Rekombination und Gene-Targeting
Klonen durch homologe Rekombination oder Restriktionsenzymen, hat die Forscher die Fähigkeit zur Durchführung von Hochdurchsatz-Gentechnik stark verbessert. Klassischen molekularen Klonen erfordert Verdauung von Vektoren und fügt mit der selben Restriktionsenzymen kompatibel enden für "Rekombination" zu generieren, aber vor allem, wenn Sie versuchen, eine Region von einer längeren Sequenz, wie z. B. eine Strecke von genomischer DNA isolieren gibt es nicht immer Restriktionsenzyme, die einzigartig in der Region von Interesse, und nicht innerhalb der Region oder an anderer Stelle in der Sequenz geschnitten wird. Durch Vermeidung der Notwendigkeit dieser Restriktionsschnittstellen, bietet Restriktionsenzymen einen wesentlich effizienteren und kostengünstigen Weg, um Gentechnik-Konstrukte zu machen.
In diesem Video werden wir die Grundsätze der genetischen Rekombination, vorsehen einem allgemeinen Protokolls Restriktionsenzymen Gene-targeting Vektor, und mehrere Anwendungen dieser Technologien zu diskutieren.
Zuerst lassen Sie uns besprechen, welche Rekombination ist und wie es angewendet werden kann.
Genetische Rekombination beinhaltet den Austausch von Informationen zwischen den DNA-Moleküle. In "homologe Rekombination," sind relativ weite Teile von ähnlichen oder identischen DNA-Sequenzen ausgetauscht. Zellen verwenden Sie diesen Prozess, um doppelte Strangbrüchen zu reparieren, und sexuell reproduzierende Eukaryoten auch dies zwischen Homologen Chromosomen während der Meiose genetischen Vielfalt zu erhöhen.
Homologe Rekombination hat für eine Reihe von experimentellen Zwecken, einschließlich der Änderung von bestimmten endogenen Loci in Zellen genutzt wurde – genannt "Gene targeting." Sie gilt auch für das Engineering von genetischen Konstrukte, einen Prozess namens "Restriktionsenzymen", was besonders nützlich für Änderungen an weite Teile der DNA für die Zielgruppenadressierung auf Genom eines Organismus ist. Um dies zu tun, Forscher nutzen "genomische Bibliotheken" oder Gruppen von Vektoren jedes enthaltenden lange genomischen DNA Fragmente. Verschiedene Arten von Bibliotheken mit unterschiedlichen Kapazitäten, in der Regel in bakteriellen Klone propagiert wurden erstellt und können aus kommerziellen oder Non-Profit-Repositories bestellt werden. Eines der am häufigsten verwendeten Arten von genomic Bibliothek nennt man eine bakterielle künstliches Chromosom oder BAC, die eine Plattengröße zwischen 150-350 Kilobases tragen kann.
Um zu Recombineer ein Konstrukt Wissenschaftler Bedarf ein Organismus in die homologe Rekombination auftritt. Die Hefe Saccharomyces Cerevisiae ist natürlich "Rekombination-kompetent" und kann ohne weiteres durchführen homologe Rekombination zwischen Vektor und einfügen. Eine weitere häufig angewandte System nutzt die "Roten" Proteine von Bakteriophagen Lambda, die in das Bakterium E. Coliwiederhergestellt ist. Vektoren können sein Recombineered in vorher festgelegten rot exprimierenden Bakterienstämme, oder ein Plasmid-Codierung, die roten Systemkomponenten mit Restriktionsenzymen Substrate in die Bakterien Co umgewandelt werden können.
Nun, gehen wir durch ein Protokoll zum Gene-targeting Vektor von Restriktionsenzymen erstellen.
Das Ziel dieses Protokolls ist die Schaffung eine gentechnisch veränderte Maus mit gezielte Änderungen an ein bestimmtes Gen. Gewünschte Änderungen an das gen des Interesses sind kurz, in eine BAC gemacht; die geänderte Reihenfolge wird in einem Targetingvektor "abgerufen", und dieser Vektor ist an embryonalen Stammzellen für die Ausrichtung gen transfiziert. Die Stammzellen können dann verwendet werden, um das gentechnisch veränderte Tier zu generieren. Anweisungen zu diesem letzten Verfahren, entnehmen Sie bitte der Wissenschaftsbildung JoVE video "Genetic Engineering von Modellorganismen."
