Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, zwei Methoden zu vergleichen, die zur Isolierung hochwertiger organellärer DNA, sowohl Plastiden- als auch Mitochondrien-DNA, aus pflanzlichem Blattgewebe verwendet werden, die für die Sequenzierung der nächsten Generation geeignet ist. Diese Methoden können helfen, Schlüsselfragen der Pflanzenbiologie zu beantworten, wie z.B. das Ausmaß der organellen Diversität über Taxa hinweg und wie sich Veränderungen in der Organellengenomsequenz oder -struktur auf die Entwicklung und Stressreaktion auswirken. Wir werden zwei Techniken vergleichen, die differentielle Zentrifugationsmethode, die für einen bestimmten Organellentyp anreichert, und die Metafraktionierungstechnik, die die gesamte organellare DNA aus kleineren gefrorenen Gewebeproben zurückgewinnt.

Das Standardverfahren für den Anbau von Weizensetzlingen besteht darin, Samen in Vermiculit zu pflanzen, in quadratischen Töpfen mit vier bis sechs Samen pro Ecke. Stellen Sie die Töpfe in ein Gewächshaus mit einem 16-stündigen Lichtzyklus um. Gießen Sie die Pflanzen jeden Tag.

Düngen Sie die Pflanzen nach der Keimung mit einem viertel Teelöffel körnigem 20-20-20 MPK-Dünger und erneut sieben Tage nach der Keimung. Zur Bewunderung von Weizensetzlingen, Pflanzensaatgut und Pflanzenpflege wie im Standardverfahren. Stellen Sie die Töpfe jedoch in eine dunkle Wachstumskammer.

Eine Alternative zum Anbau dieser Sämlinge in einer dunklen Wachstumskammer besteht darin, die Pflanzen im Gewächshaus abzudecken, aber mit der richtigen Belüftung. Der erste Schritt bei diesem Verfahren besteht darin, die Organellen zu isolieren. Ernten Sie fünf Gramm frisches Tuch und spülen Sie es in kaltem, sterilem Wasser in einem gekühlten Becherglas auf Eis ab.

Schneiden Sie das Blattgewebe mit einer Schere in etwa einen Zentimeter große Stücke direkt in ein vorgekühltes 50-Millimeter-Rohr, in dem sich zwei Keramikmahlzylinder befinden. Bewahren Sie die Proben während des gesamten Verfahrens auf Eis auf. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, ist es wichtig, die Schere zwischen den Proben zu wechseln.

Die Proben werden in den Abzug gegeben und mit 20 Millilitern STE-Puffer in jedes 50-Milliliter-Röhrchen gegeben. Legen Sie die Proben in vorgekühlte kryogene Mahlblöcke in einer Gewebemahlapparatur und mahlen Sie die Proben 30 Sekunden lang mit 1.750 Umdrehungen pro Minute. Legen Sie die Proben für etwa eine Minute auf Eis.

Drehen Sie die Probenpositionen und schleifen Sie weitere 30 Sekunden lang mit 1.750 Umdrehungen pro Minute. Geben Sie die Proben wieder in den Eiskübel. Führen Sie für jede Probe einen Trichter in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen ein, das in Eis gelegt wird, und legen Sie eine Schicht Filtertuch in den Trichter.

Befeuchten Sie das Filtertuch mit fünf Millilitern STE-Puffer und bewahren Sie den Durchfluss auf. Gießen Sie das homogenisierte Gewebe in den Trichter. Spülen Sie das Mahlrohr mit 15 Millilitern STE-Puffer, verschließen Sie das Röhrchen wieder und drehen Sie es um, um die Wände und den Deckel zu spülen, und gießen Sie den Inhalt in den Trichter.

Entfernen Sie vorsichtig die Keramiksteine und drücken und wringen Sie dann das Filtertuch in den Trichter aus. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Proben. Wickeln Sie die Tubenkappen mit Paraffinfolie ein, um ein Verschütten zu vermeiden.

