Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen oder Substrate zu strukturieren, indem sie mit einfachen Tischwerkzeugen, die in den meisten biologischen Labors verfügbar sind, in komplexe lange und geschlossene Mikrokanäle verteilt werden. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Biologie in Bezug auf Zell-zu-Zell- und Zell-Protein-Wechselwirkungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach durchzuführen ist und nur Werkzeuge erfordert, die in den meisten biologischen Labors leicht verfügbar sind.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie eine Optimierung der Inkubationsbedingungen für die vom Forscher ausgewählten Zellen und Substrate erfordert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die richtige Platzierung des PDMS-Stempels und der Lösung die Reproduzierbarkeit des Experiments erheblich verbessert. Beginnen Sie damit, das Layout des Mikrokanals mit einem CAD-Zeichenwerkzeug zu zeichnen.

Drucken Sie dann die Zeichnung auf weißes Papier aus. Verwenden Sie als Nächstes Isopropanol, um einen Objektträger zu reinigen, der groß genug ist, um das Design aufzunehmen. Und dann den Schlitten mit einer Luftpistole trocknen.

Befestigen Sie das Klebeband an der gereinigten Glasschiene und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Kleben Sie dann die Seiten des Glasschiebers auf das Papier mit dem Motiv, so dass die Klebebandseite nach oben zeigt. Schneide das Klebeband auf dem Objektträger mit einem Skalpell ab und verwende dabei das Papierdesign als Referenz.

Ziehen Sie nach dem Schneiden das Klebeband von den unerwünschten Bereichen des Objektträgers ab. Spülen Sie anschließend den Objektträger mit Isopropanol ab, um Klebstoffreste zu entfernen. Verwenden Sie dann eine Luftpistole, um die Oberfläche zu trocknen.

Nach dem Muster und der Reinigung den Objektträger im Ofen bei 65 Grad Celsius 30 Minuten backen. Rollen Sie dann vorsichtig mit einer Gummirolle über das Klebeband, um Luftblasen zu entfernen, und lassen Sie die Folie in einer Petrischale auf Raumtemperatur abkühlen. Mischen Sie zunächst 10 Teile eines PDMS-Elastomers mit 1 Teil seines Härters und rühren Sie die Mischung kräftig um.

Geben Sie dann das Gemisch in eine Vakuumkammer, um das Gemisch zu entgasen, bis keine Luftblasen mehr übrig sind. Gießen Sie eine 2 mm dicke Schicht der Mischung auf die Klebebandform und entgasen Sie die Form, bis alle Luftblasen verschwunden sind. Schneiden Sie nach dem Abkühlen die PDMS-Schicht mit einem Skalpell mindestens 5 mm von den Merkmalen entfernt ab.

Ziehen Sie dann das ausgehärtete PDMS mit einer Pinzette von der Form ab. Stanzen Sie ein einzelnes Einlassloch mit einem 1-mm-Biopsiestanzer, vorzugsweise am Ende eines Netzwerks von Mikrokanälen. Reinigen Sie dann den PDMS-Guss mit Klebeband, um Staubpartikel vom Gerät zu entfernen.

Sterilisieren Sie das PDMS-Mikrokanalgerät, indem Sie es mit einer Lösung aus 70 % Ehtanol, gefolgt von sterilem deionisiertem Wasser, spülen und 30 Minuten lang UV-Licht aussetzen. Platzieren Sie das sterile PDMS mit einer Pinzette auf einem sterilen Glasdeckglas und üben Sie mit der Spitze der Pinzette leichten Druck aus. Geben Sie anschließend ein Tröpfchen Poly-D-Lysin in Natriumtetraboratpuffer auf den Einlass der Mikrokanäle.