Um zu beginnen, ist ein BAC-Klon mit der genomischen Sequenz von Interesse identifiziert und bestellt. Als nächstes sind die Homologie Arme oder Oligonukleotide mit 30-50 Länge homologen Regionen ausgelegt. Diese Oligonukleotide dienen als Grundierungen in PCR-Reaktionen, um die DNA "Kassetten" verwendet, um das gen des Interesses ändern zu generieren. Diese Kassetten enthalten in der Regel, zum Beispiel Antibiotika-Resistenz-Gene, die als Selektionsmarker, wirken können, die von vielen öffentlich zugänglichen Plasmide leicht verstärkt werden kann. Der BAC bakterielle Klon wird zum Beispiel durch Elektroporation, dann mit einem Plasmid Codierung der roten Systemkomponenten, gefolgt von der Homologie Arm-haltigen Kassetten umgewandelt. Die Bakterien werden dann bei der entsprechenden Temperatur induzieren Rekombination inkubiert.
Um die geänderte Reihenfolge der BAC beheben, ein "Retrieval" Vektor wird linearisiert und verstärkt mit Primer mit Homologie Waffen, die mehrere Kilobases rund um den Ort der Veränderung zu decken. Dieser Vektor Rückgrat verwandelt sich in die bakterielle BAC-Klon, und Restriktionsenzymen wieder induziert wird. Der Vektor werden "Lücke-repariert", indem Sie die entsprechende Sequenz aus der BAC "abrufen". Dies führt zu einer gen-targeting Vektor enthält die geänderte Reihenfolge der Interesse sowie Regionen, die homolog zu genomischer DNA, die rund um die veränderte Reihenfolge sind. Dieser Vektor kann dann gereinigt, linearisiert und an embryonalen Stammzellen, wo die endogenen homologe Rekombination Maschinen die veränderte Sequenz, die die entsprechenden Locus, damit eine Veränderung das Wirtsgenom Ziel wird, eingeführt.
Schauen wir uns nun einige Anwendungen der Rekombination basierende engineering-Techniken an.
Erstens können die Forscher Restriktionsenzymen verwenden, um schnell und einfach das bakterielle Genom, z.B. Ingenieur, Proteinkomplexe zu studieren. Hier wurde eine Kassette, die Codierung eines sequentiellen Peptid Affinität-Tags sowie eine Kanamycin-Resistenz-Selektionsmarker entwickelt, um Recombineered in 3 ¢ Ende des Gens von Interesse sein. Dieser Vektor wurde dann in rot "Rekombination-kompetente" E. Colieingeführt und erfolgreich Recombinants wurden mithilfe von Selektivmedien isoliert. Tagged Proteinkomplexe wurden biochemisch gereinigt mit Proteinen, die stark an die Tags binden und analysiert durch Massenspektrometrie, die Interaktionspartner des Proteins des Interesses zu identifizieren.
Restriktionsenzymen und Gene targeting können auch verwendet werden, um das Genom des parasitären Organismen, wie z. B. die obligat intrazelluläre Parasiten Toxoplasma Gondii, ändern, wodurch die Krankheit Toxoplasmose. In dieser Studie wurde ein Targetingvektor Recombineered in Hefe Genomsequenzen flankieren das gen des Interesses um ein Selektionsmarker platziert wurden. Der Vektor wurde dann linearisiert und elektroporiert in der Parasiten. Begrenzung der Verdünnung Beschichtung in Selektivmedien wurde verwendet, um erfolgreiche Recombinants zu isolieren, in denen der Parasit homologe Rekombination Maschinen mit veränderter Reihenfolge, so löschen das gen des Interesses die genomische Sequenz ersetzt. PCR der gezielten Region bestätigt positive Rekombinationsereignisse.
