Name: Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie eine vielseitige Methode zum Patterning von Proteinen und Zellen in Mikrokanälen mittels Niederdruck-Vakuum. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Protein-Interaktionen in der biologischen Forschung.

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Die Finanzierung für diese Forschung von der New Jersey Kommission auf Rückenmarksforschung (NJCSCR) (bis FHK) zur Verfügung gestellt wurde, gewähren CSCR14IRG005 (zu BLF), gewähren NIH R15NS087501 (zu CHC) und der FM Kirby Foundation (ETA).

HINWEIS: Bitte wenden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken (Dunstabzug, Glovebox) und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe), wenn giftige oder Säure / Base-Materialien. 1. Herstellung von Urformen für Soft Lithography mit Lithografie <ol><li> Zeichnen Sie das Layout der Mikrokanal ein Computer-Aided Design (CAD) Zeichenwerkzeug verwenden. </li><li> Drucken Sie das Layout auf einer leeren Maskenplatte mit Lasermaskenschreiber. </li><li> Spülen einen 4 Zoll Silicium-Wafer mit Aceton, gefolgt von Isopropanol und trockenem Stickstoff mit einem Luftgebläse, um sicherzustellen, daß kein Lösungsmittel auf dem Wafer verbleibt. </li><li> Dehydratisieren des Wafers, indem es auf einer Heizplatte bei 200 ° C für 5 min Einbrennen. </li><li> Wählen eines negativen Photoresist für die gewünschte Höhe der Mikrokanäle gestaltet. Foder verwenden beispielsweise negativer Photoresist SU-8 50 Mikro von 50 &amp; mgr; m mit einer Höhe zu erhalten. </li><li> Erlauben der Wafer auf Raumtemperatur abkühlen, und dann Ausrichten der Wafer auf dem Spannfutter einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung. </li><li> Dispense 4 ml (1 ml / inch Durchmesser des Wafers) negativer Photoresist auf die Mitte des Wafers. </li><li> Schleuderbeschichten des Wafers mit einem zweistufigen Schleudergang unter Verwendung eines Spinners. Zuerst wird ein Spread-Zyklus von 500 UpM mit einer Beschleunigung von 100 Upm / s für 10 s anwenden. Danach ist eine Schleuderzyklus von 2000 UpM mit einer Beschleunigung von 300 Upm / s 2 30 s 50 &amp; mgr; m Beschichtung aus Photoresist auf einem Wafer zu erhalten. </li><li> Soft bake der Wafer in zwei Schritten auf einer heißen Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für eine 50 &amp; mgr; m Beschichtung aus Photoresist, erste Pre-Bake-Wafer bei 65 ° C für 6 min und dann sofort die Heizplattentemperatur Rampe bis zu post-bake dem Wafer bei 95 ° C für 20 min. </li><li> Erlauben der Wafer auf Raumtemperatur abkühlen und dann laden dieWafer auf dem Lithographiestufe. </li><li> Richten Sie die Maske auf dem Wafer Mask Aligner mit und um den Wafer mit UV - Licht ausgesetzt werden (gemäß den Anweisungen des Herstellers) bei einer Intensität von 1,5 mW / cm 2 für 146 s die gesamte UV - Dosis von 220 mJ / cm 2 erforderlich für eine anzuwenden 50 &amp; mgr; m dicke Schicht aus Photolack. </li><li> Bewerben Einbrennen nach der Belichtung auf den Wafer in zwei Schritten auf einer heißen Platte. Für eine 50-um-Beschichtung aus Photoresist, erste Pre-Bake-Wafer bei 65 ° C für 1 min und sofort die Heizplattentemperatur Rampe bis zu post-bake es bei 95 ° C für 5 min. </li><li> Entwickeln des Wafers durch Eintauchen des Wafers in SU-8-Entwickler in und sanft schütteln, bis die Merkmale auf dem Wafer deutlich werden. Entwickeln des Wafers für ~ 6 min für die 50 &amp; mgr; m dicken Photoresist. </li><li> Spülen Sie überschüssige Entwickler mit Isopropanol und Ethanol, dann trocknen die Wafer mit einem Stickstoffluftpistole. </li><li> Hartbacken des Silizium-Wafers auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 15 min. </li><li> Setze dasWafer in einem Exsikkator mit 25 &amp; mgr; l des Silanisierungsmittel Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-Trichlorsilan. HINWEIS: Das Silanisierungsmittel ist ätzend, also in einer Säure / Base-Abzugshaube verwendet werden soll, geeignete persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe). </li><li> Setzen Sie das Vakuum für 5 Minuten und setzen den Wafer zu den Dämpfen von Silan für 30 Minuten, ohne das Vakuum freigibt. </li><li> Übertragen Sie die Wafer in eine ausreichend große, Petrischale. </li></ol> 2. Herstellung von Urformen für Soft Lithography mit Klebeband <ol><li> Zeichnen Sie das Layout der Mikrokanal eine CAD-Zeichnung Werkzeug und die Zeichnung auf weißem Papier gedruckt. </li><li> Reinigen Sie einen Objektträger aus Glas groß genug, um das Design mit Isopropanol aufzunehmen und dann trocknen Sie die Folie mit einer Luftpistole. </li><li> Befestigen Klebeband auf die gereinigte Glasobjektträger. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu stoppen. </li><li> Kleben Sie die Seiten des glass gleiten auf das Papier mit dem Design, mit der Bandseite nach oben. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, das Band auf dem Glasträger zu schneiden Sie das Papier Design als Referenz verwendet und dann abziehen Band von unerwünschten Bereichen der Glasträger. </li><li> Spülen Sie die Glasobjektträger mit Isopropanol und dann trocken mit einer Luftpistole. Backen Sie die Objektträger aus Glas in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min. </li><li> rollen sanft über das Band mit einer Gummiwalze von Luftblasen und damit die Folie auf Raumtemperatur abkühlen zu entfernen. </li></ol> 3. Weiche Lithography Die Herstellung der PDMS-Geräte <ol><li> Mischungs PDMS-Elastomer und dessen Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10: 1 (w: w), rühre die Mischung kräftig und dann entgast die Mischung, indem sie in einer Vakuumkammer platziert, bis keine Luftblasen in der Mischung auftreten. </li><li> Gießen Sie die Mischung auf eine silanisierte Silikonform oder Klebeband Form in einer Petrischale ein ~ 2 mm dicke Schicht aus PDMS und Entgasen, bis alle Luftblasen verschwinden zu erhalten. </li><li> Cure die PDMS in einem Ofenbei 65 ° C für 2 h. