend menschliches alpha-Synuclein und mit Standard - PCR für Firefly - Luciferase 12, 17. </li><li> Impfen die Tiere im Alter von sechs bis acht Wochen. </li></ol> 2. Inokulumherstellung <ol><li> bereiten Sie monomeric rekombinantes humaner alpha-Synuclein mit der A53T - Mutation in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) -Puffer , enthaltend 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) , wie zuvor beschrieben 14 gewesen ist. </li><li> Bereiten fibrillären alpha-Synuclein für Inokulationen durch Rühren 3 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l rekombinantes humanes monomeres alpha-Synuclein in einem Orbitalschüttler bei 800 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C für 5 Tage. </li><li> Verdünnte Fibrille Baugruppen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l für die intraperitoneale oder 2 &amp; mgr; g / &amp; mgr; L für intraglossal Inokulationen zu erreichen. </li><li> Fragment, das die alpha-Synuclein-Fibrillen mit einer Beschallungsvorrichtung Stange für 1 min (40 Pulse von 0,5 s Dauer mit einer Pause von einer Sekunde zwischen jedem Impulse und einer Amplitude auf 50%) auf Eis. Um eine Kontamination durch Kreuz Aussaat zu vermeiden. Verwenden Sie saubere Beschallungssonden unterschiedliche Inokulum herzustellen. </li></ol> 3. Intraglossal Injections <ol><li> Anesthetize Tiere mit einer intraperitoneal Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin. Drücken Sie den Zeh des Tieres und bestätigen, dass es nicht seine hindlimb nicht entziehen richtige Anästhesie zu gewährleisten. Verwenden Sie vet Salbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während der Narkose. </li><li> Fix narkotisierten Tiere vorsichtig mit Klebeband auf eine Heizplatte in einer dorsalen liegenden Position mit ihren Köpfen gegenüber dem Untersucher zugewandten. </li><li> Füllen Sie eine 27 G Einweginjektionsspritze mit 5 ul von beschallten alpha-Synuclein-Fibrillen oder PBS. </li><li> Verwenden Sie eine stumpfnasige Pinzette mit geriffelten Spitzen des Tieres Mund geöffnet zu halten, und eine zweiten kleinere Pinzette vorsichtig herausziehen, die Zunge an der Unterseite der Zunge zugänglich für die Injektion zu machen. </li><li> Injizieren, um die Nadel der Spritze in die rechte oder untere Seite der Zunge in der Nähe des Hypoglossus gelassen. injizieren Sie langsam die Inokulum nach 5 s. einfahren die Nadel langsam nach 5 s, dass der Impfstoff, um sicherzustellen,das Gewebe eingedrungen ist und nicht verloren geht, während die Nadel zurückgezogen wird. </li><li> Lassen Sie das Tier von seinen Fixierungen und lassen Sie es auf der Heizplatte unter ständiger Überwachung bis zum vollständigen Genesung. </li></ol> 4. intraperitonealeInjektionen <ol><li> Für intraperitoneale Injektionen, betäubt die Tiere kurz in einem Anästhesieraum durch Inhalation mit Isofluran / Sauerstoff mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 L / min und den Verdampfer auf 2% verwendet wird. Drücken Sie den Zeh des Tieres und bestätigen, dass es nicht seine hindlimb nicht entziehen richtige Anästhesie zu gewährleisten. </li><li> Füllen Sie eine 27 G Einweginjektionsspritze mit 50 ul von beschallten alpha-Synuclein-Fibrillen oder PBS. </li><li> Direkt in das Peritoneum der Maus injizieren und vermeiden den Dünndarm oder Blinddarm hinter der Bauchwand durchdringt, indem das Tier in einer dorsalen Position mit dem Kopfhalt vom Prüfer und nach unten bei etwa 45 ° abgekehrten. Überwachen Tiere, bis sie gewonnen habenaus der Narkose. </li></ol> 5. Biolumineszenz-Bildgebung <ol><li> Bild Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen alle 2-4 Wochen ein Biolumineszenz - Bilderzeugungssystem verwendet wird . </li><li> Kurz vor der Bebilderung anästhesieren Mäuse in einer Isofluran / Sauerstoff-Kammer mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min und dem Verdampfer auf 2% eingestellt. Drücken Sie den Zeh des Tieres und bestätigen, dass es nicht seine hindlimb nicht entziehen richtige Anästhesie zu gewährleisten. </li><li> Shave