Zu guter Letzt ein Verfahren bekannt als subcloning plus einfügen oder SPI, in welche Lücke Reparatur- und Kassette einlegen entwickelt worden gleichzeitig auftreten, Restriktionsenzymen Entscheidungsprozess, einfacher und flexibler. Entscheidend für den Erfolg dieses Prozesses ist die richtige Gestaltung von mehreren Homologie Waffen, die bei bis zu 180 bp, sind länger als bei herkömmlichen Restriktionsenzymen um Rekombination Effizienz zu erhöhen. Nach Einbeziehung der Homologie Arme in die subcloning Plasmid und Einfügung Kassetten durch PCR, sie waren zusammen in einen roten exprimierenden BAC-Klon verwandelt und Restriktionsenzymen induziert wurde. Recombineered Konstrukte wurden erfolgreich dann durch PCR oder Einschränkung Digest-Analyse identifiziert.
Sie haben nur Jupiters Video auf Restriktionsenzymen angesehen. In diesem Video haben wir diskutiert, die Grundsätze der Rekombination und wie sie in der Gentechnik, ein Protokoll für ein Projekt von Restriktionsenzymen und schließlich mehrere Anwendungen dieser Techniken verwendet werden können. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
Eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge der modernen Biologie ist molekulare Klonierung mit Restriktionsenzymen, die kompatibel enden zwischen D…
Klonen durch homologe Rekombination oder Restriktionsenzymen, hat die Forscher die Fähigkeit zur Durchführung von Hochdurchsatz-Gentechnik stark verbessert. Klassischen molekularen Klonen erfordert Verdauung von Vektoren und fügt mit der selben Restriktionsenzymen kompatibel enden für "Rekombination" zu generieren, aber vor allem, wenn Sie versuchen, eine Region von einer längeren Sequenz, wie z. B. eine Strecke von genomischer DNA isolieren gibt es nicht immer Restriktionsenzyme, die einzigartig in der Region von Interesse, und nicht innerhalb der Region oder an anderer Stelle in der Sequenz geschnitten wird. Durch Vermeidung der Notwendigkeit dieser Restriktionsschnittstellen, bietet Restriktionsenzymen einen wesentlich effizienteren und kostengünstigen Weg, um Gentechnik-Konstrukte zu machen.
In diesem Video werden wir die Grundsätze der genetischen Rekombination, vorsehen einem allgemeinen Protokolls Restriktionsenzymen Gene-targeting Vektor, und mehrere Anwendungen dieser Technologien zu diskutieren.
Zuerst lassen Sie uns besprechen, welche Rekombination ist und wie es angewendet werden kann.
Genetische Rekombination beinhaltet den Austausch von Informationen zwischen den DNA-Moleküle. In "homologe Rekombination," sind relativ weite Teile von ähnlichen oder identischen DNA-Sequenzen ausgetauscht. Zellen verwenden Sie diesen Prozess, um doppelte Strangbrüchen zu reparieren, und sexuell reproduzierende Eukaryoten auch dies zwischen Homologen Chromosomen während der Meiose genetischen Vielfalt zu erhöhen.
Homologe Rekombination hat für eine Reihe von experimentellen Zwecken, einschließlich der Änderung von bestimmten endogenen Loci in Zellen genutzt wurde – genannt "Gene targeting." Sie gilt auch für das Engineering von genetischen Konstrukte, einen Prozess namens "Restriktionsenzymen", was besonders nützlich für Änderungen an weite Teile der DNA für die Zielgruppenadressierung auf Genom eines Organismus ist. Um dies zu tun, Forscher nutzen "genomische Bibliotheken" oder Gruppen von Vektoren jedes enthaltenden lange genomischen DNA Fragmente. Verschiedene Arten von Bibliotheken mit unterschiedlichen Kapazitäten, in der Regel in bakteriellen Klone propagiert wurden erstellt und können aus kommerziellen oder Non-Profit-Repositories bestellt werden. Eines der am häufigsten verwendeten Arten von genomic Bibliothek nennt man eine bakterielle künstliches Chromosom oder BAC, die eine Plattengröße zwischen 150-350 Kilobases tragen kann.
