Name: Automatisierte radiochemische Synthese von 18 F 3F4AP: Ein neuartiger PET-Tracer zur Bildgebung von demyelinisierenden Krankheiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte radiochemische Synthese von [18F]3F4AP für PET-Bildgebung bei demyelinisierenden Erkrankungen. Diese Methode mit integriertem Fluidikprozessor ermöglicht reine Tracer-Produktion für präklinische Neurowissenschaften.

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Dieses Projekt wurde unterstützt von Stipendien NIH / NIBIB 1K99EB020075 an Pedro Brugarolas und einem Innovation Fund Award von der Chicago Innovation Exchange an Brian Popko und Pedro Brugarolas. Prof. Brian Popko ist dankbar für seine Mentoren und finanzielle Unterstützung für das Projekt anerkannt. Prof. Chin-Tu Chen und die integrierte Kleintier-Imaging-Forschungsressource an der University of Chicago sind anerkannt für die großzügige Nutzung von Laborraum und Ausrüstung. IBA ist anerkannt für Sponsoring Open-Access dieses Artikels.

ACHTUNG: Alle Verfahren, die den Einsatz radioaktiver Stoffe beinhalten, müssen vom örtlichen Strahlenschutzamt genehmigt werden. Bei der Arbeit mit radioaktiven Materialien tragen Sie einen Laborkittel und persönliche Strahlungsabzeichen. Verwenden Sie zu jeder Zeit zwei Lagen Handschuhe und kontrollieren Sie die Hände mit einem Geiger-Zähler nach jedem Schritt, der die Handhabung der Radioaktivität beinhaltet. Wenn die Handschuhe mit Radioaktivität verunreinigt sind und ersetzen Sie Außenhandschuhe. Verwenden Sie eine geeignete Abschirmung, minimieren Sie die Zeit in Kontakt mit der Strahlungsquelle und maximieren Sie den Abstand. 1. Eine Woche vor dem Experiment: Vorbereitung der Materialien <ol><li> Download [ 18 F] 3F4AP Sequenz: Synthera Benutzer können sich in der Benutzer Datenbank (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) anmelden und die Sequenzdatei für 3F4AP herunterladen. Benutzer von anderen Synthesizern müssen möglicherweise ihr eigenes Skript auf der Grundlage der Reihenfolge der Schritte schreiben. Durchsuchen Sie die kommentierte Sequenz, um sich mit dem s vertraut zu machenTeps in der Synthese beteiligt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass für die Synthese genügend Gas vorhanden ist. Der Synthesizer benötigt komprimiertes Gas, entweder Helium oder Stickstoff. Es erfordert auch&gt; 75 psi Druckluft. Stellen Sie sicher, dass der Druck innerhalb des vom Hersteller empfohlenen Drucks liegt. </li><li> Vorbereiten der HPLC-Mobilphase: Herstellung von 1 l 50 mM Natriumphosphat und 10 mM Triethylamin. Mit einem pH-Meter wird der pH-Wert durch Zugabe von tropfenweise gesättigtem Natriumhydroxid unter Rühren auf 8,0 ± 0,1 eingestellt. Die Lösung wird durch einen 0,22 μm-Bottletop-Filter filtriert und mit 5% Ethanol versetzt. </li><li> Trockene Glaswaren im Ofen über Nacht. </li></ol> 2. Tag des Experiments: Vor der Ankunft von Fluor-18 <ol><li> Mit 1 ml Spritzen die Reagenzgefäße mit den entsprechenden Reagenzien füllen. Für die Fläschchen 2 und 3 verwenden Sie mit Ofen getrocknete Fläschchen und wasserfreie Lösungsmittel unter Argon. Die Fläschchen mit Crimpdichtungen mit einem Crimper versiegeln. <ol><li> Füllfläschchen 1 (11 mm Durchmesser / 2 mL Volumen viAl) mit 400 &amp; mgr; l TBA-HCO 3 + 800 &amp; mgr; l Acetonitril (MeCN). </li><li> Füllen Sie die Durchstechflasche 2 (13 mm / 4 ml Durchstechflasche) mit 50 &amp; mgr; l Vorläuferlösung 1,0 mg / ml + 450 &amp; mgr; l MeCN. </li><li> Füllung Vial 3 (11 mm / 2 mL Durchstechflasche) mit 500 μl MeCN. </li><li> Füllen Sie die Durchstechflasche 4 (13 mm / 4 ml Durchstechflasche) mit 4 ml 0,2% Oxalsäure in Methanol (MeOH). </li></ol></li><li> Bedingung der QMA (starker Anionenaustausch) und Alumina-N Festphasenextraktionskartuschen. Unter Verwendung einer 10-ml-Spritze werden 5 ml 8,4% NaHCO 3 tropfenweise durch das QMA geleitet, gefolgt von 5 ml ultrareines deionisiertes Typ I Wasser (18,2 ΜΩ · cm bei 25 ºC). Führen Sie 5 ml ultrareines Wasser tropfenweise durch Alumina-N-Patrone, gefolgt von 5 ml MeOH + 0,2% Oxalsäure. </li><li> Schalte die HPLC ein und konditioniere die C-18 Säule mit 4 mL pro min der mobilen Phase für 30 min. </li><li> Laden Sie eine neue Katalysatorpatrone auf den Hydrierpatronenhalter und starten Sie einen Fluss von 0,5 ml / min 100% MeOH. SUnd den Wasserstoffregler auf 50 psi stellen und die Patrone für 15 min konditionieren (Abbildung 2 ). </li><li> Montieren Sie den integrierten Fluidprozessor (IFP), indem Sie die Fläschchen 1 bis 4 in ihre Positionen einführen, indem Sie die Patronen und die Sammelfläschchen wie in Abbildung 3 gezeigt anschließen. Bringen Sie eine Sammelfläschchen mit einer Entlüftungsnadel an die Ausgangsleitung des Hydrons an. </li><li> Starten Sie die Software des Synthesizers. Geben Sie Login und Passwort ein. Führen Sie die Vorlaufkontrollen des Synthesizers gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Sequenzen&quot; und dann auf &quot;Öffnen&quot;, um die 3F4AP-Sequenz zu laden. </li><li> Laden Sie den IFP, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;Laden&quot; auf dem Bildschirm klicken. Geben Sie einen Dateinamen für den Lauf ein und starten Sie die Sequenz, indem Sie auf &quot;Start&quot; klicken. (Der automatisierte Synthesizer pausiert automatisch vor dem 18 F Ladevorgang.) </li><li> Beobachten Sie, wie der Synthesizer durch die Routine-Selbst-Check-Schritte (Teil eins der Sequenz) geht. Schau dir das Geröll anUm sicherzustellen, dass es keine Warnungen oder Alarme gibt. Achten Sie auf Geräusche, da der Synthesizer Spuren und Vorwärmen Reaktionsgefäß in Vorbereitung für den Lauf. Die Temperaturanzeige sollte steigen und bei 65 ºC bleiben. Warten Sie auf das Signal (akustischer Signalton), der anzeigt, dass der Synthesizer für die 18 F-Übertragung bereit ist. </li></ol> 3. Tag des Experiments: 18 F Etikettierung <ol><li> Fernübertragung der gewünschten Menge an Zyklotron-erzeugtem 18 F vom Zyklotron-Target auf 18 F-Durchstechflasche. Überprüfen Sie die Menge der Radioaktivität und notieren Sie sie mit dem Zeitpunkt der Lieferung. HINWEIS: Wenn Sie keine direkte Leitung für 18 F - Transfer verwenden, verwenden Sie eine vorgefüllte Spritze mit einer Nadel, die angebracht ist, um die Aktivität in die Durchstechflasche durch das Septum zu übertragen. Die Menge der anfänglichen Radioaktivität hängt von den vom Amt für Strahlensicherheit festgelegten Grenzwerten und der gewünschten Menge an Endtracer ab. Typische Menge liegt zwischen 50 und 500 mCi. </li><lI&gt; Fortsetzung der Sequenz auf dem Synthesizer durch Drücken von &quot;Fortsetzen&quot;. Damit wird die Übertragung der 18 F in die QMA eingeleitet. </li><li> Überwachen Sie die Progression der Synthese in der automatisierten Sequenz auf dem Computerbildschirm. <ol><li> Beobachten Sie die Übertragung der 18 F aus der Durchstechflasche auf die QMA für 90 s. Nach dem Fangen