Stellen Sie die Petrischale 10 Minuten lang unter Vakuum. Beobachten Sie während dieser Zeit, wie die Luft in Form von Blasen aus dem Kanal austritt. Lassen Sie das Vakuum los und beobachten Sie, wie die Substratlösung in den Mikrokanal fließt. Inkubieren Sie die Schale eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Ziehen Sie dann den PDMS-Stempel vorsichtig mit einer sterilen Pinzette ab und waschen Sie das Muster dreimal mit entionisiertem Wasser. Geben Sie eine 1%ige BSA-Lösung auf den Glasdeckglas, um unspezifische Adhäsion zu reduzieren, und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie die BSA-Lösung.

Um die indirekte Strukturierung von Zellen zu starten, bereiten Sie eine Zellsuspension in serumfreiem Kulturmedium vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die Zellsuspension in die gemusterte Petrischale, wobei der gemusterte Bereich vollständig in die Zellsuspension getaucht wird. Inkubieren Sie dann die Petrischale 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, damit sich die Zellen an das gemusterte Substrat anheften können.

Nach der Inkubation aspirieren Sie die überschüssige Zellsuspension aus der Petrischale und waschen Sie die gemusterten Zellen dreimal mit PBS, während Sie sie zehn Sekunden lang leicht schütteln, um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen. Geben Sie dann das entsprechende Kulturmedium zu den gemusterten Zellkulturen und inkubieren Sie die gemusterten Zellen bei 37 Grad Celsius in einem mit Kohlendioxid gepufferten Inkubator. Für die direkte Strukturierung von Zellen sterilisieren Sie zuerst das mikrofluidische Gerät, indem Sie es mit einer Lösung von 70%igem Ethanol spülen, gefolgt von deionisiertem Wasser.

Weichen Sie das Gerät dann über Nacht in einer Lösung von 1 % BSA ein, um eine unspezifische Zelladhäsion an das PDMS zu verhindern. Trocknen Sie das Gerät bei Raumtemperatur und befestigen Sie es dann an der Unterseite der mit Gewebekulturen behandelten Petrischale. Platzieren Sie 4 bis 8 Mikroliter der Zellsuspension, genug, um die Mikrokanäle zu füllen, auf den Einlass und bedecken Sie das Loch vollständig.

Stellen Sie dann die Petrischale für 10 Minuten in eine Vakuumkammer. Lassen Sie das Vakuum los und beobachten Sie, wie die Zellsuspension in den Mikrokanal fließt. Inkubieren Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius in einem mit Kohlendioxid gepufferten Inkubator für bis zu einer Stunde.

Nehmen Sie dann die Schale aus dem Inkubator und ziehen Sie das PDMS mit einer Pinzette vorsichtig aus der Schale. Waschen Sie das Muster mit PBS und geben Sie dann Zellkulturmedien in die Petrischale. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.

Hier sind embryonale kortikale Neuronen von Ratten zu sehen, die auf Poly-D-Lysin- und Lamininoberflächen gemustert sind. Die Lage der Zellen zeigt eine allgemeine Adhärenz an den gemusterten Bereichen und das Wachstum entlang der PDL- und Lamininstreifen. Hier sind in einer höheren Vergrößerung C2C12-Myoblasten zu sehen.

Dieser Zelltyp haftet ebenfalls an den gemusterten Bereichen und demonstriert die Fusion zu mehrkernigen Myotuben. Diese Technik wurde auch für die direkte Zellmusterung adaptiert, hier mit Fibroblasten. Diese Methode der direkten Zellmusterung hat keinen nachteiligen Einfluss auf das Überleben der Zellen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Proteinlokalisierung oder zur Zell-Substrat-Interaktion zu beantworten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die richtige Platzierung des Zelltröpfchens oder der Substratlösung, um das gesamte Inlay zu bedecken, entscheidend für den Erfolg ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um die Steuerung von Photorezeptoren in der Netzhautbiologie zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen und Substrat mit gasdurchlässigen PDMS-Mikrofluidikgeräten unter Verwendung von Unterdruck strukturiert werden. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.