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell die PDMS-Schicht zu schneiden mindestens 5 mm entfernt von den Eigenschaften und dann schälen die gehärteten PDMS aus der Form unter Verwendung von tweezer. </li><li> Stanzen eine einzelne Einlassöffnung mit einer 1 mm - Biopsie überall auf dem Mikrokanal stanzen, vorzugsweise am Ende eines Netzes von Mikrokanälen , wie in 2a zu sehen und 4b. </li><li> Reinigen Sie die mit Klebeband gegossen PDMS zu Staubpartikel zu entfernen auf das Gerät adsorbiert. Sterilisieren Sie die PDMS-Mikrokanal-Gerät (PDMS gegossen) mit einer Lösung von 70% Ethanol, gefolgt von sterilem deionisiertem (DI) Wasser gespült wird, und setzen für 30 min mit UV. </li><li> Halten Sie die sterile PDMS-Gerät in eine sterile Petrischale bis zur Verwendung. </li></ol> 4. Substrat Patterning <ol><li> Legen Sie die sterile PDMS gegossen Pinzette auf eine sterile Deckglas oder Petrischale mit und anwenden sanften Druck mit der Spitze der Pinzette. HINWEIS: Die PDMS Guss macht eine konforme, aber reversible Dichtung mit dem glass Deckglas oder Petrischale Mikro ohne Verwendung eines Klebstoffs zu bilden. </li><li> Setzen Sie einen Tropfen (20 bis 40 &amp; mgr; l) der Substratlösung auf dem Einlass vollständig die Einlassöffnung abdeckt. Muster Poly-D-Lysine (PDL), indem ein 20 &amp; mgr; l Tröpfchen der PDL in Natriumtetraboratpuffer auf den Einlass der Mikrokanäle platzieren. </li><li> Legen Sie die Petrischale in einem Vakuum von ~ 254 mmHgA (entspricht Vakuum in biologischen Laboratorien zu Haus) für 10 min, und beobachten Sie die Luft aus dem Kanal in Form von Blasen kommen. </li><li> Lassen Sie die Vakuum und beobachten Sie die Substratlösung in den Mikrokanal fließt. </li><li> Inkubieren Sie die Schale an den geeigneten Bedingungen für die Substrathaftung. Siehe Tabellen 1 und 2 für Inkubationsbedingungen (diese auf dem Substrat variieren). Für PDL Strukturierung bei 37 ° C für 1 h inkubiert. </li><li> abblättern vorsichtig die PDMS-Stempel sterile Pinzette und waschen Sie das Muster auf Deckglas dreimal mit VE-Wasser. </li&gt; <li> Fügen Sie eine 1% Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung in die Petrischale die Schale oder das Deckglas zu bedecken und über Nacht bei 37 ° C inkubiert. HINWEIS: Dies reduziert unspezifische Haftung in unbeschichteten Regionen. </li><li> Absaugen der 1% BSA-Lösung und dem strukturierten Substrat ist nun einsatzbereit. </li></ol> 5. Indirekte Patterning von Zellen <ol><li> Vorbereitung der Zellsuspension in einem serumfreien Kulturmedium. Der Zelltyp und der Zelldichte sind in Tabelle 1 aufgeführt. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspension auf das strukturierte Petrischale und vollständig versenken die strukturierte Region in Zellsuspension. </li><li> Inkubieren der Petrischale bei 37 ° C in einem Inkubator für 15 min Zellen zu ermöglichen, um das strukturierte Substrat zu befestigen. </li><li> Aspirieren die überschüssige Zellsuspension aus der Petrischale und wasche die gemusterte Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter leichtem Schütteln für 10 s ungebundene Zellen zu entfernen. </li><li> Fügen Sie die appropriate Kulturmedium auf die strukturierte Zellkulturen und inkubiere die gemusterte Zellen bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. </li></ol> 6. Direct Patterning von Zellen ANMERKUNG: Diese Technik ist eine Alternative zu der indirekten Zelle Strukturieren in Schritt 5 beschrieben jedoch, anders als in Schritt 5 in dieser Technik Zellen werden strukturiert auf Gewebekulturoberflächen mit oder ohne Substratbeschichtung. <ol><li> Sterilisieren der mikrofluidischen Vorrichtung, indem sie mit einer Lösung von 70% Ethanol mit DI-Wasser gespült wurde. </li><li> Tränken das Gerät über Nacht in einer Lösung von 1% BSA, die Zelladhäsion zu den PDMS zu verhindern. </li><li> Trocknen Sie die Vorrichtung bei Raumtemperatur und befestigen es an der Unterseite der Gewebekultur-behandelte Petrischale. </li><li> Vorbereitung der Zellsuspension in serumfreien Kulturmedien. Der Zelltyp und der Zelldichte sind in Tabelle 2 aufgeführt. </li><li> Legen Sie ein Tröpfchen (4 - 8 ul) der Zellsuspension, genug, um zu füllen dieMikrokanäle, vollständig auf den Einlass für den Einlassloch. </li><li> Legen Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min und beobachten Luft aus dem Kanal in Form von Blasen kommen. Lassen Sie die Vakuum und beobachten Sie die Zellsuspension in den Mikrokanal fließt. </li><li> Die Petrischale in einem Inkubator inkubieren Zelladhäsion gemäß den Inkubationsbedingungen (abhängig von der Art der Zelle strukturiert) in Tabelle 2 erwähnt zu fördern. In PBS in die Petrischale Untertauchen des PDMS-Gerät. </li><li> Ziehen Sie die PDMS vorsichtig von der Petrischale mit einer Pinzette und waschen Sie das Muster mit PBS. In Zellkulturmedien zu der Petrischale und legen Sie die Zellkultur in den Inkubator. </li></ol>