Zentrifugieren Sie bei 2.000 x G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Verwenden Sie anschließend eine serologische Pipette, um den Überstand vorsichtig zu aspirieren, ohne das Pellet zu stören, und legen Sie es in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit hoher Geschwindigkeit und einer dichten Dichtung. Lege ein kleines Becherglas mit Eis auf eine Waage, zerreiße die Waage und wiege jeden Überstand.

Verwenden Sie STE-Puffer, um die Röhrchen auf 0,1 Gramm genau auszugleichen, und zentrifugieren Sie dann 20 Minuten lang bei 18.000 x G bei vier Grad Celsius. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, werden die Proben wieder in den Abzug zurückgeführt und der Überstand entsorgt. Geben Sie einen Milliliter ST-Puffer in das Pellet und resuspendieren Sie es vorsichtig mit einem weichen Pinsel.

Fügen Sie 24 Milliliter ST-Puffer hinzu, um ein Endvolumen von 25 Millilitern zu erhalten. Schwenken Sie den Pinsel vorsichtig in einer Suspension, um ihn zu mischen, und drücken Sie dann den Pinsel an die Seite eines Rohrs, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen, bevor Sie den Pinsel entfernen. Nach dem Ausbalancieren der Röhrchen bei 18.000 x G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten zentrifugieren.

Während dieser Zentrifugation bereiten Sie die DNA-1-Lösung vor, wie im Textprotokoll beschrieben, und aliquotieren Sie 200 Mikroliter auf ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Probe. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entsorgen Sie den Überstand und tupfen Sie das Röhrchen ab. Geben Sie zu jedem Zentrifugenröhrchen mit hoher Geschwindigkeit 300 Mikroliter STE-Puffer und resuspendieren Sie das Pellet mit einem weichen Pinsel.

Legen Sie den Pinsel in das zuvor vorbereitete 1,5-Liter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern DNA-1-Lösung und schwenken Sie den Pinsel, um alle im Pinsel festsitzenden Pelletreste zu entfernen. Pipettieren Sie die Lösung der DNA 1 in das Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen und schwenken Sie sie vorsichtig, um sie zu mischen. Wickeln Sie Paraffinfolie um die Oberseite jedes Röhrchens und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad.

Während der Inkubation durch Schwenken vorsichtig mischen. Pipettieren Sie die Pelletmischung mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung vorsichtig aus dem Röhrchen und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung. Geben Sie 500 Mikroliter 400 Millimolar EDTA, pH 8,0 in das Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen.

Piptieren Sie vorsichtig, um das restliche Pellet vollständig zu entfernen, und übertragen Sie das EDTA in das Röhrchen mit niedriger Bindung, das die Pelletmischung enthält. Vorsichtig durch Inversion mischen. Zentrifugieren Sie bei 18.000 x G, bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.

anschließend den Überstand, tupfen Sie jedes Röhrchen ab und verwenden Sie das Pellet sofort zur DNA-Isolierung. Bei dieser Methode wird organellare DNA aus der gesamten genomischen DNA angereichert, die mit kommerziellen DNA-Extraktionssäulen extrahiert wurde. Bereiten Sie die erforderliche Menge an MBD2 FC-proteingebundenen magnetischen Kügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und skalieren Sie die Reaktionen so, dass zwischen einem und zwei Mikrogramm der gesamten Eingangs-DNA verwendet wird.

In dieser Demonstration werden 160 Mikroliter Kügelchen für ein Mikrogramm der gesamten Eingangs-DNA benötigt. Um methylierte Kern-DNA zu erfassen, geben Sie ein Mikrogramm Eingangs-DNA in ein Röhrchen mit 160 Mikrolitern MBD2-gebundenen Magnetkügelchen für jede einzelne Probe und pipettieren Sie vorsichtig mit einer Spitze mit breiter Bohrung auf und ab. Fügen Sie das entsprechende Volumen von 5x Bind Wash Puffer hinzu, um eine Endkonzentration von 1x zu erreichen, und pipettieren Sie die Probe mit einer Spitze mit breiter Bohrung einige Male auf und ab, um sie zu mischen.