und enthaart die Köpfe der Mäuse mit einer Enthaarungscreme. Färben Sie die Ohren in schwarz mit einem nicht reizend Marker unspezifisch Biolumineszenz zu blockieren. </li><li> Verdünnte D-Luciferin-Kaliumsalz, um das Substrat der Luciferase, in PBS auf 30 mg / ml Stammlösung. Speicher dieses in 1 ml Aliquots bei -20 ° C. Schützen die gelöste D-Luciferin aus der Exposition gegenüber Licht. </li><li> Wiegen Sie die Tiere vor der Injektion. Berechnen das genaue Volumen von D-Luciferin zur Injektion von 150 mg / kg Körpergewicht. Intraperitoneal D injizieren-luciferin und das Tier auf die Anästhesie Kammer zurück. </li><li> Starten Sie die Imaging-Software. Nachdem das Abbildungssystem seine Betriebstemperatur initialisiert das System durch Klicken auf den ‚Initialize‘ -Taste auf dem Bedienfeld erreicht hat. </li><li> Wählen Sie die ‚Lumineszente‘ Tasten und ‚Fotografie‘. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 60 s, den Binning ‚Medium‘, das F / Stop auf ‚1‘, und der EM-Verstärkung auf ‚Aus‘. </li><li> Bestätigen, dass das Anregungsfilter wird auf ‚Block‘ und den Emissionsfilter auf ‚Öffnen‘ und stellen den Gegenstand Höhe bis 1,50 cm. </li><li> Zehn Minuten nach der Injektion mit D-Luciferin, legen die Tiere auf die Heizplatte in der Abbildungskammer und sicherstellen, dass ihre Mündungen richtig in der Anästhesie Auslass angeordnet. Schließen Sie die Isofluran / Sauerstoff-Strömung von der Inhalationskammer öffnen und die Strömung für die Abbildungskammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,25 l / min und einer Verdampfung von 2%. Schließen der Tür der Abbildungskammer properly. </li><li> Klicken Sie auf das ‚Acquire‘, um die Biolumineszenz zu messen, die 60 s dauert. Stoppen Sie die Isofluran-Flow und überwachen die Tiere, bis sie vollständig nach ihnen Rückkehr in ihre Käfige zurück erholt haben. </li><li> Verwenden der Abbildungssoftware auf die Biolumineszenz zu quantifizieren. Innerhalb der ‚Werkzeugpalette‘ die Option ‚ROI Tool‘. Unter ‚Typ‘ innerhalb der ‚ROI Tools‘ wählen ‚Mess ROI‘. </li><li> Innerhalb der ROI Tool &#39;klicken Sie auf das „Kreis“ Werkzeug und wählen Sie die Anzahl der ROIs aus dem Pull-Down-Menü zu ziehen - im Idealfall ‚3‘ für drei Mäuse. </li><li> Im Bild der rechte Maustaste jeder ROI und unter ‚Eigenschaften‘ die Breite und Höhe bis 1,25 cm einzustellen. Positionieren Sie jeden ROI über den Bereich des Gehirns, die quantifiziert. </li><li> In der oberen linken Ecke des Bildes, stellte die Einheiten Blech an Strahlung (Photonen) &#39;. </li><li> Innerhalb der ‚Werkzeugpalette‘ die Option ‚Bildeinstellungen‘ und das Minimum einstellen unddas Maximum der ‚Farbskala‘, zum Beispiel von 0.20e6 zu 1.00E6. </li><li> Unter ‚Datei‘ die Daten mit ‚Speichern‘ speichern. </li></ol> 6. Biochemische Analyse <ol><li> Isoliert das Gehirn und Rückenmark nach etablierten Protokollen 18, 19. </li><li> Homogenisiert gesamtes Gehirn und Rückenmark ganze Proben separat in PBS in Gegenwart von Protease und Phosphatase-Inhibitoren (verdünnt in PBS auf 1x) in zwei 30-s-Zyklen in einem Gewebe-Homogenisator mit 6000 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn und Rückenmark-Proben bis zu einer Endkonzentration von 20% homogenisiert werden (wt / vol). </li><li> Beschallen die Proben zweimal, während sie auf Eis mit einem konstanten Puls von 10 s und einer Amplitude auf 50% zu halten. </li><li> Paßt die Homogenate zu 10% in PBS und 750 mM NaCl verdünnt, indem sie 1: 1 mit 1,5 M NaCl in PBS. </li><li> Um die Zelltrümmer abzutrennen Zentrifugation der Homogenate bei 1.000 xg für 5 min bei4 ° C. Halten Sie die Überstände für die nächsten Schritte und verwerfen die Pellets. </li><li> Messung der Proteinkonzentration in den Homogenaten die Bicinchoninsäure (BCA) -Assay unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren 1,0 mg des Gesamtproteins von Hirnhomogenaten oder 0,8 mg von Rückenmark-Homogenaten in N-laurylsarcosyl bei einer Endkonzentration von 10% (wt / vol) für 15 Minuten auf Eis. </li><li> Überlagern die Homogenate