von 18 F - auf QMA eluiert es mit TBA-HCO 3 Lösung (Durchstechflasche 1). (Teil zwei der Sequenz) </li><li> Überwachen Sie die Druck- und Temperaturspuren auf dem Synthesizer, während der TBA 18 F unter vermindertem Druck (5 kPa) und Erhitzen (100 ºC) getrocknet wird, gefolgt von zusätzlichen Trocknungs- und Abkühlschritten. (Teil 3 der Sequenz) </li><li> Beobachten Sie die Übertragung von wasserfreiem MeCN (Fläschchen 3) und Vorläuferlösung (Fläschchen 2) in den Reaktor und wie es für 1 min bei Raumtemperatur reagiert. Die Lösung sollte farblos oder sehr schwach sein. (Teil 4 der Sequenz) </li><li> Beobachten Sie den Transfer von OxalsäureLösung (Durchstechflasche 4) zum Reaktor. Beobachten Sie, wie die Lösung aus dem Reaktor durch die Aluminiumoxid-N-Patrone in die Endprodukt-Durchstechflasche überführt wird. (Teil 5 der Sequenz) </li></ol></li><li> Am Ende der Sequenz den Bericht ausdrucken, den IFP auswerfen, die Gasbehälter abschalten und die Software schließen. </li><li> Während Sie zuerst das Verfahren festlegen, messen Sie die Radioaktivität in der Aluminiumoxid-N-Patrone und der Sammelfläschchen, indem Sie die Patrone und die Durchstechflasche separat in den Dosis-Kalibrator einführen. Notieren Sie die Aktivität und die Zeit der Messung. Legen Sie die gebrauchte Patrone in einen verbleiten Abfallbehälter. Legen Sie die Sammelfläschchen in einen geschirmten Behälter für den Transport zum nächsten Schritt. </li><li> Mit einer 1-ml-Spritze mit einer 2 &quot;-Nadel befestigt, manuell über 100 μl Probe der Zwischenproduktlösung in eine Standard-HPLC-Durchstechflasche für die In-Prozess-Qualitätskontrolle. Injizieren Sie 10 μl dieser Probe in die HPLC, um die Reinheit zu bewerten Identität der intermeDiatverbindung HINWEIS: HPLC-Bedingungen: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 Säule. Durchfluss 4 mL / min. Mobile Phase (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisch 15 min. </li></ol> 4. Tag des Experiments: Hydrierung ACHTUNG: Die Einspritzung des Produkts in den Hydrator muss mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden. Wasserstoffgas muss ordnungsgemäß gehandhabt und entlüftet werden. HINWEIS: Der Hydrierungsreaktor kann anstelle der HPLC-Säule auf dem Synthesizer angeschlossen und mit der Synthesizer-Software gesteuert werden. <ol><li> Stellen Sie den Hydriermittelfluss mit 0,5 mL / min ein, indem Sie die Synthesizer-HPLC-Sequenz starten. Manuelles Einrichten des Wasserstoffdrucks auf 50 psi. <ol><li> Nach Beendigung der Etikettier- und Abschreckstufen überträgt der Synthesizer die Zwischenproduktlösung in Hydrier- / HPLC-Schleife. </li></ol></li><li> Wenn der radioaktive Peak auf der HPL erscheintC Software schaltet das Sammelventil ein, um das Produkt zu sammeln. Messen Sie die Radioaktivität des Rohprodukts mit einem Dosiskalibrator. HINWEIS: Das Rohprodukt sollte in ein automatisiertes HPLC-System in einer heißen Zelle injiziert werden. Nach der Reinigung wird das Endprodukt dann gesammelt und in eine aseptische ISO-Klasse 5 laminare Luftströmungs-Heißzelle gemäß USP- und FDA-Vorschriften abgegeben. </li></ol> 5. Tag des Experiments: Reinigung und Vorbereitung der Dosis <ol><li> Injizieren Sie Rohprodukt in die HPLC und verwenden Sie den automatisierten Fraktionssammler, um die Fraktionen zu sammeln, die dem Endproduktpeak entsprechen. Jede Röhre enthält 0,66 ml Lösung. HINWEIS: HPLC-Bedingungen: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 