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<li>MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Nat+Acad+of+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).</li>
<li>Suchodolskis, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sia.3763/abstract">Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM.</a> Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Während herkömmliche Photolithographie eine gut etablierte Technik für die Herstellung von Formen für Weich-Lithographie ist, die Ausrüstung, Materialien und Fähigkeiten erforderlich sind herkömmliche Photolithographie zu verwenden, nicht ohne weiteres auf den meisten Labors zur Verfügung. Für Laboratorien, ohne Zugang zu diesen Ressourcen haben wir Klebebandherstellung als Methode der dargestellten Formen mit relativ einfachen Funktionen für mikrofluidische Vorrichtungen zu schaffen. Diese Methode ermöglicht es jedem L...

In Tissue Engineering und der Biosensorik, die Fähigkeit , die räumliche Organisation von Proteinen und Zellen auf einer Skala um zu kontrollieren, hat sich in den letzten vier Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung 1, 2, 3. Genaue räumliche Organisation von Proteinen und Zellen hat Forscher erlaubt die Wechselwirkung zwischen Zellen und Substrate mit ähnlichen oder verschiedenen Arten von Zellen zu untersuchen, das Zellwachstum zu führen, und Biomolekülen zur Herstellung von Biosensoren , 4, 5, 6, 7, 8, zu immobilisieren 9. Aktuelle Methoden der Muster Proteine ​​schließen Photopatterning und Mikrokontaktdruck. Photopatterning nutzt lichtempfindliche Material, das bei Bestrahlung mit ultr vernetzteine violette (UV) Licht. UV - Licht bei einer Photomaske ( die aus transparenten Bereichen mit dunkleren Bereichen UV Lichtdurchlässigkeit zu verhindern) gerichtet verursacht in bestimmten Regionen Vernetzungs die dann 10 für die nachfolgende Befestigung von Biomaterialien oder Zellen verwendet werden können, 11. Während dieses System sehr genau ist und ermöglicht eine präzise Steuerung der Topographie der Kulturoberfläche, ist es gegenüber UV-empfindlichen Biomolekülen begrenzt , die durch UV - Strahlung 12 gemustert werden kann. Mikrokontakt- Drucken ist eine weitere beliebte Methode zur Strukturierung spezifischer Proteine 13, 14. In diesem Verfahren wird ein poly-dimethylsiloxan (PDMS) Tempel ist mit einer Vielzahl von Oberflächenmodifikationsreagenzien behandelt, bevor sie in einer Lösung des gewählten biomolekularen Substrat getränkt wird. Es wird dann auf einem Deckglas oder einer anderen Oberfläche so &quot;Stanzen&quot; des Biomoleküls auf die Kulturoberfläche schonend gepresst. However wird Prägen auf die Art des Materials begrenzt , die ebenso wie die Benetzbarkeit von Biomolekülen an der Oberfläche übertragen werden kann , die von PDMS 15 stempeln. Direkte Strukturierung von Zellen kann schwieriger sein , und stützt sich auf komplexe Verfahren wie schaltbare Substrate, stencil basierte Verfahren oder Strukturieren mit spezifischen Zelladhäsionsmoleküle 16, 17. Diese Verfahren sind begrenzt in ihrer Fähigkeit zur Musterzellen aufgrund des Fehlens von kompatiblen Zelladhäsion Substraten Inkompatibilität des Verfahrens mit empfindlichen biologischen Zellen und Randbedingungen zu arbeiten, Inkonsistenz in der Strukturierungs Wiedergabe- und Komplexität des Verfahrens. Beispielsweise bei schaltbaren Substrate, müssen individuelle Substrate für jeden Zelltyp gestaltet werden, deren Einhaltung bestimmter Zelltypen ohne Abbau bei Einwirkung von UV - Licht und Wärme in Prozess 17 verwendet , um Schalter, &lt;<html> sup class = &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20. Stencil Basis Strukturierungsverfahren sind vielseitig in ihrer Fähigkeit zur Musterzellen; jedoch ist es schwierig , PDMS Schablonen an den entsprechenden Dicken 16, 21 Verwendung herzustellen. Direkte Injektion von Zellen in PDMS mikrofluidischen Kanälen haben einige Vorteile wie: 1) erleichtern bei der Herstellung von mikrofluidischen Kanälen und 2) Eignung für viele verschiedene Zellen und Substraten. Das vorherrschende Problem der Luftblasenerfassung während des Injektionsvorgangs aufgrund der Hydrophobizität von PDMS ohne die Verwendung von Plasma - Reinigung oder andere Verfahren jedoch Luftblasen zu verringern, macht es schwierig , Oberflächen 21 konsequent gemusterten Zellen auf Glas- oder Kunststoff erstellen. Diese Arbeit baut auf Kapillar - Mikroform 22, 23,lass = &quot;Xref&quot;&gt; 24, 25, 26 und berichtet ein Verfahren Protein- und Zellsuspensionen in Mikrokanäle einzuspritzen. Das hier verwendete Verfahren zeigt die Strukturierung von Substraten und sowohl direkte als auch indirekte Strukturierung von spezifischen Zelltypen. Diese Technik überwindet die hohe Hydrophobizität von PDMS und eliminiert das Vorhandensein von Blasen während der Injektion von entweder Substrate oder Zellen durch Ausnutzung der Gasdurchlässigkeit von PDMS 27 nehmen. Dieses Papier zeigt die Verwendung der Technik mit verschiedenen Substraten und Zelltypen. Der Artikel zeigt auch die Herstellung von Formen für Weich - Lithographie herkömmliche Photolithographie sowie eine einfache und kostengünstige Klebeband Verfahren nützlich in ressourcenbeschränkten Einstellungen 28, 29 verwendet wird .