auf eine 3 ml-Saccharose-Kissen von 10% (wt / vol) in destilliertem Wasser und Ultrazentrifuge bei 465,000 x g sie für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren des Pellets in einem Puffer, enthaltend 4% Natriumdodecylsulfat (SDS), 2% β-Mercaptoethanol, 192 mM Glycin, 25 mM Tris und 5% (wt / Vol) Saccharose. </li><li> Kocht die Proben bei 100 ° C für 5 min und laden sie auf SDS-Polyacrylamid-Gele für die Elektrophorese in einem Morpholinethansulfonsäure (MES) Puffer-System. </li><li> Übertragen der abgetrennten Proteine ​​auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) -Membranen in einer semiDry System Blotting. </li><li> Inkubieren der Membranen in 0,4% (vol / vol) Formalin-Lösung in PBS für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Rotor, der mit 35 Umdrehungen pro Minute zu vernetzen, die Proteine ​​mit der Membran. </li><li> Blockieren die Membranen in TBS-Puffer, enthaltend 0,05% (vol / vol) Tween 20 und 5% (wt / vol) Milch für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubiere die Blots mit dem primären Antikörper in Puffer über Nacht bei 4 ° C blockiert. </li><li> Waschen Sie die Membranen dreimal in TBS-Puffer und Inkubation mit Peroxidase oder sie Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern in TBS für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Visualisieren des gebundenen sekundären Antikörper durch Chemilumineszenz oder Fluoreszenz nach etablierten Protokollen 20. </li></ol> 7. Immunofluoreszenzanalyse <ol><li> Entwässern das sezierten Gehirn und Rückenmark in einer Gewebebearbeitungsstation und betten sie in Paraffin eine Paraffinstation. </li><li> Schneiden Sie das Paraffin eingebettete tisklagt mit einem Mikrotom in 8 &amp; mgr; m dicke koronale Schnitte und die Abschnitte auf Glasobjektträger montieren. </li><li> Entparaffinieren Gewebeabschnitte , indem sie in zwei separate Bäder Xylol für 5 bis 10 min und rehydratisieren sie durch eine Reihe von abgestuften Ethanolbäder (100%, 90%, 70%, 50%) und schließlich mit H 2 O. Inkubieren </li><li> Inkubieren der Schnitte in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) für 5 min bei Raumtemperatur und sie zusätzlich für 10 min in einem Mikrowellenofen sieden. </li><li> Lassen Sie die Abschnitte abkühlen auf Raumtemperatur und Inkubation sie mit einer 3% igen Wasserstoffperoxid-Lösung für 30 min endogene Peroxidasen zu hemmen. </li><li> Blockieren die Gewebeschnitte durch Inkubation mit 20% (vol / vol) normalem Ziegenserum, 1% (vol / vol) Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Triton X-100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubiere die Abschnitte mit dem primären Antikörper, verdünnt in 1% (vol / vol) normalem Ziegenserum, 1% (Vol / Vol) BSA und 0,25% Triton X-100 in PBS über Nacht bei 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Waschen Sie die Abschnitte zweimal mit 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS und einmal mit PBS. </li><li> Beflecken die Abschnitte mit den entsprechenden Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern und dem DAPI Kern Farbstoff verdünnt in 1% (vol / vol) normalem Ziegenserum, 1% (Vol / Vol) BSA und PBS für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> zweimal mit 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS und einmal mit PBS, das Deckglas die Objektträger mit Einbettungsmitteln und visualisieren die Färbung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Waschen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Periphere Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in das Peritoneum von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen stellt ein einfaches Verfahren durch Neuroinflammation begleitet neurologische Krankheit zu induzieren wichtige Eigenschaften von Synucleinopathien rekapitulieren. In ähnlicher Weise stellt Zunge Injektion eine andere Route für die Neuroinvasion von alpha-Synuclein prionoids in transgenen Mäusen ist aber weniger effizient. Wir entschieden uns für unsere Experimente bei 420 Tagen na...