Um zu Recombineer ein Konstrukt Wissenschaftler Bedarf ein Organismus in die homologe Rekombination auftritt. Die Hefe Saccharomyces Cerevisiae ist natürlich "Rekombination-kompetent" und kann ohne weiteres durchführen homologe Rekombination zwischen Vektor und einfügen. Eine weitere häufig angewandte System nutzt die "Roten" Proteine von Bakteriophagen Lambda, die in das Bakterium E. Coliwiederhergestellt ist. Vektoren können sein Recombineered in vorher festgelegten rot exprimierenden Bakterienstämme, oder ein Plasmid-Codierung, die roten Systemkomponenten mit Restriktionsenzymen Substrate in die Bakterien Co umgewandelt werden können.
Nun, gehen wir durch ein Protokoll zum Gene-targeting Vektor von Restriktionsenzymen erstellen.
Das Ziel dieses Protokolls ist die Schaffung eine gentechnisch veränderte Maus mit gezielte Änderungen an ein bestimmtes Gen. Gewünschte Änderungen an das gen des Interesses sind kurz, in eine BAC gemacht; die geänderte Reihenfolge wird in einem Targetingvektor "abgerufen", und dieser Vektor ist an embryonalen Stammzellen für die Ausrichtung gen transfiziert. Die Stammzellen können dann verwendet werden, um das gentechnisch veränderte Tier zu generieren. Anweisungen zu diesem letzten Verfahren, entnehmen Sie bitte der Wissenschaftsbildung JoVE video "Genetic Engineering von Modellorganismen."
Um zu beginnen, ist ein BAC-Klon mit der genomischen Sequenz von Interesse identifiziert und bestellt. Als nächstes sind die Homologie Arme oder Oligonukleotide mit 30-50 Länge homologen Regionen ausgelegt. Diese Oligonukleotide dienen als Grundierungen in PCR-Reaktionen, um die DNA "Kassetten" verwendet, um das gen des Interesses ändern zu generieren. Diese Kassetten enthalten in der Regel, zum Beispiel Antibiotika-Resistenz-Gene, die als Selektionsmarker, wirken können, die von vielen öffentlich zugänglichen Plasmide leicht verstärkt werden kann. Der BAC bakterielle Klon wird zum Beispiel durch Elektroporation, dann mit einem Plasmid Codierung der roten Systemkomponenten, gefolgt von der Homologie Arm-haltigen Kassetten umgewandelt. Die Bakterien werden dann bei der entsprechenden Temperatur induzieren Rekombination inkubiert.
Um die geänderte Reihenfolge der BAC beheben, ein "Retrieval" Vektor wird linearisiert und verstärkt mit Primer mit Homologie Waffen, die mehrere Kilobases rund um den Ort der Veränderung zu decken. Dieser Vektor Rückgrat verwandelt sich in die bakterielle BAC-Klon, und Restriktionsenzymen wieder induziert wird. Der Vektor werden "Lücke-repariert", indem Sie die entsprechende Sequenz aus der BAC "abrufen". Dies führt zu einer gen-targeting Vektor enthält die geänderte Reihenfolge der Interesse sowie Regionen, die homolog zu genomischer DNA, die rund um die veränderte Reihenfolge sind. Dieser Vektor kann dann gereinigt, linearisiert und an embryonalen Stammzellen, wo die endogenen homologe Rekombination Maschinen die veränderte Sequenz, die die entsprechenden Locus, damit eine Veränderung das Wirtsgenom Ziel wird, eingeführt.
Schauen wir uns nun einige Anwendungen der Rekombination basierende engineering-Techniken an.