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD-Zeichenwerkzeuge</td><td>Corel Corporation, Kanada</td><td>X4 Version 14.0.0.701</td><td>CAD-Tool zum Zeichnen des Layouts des mikrofluidischen Geräts</td></tr><tr><td>Laserdrucker HP</td><td>Hewlett Packard,</td><td>CA 1739629</td><td>Zum Drucken des Layouts eines mikrofluidischen Geräts für die Klebebandtechnik</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>Wird zum Entgasen des PDMS-Gemisches</td></tr> <tr><td>verwendetKlebeband</td><td>3M Produkt, MN</td><td>Klebeband 600</td><td>Wird zur Herstellung von Klebeband verwendet Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>Gießpolymer</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>Wird verwendet, um die Form zum Gießen mit PDMS zu halten</td></tr><tr><td>Edelstahl Skalpell mit Klinge (# 11)</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan</td><td>2976#11</td><td>Wird verwendet, um das PDMS zu schneiden</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>Wird verwendet, um den PDMS-Guss beim Schälen</td></tr><tr><td>von Glasobjektträgern</td> zu handhaben <td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>Wird als Oberfläche zum Modellieren des Substrats</td></tr><tr><td>verwendet Glasobjektträger</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>Wird als Oberfläche zum Modellieren des Substrats</td></tr><tr><td>verwendet Gummiwalze</td><td>Dick Blick Art Materials, IL</td><td>40104-1004</td><td>Wird verwendet, um Klebeband auf Glas zu befestigen, ohne Luftblasen einzufangen</td></tr><tr><td>Laser Mask Writer</td><td>Heidelberg Instruments, Deutschland</td><td>DWL66fs</td><td>Wird zur Herstellung von Quarzmasken verwendet, die im Photolithographie-Herstellungsprozess verwendet</td></tr><tr><td>werden EVG Mask Aligner (Photolithographie-UV-Belichtungswerkzeug)</td><td>EV Group, Deutschland</td><td>EVG 620T(B)</td><td>Wird verwendet, um den Fotolack UV-Licht zu belichten</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>Wird verwendet, um den Fotolack auf Siliziumwafern zu schludern</td></tr>. <tr><td>Photolacke SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>Negativer Fotolack wird für die Herstellung von Formen verwendet</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>Photoresist-Entwickler</td></tr><tr><td>Tridecafluor-1,1,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorsilan</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>Form beschichten, um PDMS-Adhäsion zu vermeiden</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>Reinigungslösungsmittel</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>Sterilisationslösungsmittel</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL-Lösung wird bei 0,1 mg/ml in Natriumtetraboratpuffer</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td> <td>hergestelltLaminin aliquotiert in 10 &micro; L aliquote und verdünnt auf 20 & Mikro; g/&micro; L in PBS vor der Verwendung</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>C2C12 Myoblast-Zelllinie</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>Wird verwendet, um die C2C12-Strukturierung</td></tr><tr><td>zu demonstrieren PC12-Zelllinie</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>Wird verwendet, um die PC12-Strukturierung zu demonstrieren</td></tr><tr><td>Kollagen Typ 1, Rattenschwanz</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Phalloidin-Tetramethylrhodamin B Isothiocyanat (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>Zur Markierung von Zellen</td></tr><tr><td>Calcein-AM lebende tote Zellen Assay Kit</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>Zellviabilitätsassay</td></tr><tr><td>Biopsie Hole Punch</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>Loch in PDMS gestanzt</td></tr></tbody></table>