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass alpha-Synuclein-Eigenschaften hat, die die des Prion-Protein ähnlich sind, insbesondere in ihrer Fähigkeit zur Selbst Saatgut- und propagiert misfolding zwischen Zellen und Nervenbahnen entlang. Diese Eigenschaft von alpha-Synuclein wird auch als ‚Prion-like‘ oder ‚prionoid‘ genannt, und wird durch Beobachtungen in den Transplantationsexperimenten unterstützt, die die Übertragbarkeit von misfolded alpha-Synuclein von erkrankten Neuronen vorschlagen 1 gesund Neuronen neu transplantierte, 2 , 3, 4. Auch die direkte Injektion von falsch gefalteten alpha-Synuclein in das Gehirn oder den Umfang, beispielsweise die hinteren Gliedmaßen Muskel oder Darmwand, führt zu einer Ausbreitung von alpha-Synuclein Pathologie distale Teile des ZNS , 5, 6, 7, &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Wir analysierten die Übertragung von alpha-Synuclein prionoids über periphere Routen im Detail und mit der Frage, ob misfolded alpha-Synuclein kann das ZNS nach einer einzigen intraglossal oder intraperitoneale Injektion neuroinvade, eine Funktion, die für Prionen hatte zuvor gezeigt worden, nicht aber für falsch gefaltete alpha- Synuclein. Nach der Injektion von Prionen in die Zunge, Neuroinvasion des ZNS ist über Ausbreitung entlang des Hypoglossus der Zunge erreicht , die an den Kern des Hypoglossus führt, die im Hirnstamm 11 befindet. Als Maus - Modell wählten wir Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen, die die A53T Mutante von menschlichem alpha-Synuclein des Prion Promotor überexprimieren und Firefly unter der Kontrolle eines Promotors GFAP Luciferase durch astrozytischen Aktivierung zu überwachen , Biolumineszenz, wie zuvor im Gehirn gezeigt vonPrion-infizierten Mäusen 12. In unseren Händen bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) entwickelten Mäuse bis zum 23. Lebensmonat nicht Krankheit wie von anderen 13 gezeigt. Eine einzige Injektion von humanen alpha-Synuclein - Fibrillen über die intraglossal oder intraperitonealem Weg induzierte neurologische Erkrankung mit Pathologie im Gehirn und Rückenmark von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen die Hypothese stützt , dass alpha-Synuclein prionoids teilen wichtige Eigenschaften mit Prionen 14.

<table><tbody><tr><td>Anti-Aktin-Antikörper</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Synuclein, Phospho S129 Antikörper [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Synuclein, Phospho S129 Antikörper [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP Antikörper</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IBA-1 Antikörper</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sequestosom-1 (p62)-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin-Antikörper [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>27 G Spritze</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline Labormarker&nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Kaliumsalz</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 mg/mL Stammlösung</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 Ultraschallgerät</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II Bildgebungssystem</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(M83+/-) Mäuse oder B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten mit Standardmuster</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten mit schmalem Muster</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110 Rotor&nbsp;</td></tr><tr><td>Dickwandige Polycarbonat-Tuben</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjugierter Antikörper</td><td>Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 konjugierter Antikörper&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Stella 3200 