Erstens können die Forscher Restriktionsenzymen verwenden, um schnell und einfach das bakterielle Genom, z.B. Ingenieur, Proteinkomplexe zu studieren. Hier wurde eine Kassette, die Codierung eines sequentiellen Peptid Affinität-Tags sowie eine Kanamycin-Resistenz-Selektionsmarker entwickelt, um Recombineered in 3 ¢ Ende des Gens von Interesse sein. Dieser Vektor wurde dann in rot "Rekombination-kompetente" E. Colieingeführt und erfolgreich Recombinants wurden mithilfe von Selektivmedien isoliert. Tagged Proteinkomplexe wurden biochemisch gereinigt mit Proteinen, die stark an die Tags binden und analysiert durch Massenspektrometrie, die Interaktionspartner des Proteins des Interesses zu identifizieren.
Restriktionsenzymen und Gene targeting können auch verwendet werden, um das Genom des parasitären Organismen, wie z. B. die obligat intrazelluläre Parasiten Toxoplasma Gondii, ändern, wodurch die Krankheit Toxoplasmose. In dieser Studie wurde ein Targetingvektor Recombineered in Hefe Genomsequenzen flankieren das gen des Interesses um ein Selektionsmarker platziert wurden. Der Vektor wurde dann linearisiert und elektroporiert in der Parasiten. Begrenzung der Verdünnung Beschichtung in Selektivmedien wurde verwendet, um erfolgreiche Recombinants zu isolieren, in denen der Parasit homologe Rekombination Maschinen mit veränderter Reihenfolge, so löschen das gen des Interesses die genomische Sequenz ersetzt. PCR der gezielten Region bestätigt positive Rekombinationsereignisse.
Zu guter Letzt ein Verfahren bekannt als subcloning plus einfügen oder SPI, in welche Lücke Reparatur- und Kassette einlegen entwickelt worden gleichzeitig auftreten, Restriktionsenzymen Entscheidungsprozess, einfacher und flexibler. Entscheidend für den Erfolg dieses Prozesses ist die richtige Gestaltung von mehreren Homologie Waffen, die bei bis zu 180 bp, sind länger als bei herkömmlichen Restriktionsenzymen um Rekombination Effizienz zu erhöhen. Nach Einbeziehung der Homologie Arme in die subcloning Plasmid und Einfügung Kassetten durch PCR, sie waren zusammen in einen roten exprimierenden BAC-Klon verwandelt und Restriktionsenzymen induziert wurde. Recombineered Konstrukte wurden erfolgreich dann durch PCR oder Einschränkung Digest-Analyse identifiziert.
Sie haben nur Jupiters Video auf Restriktionsenzymen angesehen. In diesem Video haben wir diskutiert, die Grundsätze der Rekombination und wie sie in der Gentechnik, ein Protokoll für ein Projekt von Restriktionsenzymen und schließlich mehrere Anwendungen dieser Techniken verwendet werden können. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
Klonen durch homologe Rekombination oder Restriktionsenzymen, hat die Forscher die Fähigkeit zur Durchführung von Hochdurchsatz-Gentechnik stark verbessert. Klassischen molekularen Klonen erfordert Verdauung von Vektoren und fügt mit der selben Restriktionsenzymen kompatibel enden für "Rekombination" zu generieren, aber vor allem, wenn Sie versuchen, eine Region von einer längeren Sequenz, wie z. B. eine Strecke von genomischer DNA isolieren gibt es nicht immer Restriktionsenzyme, die einzigartig in der Region von Interesse, und nicht innerhalb der Region oder an anderer Stelle in der Sequenz geschnitten wird. Durch Vermeidung der Notwendigkeit dieser Restriktionsschnittstellen, bietet Restriktionsenzymen einen wesentlich effizienteren und kostengünstigen Weg, um Gentechnik-Konstrukte zu machen.
In diesem Video werden wir die Grundsätze der genetischen Rekombination, vorsehen einem allgemeinen Protokolls Restriktionsenzymen Gene-targeting Vektor, und mehrere Anwendungen dieser Technologien zu diskutieren.
Zuerst lassen Sie uns besprechen, welche Rekombination ist und wie es angewendet werden kann.