Drehen Sie die Röhren 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Für den Erfolg des Pulldowns ist es entscheidend, die Kügelchen während der Inkubation gründlich zu mischen, insbesondere wenn es zu einer starken Verklumpung der Kügelchen kommt. Um ein Verklumpen der Kügelchen zu verhindern und das Abziehen der methylierten DNA zu gewährleisten, pipettieren Sie die Proben vorsichtig mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung und schnippen Sie die Proben während der Inkubation zwei- bis dreimal.

Schleudern Sie kurz die Röhrchen mit der Mischung aus DNA und Magnetbead. Lege die Röhrchen für mindestens fünf Minuten auf ein Magnetgestell, um die Kügelchen an der Seite der Röhrchen zu sammeln. Die Lösung sollte klar erscheinen, sie enthält unmethylierte, mit Organellen angereicherte DNA.

Entfernen Sie den gereinigten Überstand vorsichtig mit Spitzen mit breiter Bohrung, ohne die Kügelchen zu stören, und geben Sie den Überstand in ein sauberes, niedrig bindendes Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Proben bei 20 oder 80 Grad Celsius. Ein akuter PCR-Assay wurde eingesetzt, um die relativen Häufigkeiten von drei organellenspezifischen Implikons in der gesamten genomischen DNA und der organellären DNA-Fraktion, die aus beiden Methoden erhalten wurde, zu bewerten.

Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass die differentielle Zentrifugationsmethode bevorzugt für Mitochondrien anreichert. Die unmethylierte Fraktion der methylfraktionierten genomischen Gesamt-DNA zeigt eine erhebliche Anreicherung beider organellärer Implikone. Die Prozentsätze der Reads, die den Referenzgenomen der Mitochondrien oder Chloroplasten des chinesischen Frühlings und des von Chris kultivierten Weizens zugeordnet wurden, stimmen mit den QPCR-Ergebnissen überein.

Die differentielle Zentrifugation liefert DNA, die stärker mit Mitochondrien angereichert ist, und die Methylfraktionierung ergibt DNA, die wahrscheinlich die native Häufigkeit der beiden Organellengenome widerspiegelt. Probenetiketten mit E kennzeichnen idyllische Proben und NE kennzeichnen nicht idyllische Proben. Interessanterweise veränderte die Idyllation die Organellenhäufigkeiten nicht.

Bei beiden Methoden übersteigt die theoretische Abdeckung der Mitochondrien oder Chloroplasten-referenzierten Genome die 100-fache Abdeckung, selbst wenn 12 Bibliotheken atremultiplexiert sind. Die gesamte genomische DNA wandert als diffuser Abstrich in der Nachfeld-Gelelektrophorese und überschreitet 50 Kilobasen. Die Kernfraktion nach der Methylfraktionierung nimmt ab, bleibt aber bei etwa 50 Kilobasen zentriert, was darauf hindeutet, dass methylfraktisierte DNA am besten für die Long-Read-Sequenzierung geeignet ist.

Einmal gemeistert, können beide organellären DNA-Extraktionstechniken in ein bis zwei Tagen durchgeführt werden, von der Probenentnahme bis zur Beurteilung des Endprodukts, wenn sie richtig durchgeführt werden. Die Methylfraktionierungstechnik hat das Potenzial, das Spektrum der organellären DNA-Untersuchungen auf seltene und schwierige Proben zu erweitern, da die Gewebeeinträge extrem gering sind. Eine differentielle Zentrifugation kann jedoch immer noch vorzuziehen sein, wenn für nachgelagerte Studien ausschließlich Mitochondrien-DNA benötigt wird.

Ebenso können Zentrifugationsschritte angepasst werden, um bevorzugt Plastiden-DNA zu extrahieren, falls gewünscht. Beide Methoden zur Extraktion organellärer DNA liefern DNA, die für die Sequenzierung der nächsten Generation geeignet ist, aber die Methylfraktionierung liefert DNA mit hoher molekularer Rate, die sich ideal für die Long-Read-Sequenzierung eignet.