Bildgebungssystem</td><td>Raytest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrarot-Bildgebungssystem</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF-Membran</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>Arbeitslösung 3%</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Arbeitsverdünnung 1:50.000</td></tr><tr><td>Fluormount-Medien</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease- und Phosphatase-Inhibitoren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>Precellys 24-Dual Homogenisator&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 konjugierter Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 konjugierter Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; BCA&nbsp; Eiweiß&nbsp; Analyse&nbsp; Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biolumineszenz-bildgebung von neuroinflammation in transgenen mäusen nach peripherer inokulation von alpha-synuclein

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Um das Prion-ähnliches Verhalten von falsch gefalteten alpha-Synuclein, Mausmodelle zu studieren benötigt werden, mit denen eine schnelle und einfache Übertragung von alpha-Synuclein prionoids, die Neuropathologie im Zentralnervensystem (ZNS) führen. Hier beschreiben wir das intraglossal oder intraperitoneale Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, die humanen alpha-Synuclein mit der A53T - Mutation aus dem Prionprotein - Promotor überexprimieren und Glühwürmchen - Luciferase aus der Promotor für gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), ist ausreichend , um neuropathologische Erkrankung zu induzieren. Im Vergleich zu homozygot Tg (M83 + / +) Mäusen , die Anfang schwere neurologische Symptome im Alter von 8 Monaten, heterozygot Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) entwickeln Tiere bleiben frei von spontaner Krankheit , bis sie ein erreichen Alter von 22 Monaten. Interessanterweise ist die Injektion von alpha-Synuclein-Fibrillen über die intraperitoneMäuse , die mit einer medianen Inkubationszeit von 229 ± 17 Tagen: al Route neurologische Erkrankung mit Paralyse in vier von fünf Tg (GFAP -Luc +/- +/- M83) induziert. Erkrankte Tiere zeigten schwere Ablagerungen von phosphoryliertem alpha-Synuclein in ihrem Gehirn und Rückenmark. Anhäufungen von alpha-Synuclein waren Sarkosyl-unlösliche und mit Ubiquitin und p62 colokalisiert, und wurden durch eine Entzündungsreaktion begleitet, was zu astrozytären Gliose und Mikrogliose. Überraschenderweise Inokulation von alpha-Synuclein-Fibrillen in die Zunge war weniger wirksam bei der Entstehung von Krankheiten mit nur einer der fünf injizierten Tieren alpha-Synuclein Pathologie nach 285 Tagen zeigen. Unsere Ergebnisse zeigen , dass die Impfung über die intraglossal Strecke und um so mehr über die intraperitoneale Route geeignet ist neurologische Erkrankung mit entsprechenden Kennzeichen Synucleinopathien in Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) zu induzieren Mäuse. Dies stellt ein neues Modell für die Untersuchung Prion-ähnliche Pathogenese induziertD durch alpha-Synuclein prionoids näher.

Periphere Injektion von alpha-Synuclein prionoids über die Zunge oder das Peritoneum induzierte Neuropathologie im ZNS von bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) -Mäusen (Tabelle 1 und Abbildung 1). Nach einer einzigen intraperitoneale Injektion mit alpha-Synuclein-Fibrillen, vier von fünf Mäusen entwickelten neurologische Erkrankung mit einer mittleren Inkubationszeit von 229 ± 17 Tagen. Überraschenderweise nur einer von fünf...

Periphere Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in das Peritoneum oder die Zunge von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, der humanen alpha-Synuclein mit der familial A53T - Mutation exprimieren und Glühwürmchen - Luciferase kann Neuropathologie, einschließlich neuroinflammation induziert in ihrem Zentralnervensystem.

Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Das übergeordnete Ziel dieser Biolumineszenz-Bildgebungsmethode besteht darin, die Neuroinflammation im zentralen Nervensystem eines Mausmodells für Parkinson-Krankheit nach peripherer Injektion von Alpha-Synuclein-Fibrillen zu quantifizieren. Diese Methode kann dabei helfen, Zeitpunkt und Ausmaß der Neuroinflammation in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Neuroinflammation, bis hin zur Entwicklung neurologischer Erkrankungen bei einzelnen Mäusen, nichtinvasiv und wiederholt überwacht werden kann.Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Diagnose neurologischer Erkrankungen bereits in der 10. Stunde, da eine Zunahme der Biolumineszenz aufgrund von Nervenentzündung nicht nur begleitend auftritt, sondern oft der neurologischen Erkrankung vorausgeht. Beginnen Sie damit, das Tier für die Operation ordnungsgemäß zu anästhesieren. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch und bestätigen Sie, dass das Tier die Extremität nicht zurückzieht, um einen chirurgischen Anästhesietiefezustand anzuzeigen.Tragen Sie Augensalbe auf, um Austrocknung während der Anästhesie zu verhindern. Befestigen Sie das Tier vorsichtig mit Klebeband in Rückenlage auf einer Heizplatte, wobei der Kopf zum Untersucher weist. Danach füllen Sie eine Einweg-Hypodermikanspritze mit 27 Gauge mit fünf Mikrolitern sonifizierter Alpha-Synuclein-Fibrillen. Verwenden Sie anschließend eine stumpfe Pinzette mit abgerundeten Spitzen, um den Mund des Tieres geöffnet zu halten, und ziehen Sie mit der kleineren Pinzette vorsichtig die Zunge heraus, um die Unterseite der Zunge für die Injektion zugänglich zu machen. Führen Sie die Nadel der Spritze in die rechte oder linke Unterseite der Zunge in der Nähe des Nervus hypoglossus ein. Injizieren Sie nach fünf Sekunden langsam das Inokulum.Lassen Sie die Nadel weitere fünf Sekunden lang an Ort und Stelle, um sicherzustellen, dass das Inokulum in das Gewebe eindringt, und ziehen Sie die Nadel anschließend vorsichtig zurück. Nach der Injektion lassen Sie das Tier frei und lassen es unter ständiger Überwachung vollständig auf der Heizplatte ausklingen. Bei intraperitonealen Injektionen betäuben Sie die Tiere kurzzeitig in einer Narkosekammer mit Isofluran.Erneut den Zeh des Tieres zwicken und überprüfen, ob es die Hinterextremität nicht zurückzieht, um eine ausreichende Anästhesie sicherzustellen. Eine Einweg-Spritzenspritze mit 27 Gauge mit 50 Mikroliter sonifizierten alpha-Synuclein-Fibrillen oder PBS füllen. Das Tier in dorsaler Lage halten, wobei der Kopf vom Untersucher weg und etwa 45 Grad nach unten gerichtet ist.Spritzen Sie direkt in das Peritoneum der Maus, ohne den hinter der Bauchdecke liegenden Dünndarm oder das Z盲ndarm zu verletzen. 脺berwachen Sie die Tiere, bis sie sich von der An盲sthesie erholt haben. Vor der Bildgebung rasieren und enthaaren Sie die K枚pfe der mit Isofluran an盲sthesierten M盲use.Färben Sie die Ohren mit einem nicht reizenden Stift schwarz ein, um unspezifische Biolumineszenz zu blockieren. Wiegen Sie die Tiere vor der Injektion. Berechnen Sie anschließend das genaue Injektionsvolumen von D-Luciferin mit 150 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht.Spritzen Sie das berechnete Volumen von D-Luciferin intraperitoneal ein und bringen Sie jedes Tier anschließend in die Narkosekammer zurück. Starten Sie die Bildgebungssoftware. Nachdem das Bildgebungssystem seine Betriebstemperatur erreicht hat, initialisieren Sie das System, indem Sie im Bedienfeld auf die Schaltfläche „Initialize“ klicken.Danach die Tasten Lumineszenz und Fotografie auswählen. Die Belichtungszeit auf 60 Sekunden, das Binning auf mittel, die Blende auf eins und die EM-Verstärkung auf aus stellen. Block auswählen und dann Öffnen.Wählen Sie anschließend im Reiter „Körpergröße“ den Wert 1,50 aus dem Dropdown-Menü aus. Zehn Minuten nach der Injektion mit D-Luciferin bringen Sie die Tiere auf die Heizplatte in der Bildgebungskammer und stellen sicher, dass ihre Muskulatur korrekt in der Anästhesie-Auslassöffnung positioniert ist. Schalten Sie den Isofluran-Fluss von der Inhalationskammer auf die Bildgebungskammer um und schließen Sie die Tür der Bildgebungskammer ordnungsgemäß.