Genetische Rekombination beinhaltet den Austausch von Informationen zwischen den DNA-Moleküle. In "homologe Rekombination," sind relativ weite Teile von ähnlichen oder identischen DNA-Sequenzen ausgetauscht. Zellen verwenden Sie diesen Prozess, um doppelte Strangbrüchen zu reparieren, und sexuell reproduzierende Eukaryoten auch dies zwischen Homologen Chromosomen während der Meiose genetischen Vielfalt zu erhöhen.
Homologe Rekombination hat für eine Reihe von experimentellen Zwecken, einschließlich der Änderung von bestimmten endogenen Loci in Zellen genutzt wurde – genannt "Gene targeting." Sie gilt auch für das Engineering von genetischen Konstrukte, einen Prozess namens "Restriktionsenzymen", was besonders nützlich für Änderungen an weite Teile der DNA für die Zielgruppenadressierung auf Genom eines Organismus ist. Um dies zu tun, Forscher nutzen "genomische Bibliotheken" oder Gruppen von Vektoren jedes enthaltenden lange genomischen DNA Fragmente. Verschiedene Arten von Bibliotheken mit unterschiedlichen Kapazitäten, in der Regel in bakteriellen Klone propagiert wurden erstellt und können aus kommerziellen oder Non-Profit-Repositories bestellt werden. Eines der am häufigsten verwendeten Arten von genomic Bibliothek nennt man eine bakterielle künstliches Chromosom oder BAC, die eine Plattengröße zwischen 150-350 Kilobases tragen kann.
Um zu Recombineer ein Konstrukt Wissenschaftler Bedarf ein Organismus in die homologe Rekombination auftritt. Die Hefe Saccharomyces Cerevisiae ist natürlich "Rekombination-kompetent" und kann ohne weiteres durchführen homologe Rekombination zwischen Vektor und einfügen. Eine weitere häufig angewandte System nutzt die "Roten" Proteine von Bakteriophagen Lambda, die in das Bakterium E. Coliwiederhergestellt ist. Vektoren können sein Recombineered in vorher festgelegten rot exprimierenden Bakterienstämme, oder ein Plasmid-Codierung, die roten Systemkomponenten mit Restriktionsenzymen Substrate in die Bakterien Co umgewandelt werden können.
Nun, gehen wir durch ein Protokoll zum Gene-targeting Vektor von Restriktionsenzymen erstellen.
Das Ziel dieses Protokolls ist die Schaffung eine gentechnisch veränderte Maus mit gezielte Änderungen an ein bestimmtes Gen. Gewünschte Änderungen an das gen des Interesses sind kurz, in eine BAC gemacht; die geänderte Reihenfolge wird in einem Targetingvektor "abgerufen", und dieser Vektor ist an embryonalen Stammzellen für die Ausrichtung gen transfiziert. Die Stammzellen können dann verwendet werden, um das gentechnisch veränderte Tier zu generieren. Anweisungen zu diesem letzten Verfahren, entnehmen Sie bitte der Wissenschaftsbildung JoVE video "Genetic Engineering von Modellorganismen."
Um zu beginnen, ist ein BAC-Klon mit der genomischen Sequenz von Interesse identifiziert und bestellt. Als nächstes sind die Homologie Arme oder Oligonukleotide mit 30-50 Länge homologen Regionen ausgelegt. Diese Oligonukleotide dienen als Grundierungen in PCR-Reaktionen, um die DNA "Kassetten" verwendet, um das gen des Interesses ändern zu generieren. Diese Kassetten enthalten in der Regel, zum Beispiel Antibiotika-Resistenz-Gene, die als Selektionsmarker, wirken können, die von vielen öffentlich zugänglichen Plasmide leicht verstärkt werden kann. Der BAC bakterielle Klon wird zum Beispiel durch Elektroporation, dann mit einem Plasmid Codierung der roten Systemkomponenten, gefolgt von der Homologie Arm-haltigen Kassetten umgewandelt. Die Bakterien werden dann bei der entsprechenden Temperatur induzieren Rekombination inkubiert.