eine vielseitige methode von patterning proteinen und zellen

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrat- und Zellmusterbildungstechniken werden in der Zellbiologie häufig verwendet, um Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Substrat-Wechselwirkungen zu untersuchen. Herkömmliche Musterungstechniken funktionieren nur mit einfachen Formen, kleinen Flächen und ausgewählten Biomaterialien. In diesem Artikel wird ein Verfahren beschrieben, um Zellsuspensionen sowie Substratlösungen unter Verwendung von Unterdruck in komplexe, lange, geschlossene (Sackgasse) Polydimethylsiloxan (PDMS)-Mikrokanäle zu verteilen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, mehrere Substrate zu strukturieren, darunter Fibronektin, Kollagen, Antikörper (Sal-1), Poly-D-Lysin (PDL) und Laminin. Die Strukturierung von Substraten ermöglicht es, indirekt eine Vielzahl von Zellen zu strukturieren. Wir haben C2C12-Myoblasten, die neuronale PC12-Zelllinie, embryonale kortikale Neuronen von Ratten und amphibische Netzhautneuronen getestet. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Technik Fibroblasten in mikrofluidischen Kanälen direkt strukturieren kann, indem kurzzeitig ein niedriges Vakuum auf Zellsuspensionen angewendet wird. Das niedrige Vakuum verringert die Zellviabilität nicht signifikant, wie Zellviabilitätsassays zeigen. Modifikationen werden für die Anwendung der Methode auf verschiedene Zell- und Substrattypen diskutiert. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Zellen und Proteine in spezifischen Mustern zu strukturieren, ohne dass exotische Materialien oder Geräte erforderlich sind, und kann in jedem Labor mit Vakuum durchgeführt werden.

Dieses Verfahren erlaubt die Strukturierung von Proteinen und indirekte Strukturierung von Zellen Sackgassen mikrofluidischen Kanäle mit Abmessungen so klein wie 10 &amp; mgr; m und Anlagen in fast allen biologischen Laboratorien verwendet, sobald der Masterform hergestellt. Diese Technik kann mit PDMS mikrofluidischen Kanälen verwendet werden , unter Verwendung von herkömmlichen Weich photolithographischen erstellt oder mit PDMS mikrofluidischen Kanälen mit Klebeband Herstellungs erzeug...