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Erfassen“, um die Biolumineszenz zu messen, was 60 Sekunden dauert. Stoppen Sie den Isofluranfluss und bringen Sie die Tiere anschließend in ihre Käfige zurück. Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um die Biolumineszenz zu quantifizieren, indem Sie das Werkzeugpalettenmenü öffnen und „ROI-Tools“ auswählen.Wählen Sie unter Typ „Measurement ROI“. Klicken Sie innerhalb von ROI-Tools auf das Kreis-Tool und wählen Sie die Anzahl der zu zeichnenden ROIs aus dem Dropdown-Menü aus. Idealweise drei für drei Mäuse.Klicken Sie im Bild mit der rechten Maustaste auf jedes ROI und passen Sie unter Eigenschaften Breite und Höhe auf 1,25 Zentimeter an. Positionieren Sie jedes ROI über dem zu quantifizierenden Gehirnbereich. Stellen Sie im oberen linken Bereich des Bildes das Einheitenfeld auf Strahlungsleistung in Photonen ein.Öffnen Sie dann das Werkzeugpalettenmenü. Wählen Sie „Bildanpassung“ und passen Sie das Minimum und das Maximum der Farbskala an. Zum Beispiel von 200.000 auf eine Million.Zuletzt unter Datei auf Speichern klicken, um die Daten zu sichern. Wie hier gezeigt, entwickelten vier der fünf transgenen A53T-Synuclein-GFAP-Luciferase-Reporter-Mäuse nach intraperitonealer Injektion mit Alpha-Synuclein-Fibrillen innerhalb von 229 Tagen eine neurologische Erkrankung, wie durch die violetten Quadrate angegeben. Dagegen entwickelte nur eines von fünf nach intraglossaler Injektion behandelten Mäusen innerhalb von 285 Tagen eine neurologische Erkrankung, wie durch die grünen Kreise angegeben.Mittels Biolumineszenz-Bildgebung zeigte sich, dass die transgenen Mäuse kurz vor dem Auftreten neurologischer Erkrankungszeichen erhöhte Biolumineszenz aus Gehirn und Rückenmark aussandten. Diese Biolumineszenz war nach intraperitonealer Injektion stärker ausgeprägt und blieb nach Injektion von PBS aus, was auf einen Mangel an astrogliöser Gliose hindeutet. Diese Abbildung zeigt die Biolumineszenz in den Gehirnen transgener Mäuse im Zeitverlauf nach intraperitonealer Injektion von Alpha-Synuclein-Fibrillen.Wie durch die blauen, grünen, braunen und orangefarbenen Kreise dargestellt. Bei mehreren Tieren wurden einige Wochen, bevor die vier einzelnen Mäuse neurologische Anzeichen der Erkrankung zeigten, erhöhte Biolumineszenzniveaus über einer Schwelle von 2 Millionen Photonen pro Sekunde pro Quadratzentimeter pro Steradiant beobachtet. Eines von fünf Tieren zeigte zudem kurz vor seinem Tod 285 Tage nach intraglossaler Injektion mit Alpha-Synuclein-Fibrillen erhöhte Biolumineszenzniveaus.Im Gegensatz dazu blieb das Biolumineszenzsignal bei gesunden Kontrollmäusen, die mit PBS injiziert wurden, sowie bei einem Tier, das nach intraperitonealer Injektion keine Erkrankung entwickelte, in den mit roten Kreisen markierten Bereichen für Alpha-Synuclein-Fibrillen während des Beobachtungszeitraums unterhalb der Schwelle. Die Immunfluoreszenz-Färbung von Gehirnschnitten erkrankter Tiere mit Antikörpern gegen GFAP und Iba1 bestätigte eine Neuroinflammation mit Mikrogliazellaktivierung und reaktiven Astrozyten in Regionen mit Alpha-Synuclein-Ablagerungen. Gesunde Tiere, die keine Ablagerungen von Alpha-Synuclein anreicherten, zeigten eine schwache Färbung für GFAP und Iba1.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Neurodegeneration, die Neuroinflammation im zentralen Nervensystem von Mäusen nichtinvasiv zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse peripher mit Alpha-Synuclein-Fibrillen injiziert und wie man eine Biolumineszenz-Bildgebung durchführt, um die Neuroinflammation im ZNS zu überwachen.Das übergeordnete Ziel des Verfahrens besteht darin, eine neurologische Erkrankung peripher durch intraglossale oder intraperitoneale Injektion von Alpha-Synuclein-Fibrillen auszulösen und die Induktion einer Neuroinflammation zeitlich begleitend nichtinvasiv abzubilden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Erfahren Sie, wie Biolumineszenz-Bildgebung Neuroinflammation in einem Parkinson-Mausmodell nach peripherer Alpha-Synuclein-Injektion quantifiziert. Diese nichtinvasive Methode ermöglicht frühe Diagnose neurologischer Erkrankungen.

Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein

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