Säule. Durchfluss 4 mL / min. Mobile Phase (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisch 15 min. 4-15 min sammeln </li><li> Messen Sie die Radioaktivität jeder Fraktion mit einem Dosis-Kalibrator und notieren Sie sie. Kombinieren Sie die Fraktionen mit der höchsten MengeS der Radioaktivität (typischerweise Röhrchen 14-18). </li><li> Ziehen Sie die Produktlösung mit einer 10 ml Spritze und führen Sie die Probe durch 0,22 μm Filter in eine sterile Durchstechflasche. Notieren Sie die Menge an Radioaktivität, Ende der Synthesezeit und Lösungsvolumen auf dem Fläschchenetikett. Dies ist die endgültige Dosis für die Injektion. Beiseite legen ~ 0,8 mL der Lösung für Qualitätskontrolle Tests. </li></ol> 6. Tag des Experiments: Qualitätskontrolle (QC) Tests <ol><li> Vor der Freisetzung: Überprüfen Sie die Dosis durch Blei-geschirmtes Glas. Die Lösung muss klar, farblos und frei von Partikeln sein. </li><li> Radiochemische Identität: <ol><li> Für RadioTLC: Spot einen Tropfen der Probe auf einer TLC-Platte Seite an Seite mit dem Referenzstandard. Führen Sie die TLC-Platte auf einer DC-Kammer mit 95% MeOH: 5% Essigsäure. Den Referenzstandard unter UV-Beleuchtung visualisieren und mit Bleistift markieren. </li><li> Tip die TLC-Platte auf die Stufe des RadioTLC ScannsEr und Rekordzeit des Gipfels. R f -Werte des Referenzstandards und des radioaktiven Peaks müssen innerhalb von 5% übereinstimmen. </li><li> Für RadioHPLC: 10 μl der Dosis mit und ohne Referenzstandard auf der HPLC durchführen. Die Retentionszeit des Referenzstandards und der radioaktive Peak müssen übereinstimmen. Ein einziger Coelution-Peak muss auf der Stachelprobe gesehen werden. </li></ol></li><li> Für radiochemische Reinheit: Messen Sie den Bereich unter Kurve für die radioHPLC und radioTLC Zielspitzen. Der Bereich der Zielspitze muss&gt; 95% der Fläche für alle radioaktiven Spitzen sein. </li><li> Für die spezifische Radioaktivität: Berechnen Sie die spezifische Radioaktivität als die Menge an Radioaktivität im Peak (gemessen in Schritt 5.2) über die Massenmenge, die aus dem Bereich unter der Kurve der UV-HPLC-Spur bestimmt wird, mit einer vorgegebenen Eichkurve. Die spezifische Radioaktivität muss höher als 50 mCi / μmol sein. </li><li> Für die restliche Lösemittelanalyse: die Menge des Restlösels messenTs (MeCN, MeOH) in der Dosis mittels Gaschromatographie. Die Lösungsmittelniveaus müssen &lt;0,04% für Acetonitril und &lt;3.000 ppm für Methanol sein. Die Menge an EtOH muss weniger als 10% w / v betragen. </li><li> Für den Sterilfilter-Integritätstest (Blasenpunkt): Verbinden Sie den in Schritt 5.3 verwendeten Filter mit einer Stickstoffversorgung, die mit einem Druckregler ausgestattet ist, und tauchen Sie die Nadel in Wasser ein. Allmählich das Gasventil öffnen, während man das Manometer beobachtet. Der Filter sollte Druck bis zu 50 psi widerstehen, ohne zu zerreißen, wie durch das Fehlen eines Stroms von Blasen von der Nadel belegt wird. Erhöhen Sie den Druck über 50 psi, bis ein Strom von Blasen aus der Nadel kommt. Notieren Sie diesen Druck, es ist der Berstdruck und es muss&gt; 50 psi sein. </li><li> Für die Radionuklid-Halbwertszeit: Messung der Radioaktivität des Produkts zu zwei Zeitpunkten ≥10 min auseinander in einem Dosis-Kalibrator. Berechnen Sie die Halbwertszeit mit der folgenden Gleichung. Die Halbwertszeit muss mit der von 18 F innerhalb von 5 Minuten übereinstimmen (109 ± 5 min): T ½ berechnet = 0,693 t ÷ ln (A 1 / A 2 ) Wobei t das Intervall zwischen den Messungen und A 1 , A 2 die zu jedem Zeitpunkt gemessene Aktivität ist. </li><li> Für die radionuklidische Identität und Reinheit: das γ-Strahlenspektrum einer Probe des Produktes mit einem Gammazähler erhalten. Das Spektrum sollte einen einzigen Foto-Peak bei einer Energie von 511 keV aufweisen. Es sollten keine anderen Foto-Peaks im Spektrum vorhanden sein. </li><li> Für die Endotoxinanalyse: Messen Sie die Endotoxinspiegel mit einem LAL-chromogenen Endotoxin-Quantifizierungstest. Endotoxinspiegel müssen &lt;1,75 EU / ml für ein 1: 10 verdünntes Produkt mit einem Endproduktvolumen von 10 ml betragen. </li><li> Dokumentieren Sie die Ergebnisse von jedem QC-Test. Lassen Sie die Dosis für Tierversuche nur, wenn alle Tests bestanden haben. </li><li> Post-Dose-Freisetzung: Für den Sterilitätstest: Fügen Sie eine Probe der Dosis sowohl zu flüssigem Thioglycolat als auch zu Trypticase hinzuSoja-Brühe. Nach 14 Tagen ist kein Wachstum auf den Medien zu sehen. </li></ol> 7. Tag des Experiments: Berechnungen (Tabelle 1) <ol><li> Für die nicht zerfallkorrigierte radiochemische Ausbeute (ndc RCY): berechnen Sie das ndc RCY als die Menge an Radioaktivität im Endprodukt über die Ausgangs-Radioaktivität. </li><li> Für die Radiomarkierungseffizienz: Berechnen Sie die Markierungsausbeute als Verhältnis der Radioaktivität in der Sammelfläschchen über die Radioaktivität in der Aluminiumoxid-N-Patrone (uneingetragene [ 18 F] F - ) und der Sammelfläschchen. </li><li> Für die Hydrierungsausbeute: Berechnen Sie die Hydrierungsausbeute als die Menge an Radioaktivität in dem gewünschten Peak über die in die HPLC injizierte Radioaktivität. </li><li> Für die Filterverluste: Die Filterung verliert, da die Radioaktivität im Filter verbleibt und vor der Filterung über Radioaktivität spritzt. </li></ol>

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Vorbereitung von PET-Tracern erfordert eine effiziente Etikettierung mit minimalem Eingriff des Benutzers zur Minimierung der Strahlenbelastung 14 . Hier haben wir das erste halbautomatisierte Verfahren zur radiochemischen Synthese von [ 18 F] 3F4AP, einem PET-Tracer, der derzeit zur Bildgebung der Demyelinisierung untersucht wird, beschrieben. Diese halbautomatisierte Methode erzeugt den Radiotracer mit hoher Reinheit und ausreichender spezifischer Aktivität für Tierversuche. Bisherige Verfahren zur Synthese dieser Verbindung beruhten auf der manuellen Synthese 6 , was die Menge an radioaktivem Tracer, die produziert werden kann, signifikant begrenzt. Mit einer automatisierten Methode für die Synthese bietet auch mehr reproduzierbare Ausbeuten und macht es einfacher, das Verfahren in andere Laboratorien mit ähnlichen Geräten zu übertragen. Zukünftige Bemühungen, das Verfahren vollständig zu automatisieren, werden für die Produktion des Tracers in hohen Mengen für Studien bei großen Tieren oder Menschen maßgeblich sein. 19 F für 18 F, um das Radioisotop in das interessierende Molekül zu integrieren. Die Vorteile dieser Reaktion sind, dass es schnell ist und fast ausschließlich das gewünschte Produkt produziert, ohne dass ein potentiell langwieriger Reinigungsschritt durchgeführt werden muss, um den Überschuss des Vorläufers zu entfernen. Eine Einschränkung der Verwendung von Fluorid-Austausch-Markierungsreaktionen, wie die hier verwendete, ist, dass aufgrund der anfänglichen Masse der kalten Verbindung