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen oder Substrate zu strukturieren, indem sie mit einfachen am Arbeitsplatz verfügbaren Geräten, die in den meisten biologischen Laboren vorhanden sind, in komplexe, lange und geschlossene Mikrokanäle verteilt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Biologie bezüglich Zelle-zu-Zelle- und Zelle-zu-Protein-Interaktionen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach durchzuführen ist und nur Geräte erfordert, die in den meisten biologischen Laboren leicht verfügbar sind.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Optimierung der Inkubationsbedingungen für die vom Forscher gewählten Zellen und Substrate erforderlich ist. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die korrekte Platzierung des PDMS-Stempels und der Lösung die Reproduzierbarkeit des Experiments erheblich verbessert. Beginnen Sie damit, das Layout des Mikrokanals mithilfe eines CAD-Zeichnungsprogramms zu entwerfen.Dann drucken Sie die Zeichnung auf weißes Papier. Anschließend reinigen Sie mit Isopropanol einen Objektträger, der groß genug ist, um das Design aufzunehmen. Danach trocknen Sie den Objektträger mit einer Luftpistole.Befestigen Sie Klebeband an dem gereinigten Objektträger, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Anschließend befestigen Sie die Seiten des Objektträgers mit Klebeband auf dem Papier mit dem Motiv, sodass die Klebeseite nach oben zeigt. Schneiden Sie das Klebeband auf dem Objektträger mit einem Skalpell entlang der Kontur des Papiermotivs aus.Nach dem Schneiden die Folie von den unerwünschten Bereichen der Objektträgerplatte ablösen. Anschließend die Objektträgerplatte mit Isopropanol spülen, um eventuelle Rückstände des Klebstoffs zu entfernen. Danach die Oberfläche mit einer Luftpistole trocknen.Nach dem Strukturieren und Reinigen den Objektträger 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius im Ofen aushärten. Anschließend die Folie vorsichtig mit einer Gummierungwalze abrollen, um Luftblasen zu entfernen, und den Objektträger in einer Petrischale auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mischen Sie zunächst 10 Teile eines PDMS-Elastomers mit 1 Teil des entsprechenden Härtermittels und rühren Sie die Mischung gründlich um.Als Nächstes die Mischung in eine Vakuumkammer geben, um die Mischung zu entgasen, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind. Eine 2 mm dicke Schicht der Mischung auf die Klebebandform gießen und die Form entgasen, bis alle Luftblasen verschwunden sind. Nach dem Abkühlen ein Skalpell verwenden, um die PDMS-Schicht mindestens 5 mm entfernt von den Strukturen zu schneiden.Entfernen Sie dann das ausgehärtete PDMS mit einer Pinzette von der Form. Stanzen Sie mit einer 1 mm großen Biopsiepunch eine einzelne Zulauföffnung aus, vorzugsweise am Ende eines Mikrokanalnetzwerks. Reinigen Sie anschließend den PDMS-Abguss mit Klebeband, um Staubpartikel vom Gerät zu entfernen.Desinfizieren Sie das PDMS-Mikrokanalgerät, indem Sie es mit einer Lösung aus 70 % Ethanol spülen, gefolgt von steriler entionisierter Wasser, und es für 30 Minuten UV-Licht aussetzen. Verwenden Sie Pinzetten, um den sterilen PDMS-Abguss auf einen sterilen Glasdeckel zu legen, und üben Sie vorsichtig Druck mit der Spitze der Pinzette aus. Geben Sie anschließend einen Tropfen Poly-D-Lysin in Natriumtetraborat-Puffer auf den Eingang der Mikrokanäle.Stellen Sie die Petrischale für 10 Minuten unter Vakuum. Beobachten Sie währenddessen, wie Luft in Form von Blasen aus dem Kanal austritt. Lösen Sie das Vakuum und beobachten Sie, wie die Substratlösung in den Mikrokanal eindringt. Inkubieren Sie die Schale eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Danach vorsichtig den PDMS-Stempel mit sterilen Pinzetten abziehen und das Muster dreimal mit entionisiertem Wasser waschen. Eine 1 %-ige BSA-Lösung auf den Glasdeckel geben, um unspezifische