Um die geänderte Reihenfolge der BAC beheben, ein "Retrieval" Vektor wird linearisiert und verstärkt mit Primer mit Homologie Waffen, die mehrere Kilobases rund um den Ort der Veränderung zu decken. Dieser Vektor Rückgrat verwandelt sich in die bakterielle BAC-Klon, und Restriktionsenzymen wieder induziert wird. Der Vektor werden "Lücke-repariert", indem Sie die entsprechende Sequenz aus der BAC "abrufen". Dies führt zu einer gen-targeting Vektor enthält die geänderte Reihenfolge der Interesse sowie Regionen, die homolog zu genomischer DNA, die rund um die veränderte Reihenfolge sind. Dieser Vektor kann dann gereinigt, linearisiert und an embryonalen Stammzellen, wo die endogenen homologe Rekombination Maschinen die veränderte Sequenz, die die entsprechenden Locus, damit eine Veränderung das Wirtsgenom Ziel wird, eingeführt.
Schauen wir uns nun einige Anwendungen der Rekombination basierende engineering-Techniken an.
Erstens können die Forscher Restriktionsenzymen verwenden, um schnell und einfach das bakterielle Genom, z.B. Ingenieur, Proteinkomplexe zu studieren. Hier wurde eine Kassette, die Codierung eines sequentiellen Peptid Affinität-Tags sowie eine Kanamycin-Resistenz-Selektionsmarker entwickelt, um Recombineered in 3 ¢ Ende des Gens von Interesse sein. Dieser Vektor wurde dann in rot "Rekombination-kompetente" E. Colieingeführt und erfolgreich Recombinants wurden mithilfe von Selektivmedien isoliert. Tagged Proteinkomplexe wurden biochemisch gereinigt mit Proteinen, die stark an die Tags binden und analysiert durch Massenspektrometrie, die Interaktionspartner des Proteins des Interesses zu identifizieren.
Restriktionsenzymen und Gene targeting können auch verwendet werden, um das Genom des parasitären Organismen, wie z. B. die obligat intrazelluläre Parasiten Toxoplasma Gondii, ändern, wodurch die Krankheit Toxoplasmose. In dieser Studie wurde ein Targetingvektor Recombineered in Hefe Genomsequenzen flankieren das gen des Interesses um ein Selektionsmarker platziert wurden. Der Vektor wurde dann linearisiert und elektroporiert in der Parasiten. Begrenzung der Verdünnung Beschichtung in Selektivmedien wurde verwendet, um erfolgreiche Recombinants zu isolieren, in denen der Parasit homologe Rekombination Maschinen mit veränderter Reihenfolge, so löschen das gen des Interesses die genomische Sequenz ersetzt. PCR der gezielten Region bestätigt positive Rekombinationsereignisse.
Zu guter Letzt ein Verfahren bekannt als subcloning plus einfügen oder SPI, in welche Lücke Reparatur- und Kassette einlegen entwickelt worden gleichzeitig auftreten, Restriktionsenzymen Entscheidungsprozess, einfacher und flexibler. Entscheidend für den Erfolg dieses Prozesses ist die richtige Gestaltung von mehreren Homologie Waffen, die bei bis zu 180 bp, sind länger als bei herkömmlichen Restriktionsenzymen um Rekombination Effizienz zu erhöhen. Nach Einbeziehung der Homologie Arme in die subcloning Plasmid und Einfügung Kassetten durch PCR, sie waren zusammen in einen roten exprimierenden BAC-Klon verwandelt und Restriktionsenzymen induziert wurde. Recombineered Konstrukte wurden erfolgreich dann durch PCR oder Einschränkung Digest-Analyse identifiziert.
Sie haben nur Jupiters Video auf Restriktionsenzymen angesehen. In diesem Video haben wir diskutiert, die Grundsätze der Rekombination und wie sie in der Gentechnik, ein Protokoll für ein Projekt von Restriktionsenzymen und schließlich mehrere Anwendungen dieser Techniken verwendet werden können. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
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Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.
Kapitel in diesem Video
0:00
Overview
1:05
Principles of Homologous Recombination
3:20
Recombineering a Gene Targeting Vector
5:54
Applications
8:28
Summary