Bindungen zu reduzieren, und die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die BSA-Lösung absaugen.Um die indirekte Musterung von Zellen zu beginnen, stellen Sie eine Zellsuspension in serumfreiem Kulturmedium gemäß dem begleitenden Textprotokoll her. Geben Sie die Zellsuspension in die strukturierte Petrischale, sodass der strukturierte Bereich vollständig von der Zellsuspension bedeckt ist. Anschließend inkubieren Sie die Petrischale 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, damit die Zellen an das strukturierte Substrat andocken können.Nach der Inkubation saugen Sie die überschüssige Zellsuspension aus der Petrischale ab und waschen die strukturierten Zellen dreimal mit PBS, wobei Sie vorsichtig zehn Sekunden lang schütteln, um die nicht angehefteten Zellen zu entfernen. Anschließend geben Sie das geeignete Kulturmedium zu den strukturierten Zellkulturen hinzu und inkubieren die strukturierten Zellen bei 37 Grad Celsius in einem mit Kohlendioxid gepufferten Inkubator. Für die direkte Strukturierung von Zellen sterilisieren Sie zunächst das mikrofluidische Gerät, indem Sie es mit einer Lösung aus 70 % Ethanol und danach mit entionisiertem Wasser spülen.Anschießend das Gerät über Nacht in einer Lösung mit 1 % BSA einweichen, um eine unspezifische Zelladhäsion an das PDMS zu verhindern. Das Gerät bei Raumtemperatur trocknen und dann an den Boden der mit Gewebekultur behandelten Petrischale befestigen. 4 bis 8 Mikroliter der Zellsuspension, ausreichend, um die Mikrokanäle zu füllen, am Einlass platzieren, wobei das Loch vollständig bedeckt wird.Danach die Petrischale für 10 Minuten in eine Vakuumkammer stellen. Das Vakuum abbrechen und beobachten, wie die Zellsuspension in den Mikrokanal fließt. Die Petrischale bis zu einer Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem mit Kohlendioxid gepufferten Inkubator inkubieren.Entfernen Sie dann die Schale aus dem Inkubator und verwenden Sie eine Pinzette, um das PDMS vorsichtig von der Schale abzulösen. Spülen Sie das Muster mit PBS und geben Sie anschließend Zellkulturmedium in die Petrischale. Stellen Sie die Zellen danach wieder in den Inkubator.Hier sind embryonale kortikale Rattenneuronen auf Oberflächen aus Poly-d-Lysin und Laminin dargestellt. Die Position der Zellen zeigt eine allgemeine Haftung an den strukturierten Bereichen sowie Wachstum entlang der PDL- und Laminin-Streifen. Hier in höherer Vergrößerung dargestellt sind C2C12-Myoblasten.Dieser Zelltyp haftet ebenfalls an den strukturierten Bereichen und zeigt eine Fusion zu mehrkernigen Myotuben. Diese Technik wurde zudem für die direkte Zellmusterung angepasst, wie hier mit Fibroblasten gezeigt. Diese Methode der direkten Zellmusterung hat keine nachteiligen Auswirkungen auf das Zellüberleben.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die fluoreszenzmikroskopische Analyse angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen bezüglich der Proteinsublokalisierung oder der Wechselwirkungen zwischen Zelle und Substrat zu untersuchen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die korrekte Platzierung des Tropfens mit Zellen oder der Substratlösung, um die gesamte Einlage vollständig zu bedecken, entscheidend für den Erfolg ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Axonleitfähigkeit von Photorezeptoren in der retinalen Biologie zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen und Substrate mit gasdurchlässigen mikrofluidischen PDMS-Geräten unter Verwendung von Unterdruck strukturiert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir zeigen eine einfache Methode für die Platzierung Zellen an gewünschten Stellen auf einem Substrat. Diese Methode Mustern Zellen, indem ein Silikon-Chip mit Vertiefungen, die mit Zellen auf dem Substrat gefüllt. Diese Methode bietet eine neue Art und Weise zu modulieren diffusionsfähig und juxtacrine Signalisierung zwischen den Zellen.

Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Mikrokontaktdruck ausgiebig in die Muster von Proteinen und anderen Molekülen auf Materialoberflächen eingesetzt. Wir zeigen die wichtigsten Schritte dieses Prozesses, Stanz-Muster von Fibronektin auf Glas.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

Wässriger Zweiphasensysteme wurden gleichzeitig Muster mehrere Populationen von Zellen verwendet. Dieses schnelle und einfache Methode zur Musterbildung Zelle nutzt die Phasentrennung der wässrigen Lösungen von Dextran und Polyethylenglycol und die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen besteht.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Bei dieser Methode verwenden wir Photopolymerisation und klicken Sie auf Chemie Techniken zum Erstellen von Protein oder Peptid Mustern auf der Oberfläche von Polyethylenglykol (PEG) Hydrogele, Bereitstellung immobilisiert bioaktiven Signale für die Erforschung der zellulären Reaktionen in-vitro- .

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

Die hier vorgestellte Methode verwendet Mikromuster ungemilzt mit quantitativer Bildgebung, um die räumliche Organisation innerhalb von Säugetierkulturen aufzuzeigen. Die Technik ist in einem Standardlabor für Zellbiologie leicht zu etablieren und bietet ein beschreibbares System zur Untersuchung von Mustern in vitro.

Kartierung der Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells mit Mikromustern und quantitativer Bildgebung

Unser übergeordnetes Ziel ist es zu verstehen, wie Zellen extrazelluläre Hinweise spüren, die zu einem gerichteten axonalen Wachstum führen. Hier beschreiben wir die Methodik der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen, die verwendet wird, um definierte Mikromuster von extrazellulären Matrixkomponenten zu produzieren, um spezifische Ereignisse zu untersuchen, die das Axonwachstum und die Pfadfindung steuern.

Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Hier stellen wir ein Protokoll für Mikrostrukturzellen mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von DNA-programmierter Adhäsion vor. Dieses Protokoll verwendet eine Benchtop-Photolithographie-Plattform, um Muster von DNA-Oligonukleotiden auf einem Glasobjektträger zu erzeugen und dann Zellmembranen mit kommerziell erhältlichen komplementären Oligonukleotiden zu markieren. Die Hybridisierung der Oligos führt zu einer programmierten Zelladhäsion.

Einfache, erschwingliche und modulare Musterung von Zellen mit DNA

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Herstellung von Mikromustern, die die Zellform standardisieren, um Zytoskelettstrukturen in Säugetierzellen zu untersuchen. Diese benutzerfreundliche Technik kann mit handelsüblichen Bildgebungssystemen eingerichtet werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die für Standard-Zellbiologielabore unzugänglich ist.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Erfahren Sie eine vielseitige Methode zum Patterning von Proteinen und Zellen in Mikrokanälen mittels Niederdruck-Vakuum. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Protein-Interaktionen in der biologischen Forschung.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

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