die endgültige spezifische Aktivität, die als die Menge an Radioaktivität in mCi über die Menge der Verbindung in μmol definiert ist, begrenzt sein kann. Unter unseren Standardbedingungen, beginnend mit 100-200 mCi von 18 F - und 50 μg Vorläufer, beträgt die typische spezifische Aktivität am Ende der Synthese bis zu 100-200 mCi / μmol, was für präklinische PET-Bildgebungsstudien ausreichend erscheint . Trotzdem kann sich die spezifische Aktivität durch Erhöhung des Ausgangsbetrags für 18 F - </suP&gt; während die Massenmenge niedrig gehalten wird. Es gab mehrere Berichte über die Herstellung von Radioliganden durch Fluoridaustausch mit hoher spezifischer Aktivität (1-3 Ci / μmol), beginnend mit hoher Aktivität und niedrigen Vorläufermengen 15 , 16 . Wie bei allen radiochemischen Synthesen von PET-Tracern ist es entscheidend, schnell zu arbeiten, um den radioaktiven Zerfall zu minimieren. Es ist auch wichtig, die zeitliche Handhabung der radioaktiven Materialien zu minimieren, die richtige Abschirmung zu verwenden und den Abstand zwischen dem radioaktiven Material und dem Benutzer zu maximieren, um die Strahlenbelastung zu minimieren. Diese Aspekte sind besonders wichtig während der zweiten Hälfte des Protokolls (Reinigung und Qualitätskontrolle), in denen der Benutzer die Lösung manuell in die HPLC injizieren muss, die Fraktionen sammeln und das Endprodukt filtern. Wie bei allen radiochemischen Synthesen von PET-Tracern ist es entscheidend, schnell zu arbeiten, um mRadioaktiven Zerfall einatmen. Es ist auch wichtig, die zeitliche Handhabung der radioaktiven Materialien zu minimieren, die richtige Abschirmung zu verwenden und den Abstand zwischen dem radioaktiven Material und dem Benutzer zu maximieren, um die Strahlenbelastung zu minimieren. Diese Aspekte sind besonders wichtig während der zweiten Hälfte des Protokolls (Hydrierung und Reinigung), in denen der Anwender die Lösung manuell in den Hydrierer einspritzen, die Fraktionen sammeln, den Trocknungsvorgang aufstellen, das Produkt in Puffer wieder auflösen und filtrieren muss. Während des Filterungsschrittes ist es leicht, eine große Menge an radioaktivem Material in den Wänden der Fläschchen zu verlieren. So ist es wichtig zu versuchen, die gesamte Flüssigkeit vor dem Filtern zu sammeln. Die Verwendung einer größeren Menge an Puffer, um sich aufzulösen, kann die Ausbeute an Erholung verbessern, aber seine Verwendung wird entmutigt, da es erforderlich ist, ein größeres Volumen auf die HPLC zu injizieren, wodurch der Peak erweitert und das Volumen der Enddosis erhöht wird. Um ein Problem zu behebenNd optimieren die Prozedur ist wichtig, um die Ausbeuten der einzelnen Schritte zu verfolgen. Für die meisten Schritte erfolgt dies einfach durch Messung der Menge an Radioaktivität vor und nach jedem Schritt. Im Falle der Reaktion können die Ausbeuten durch Quantifizierung der HPLC-Peaks berechnet werden. Tabelle 1 im Ergebnisbereich zeigt die typischen Ausbeuten für jeden Schritt. Tabelle 2 unten listet viele der häufig angetroffenen Fehler mit möglichen Gründen für das Versagen auf und wie man sie korrigiert. Schließlich ist, obwohl das hier vorgestellte Verfahren für die Synthese von [ 18 F] 3F4AP spezifisch ist, der allgemeine Arbeitsablauf und viele der einzelnen Schritte der Synthese anderer Verbindungen gemeinsam. In diesem Artikel haben wir auch die typischen QC-Tests auf jedem PET-Tracer durchgeführt.

Die Fähigkeit, ein kleines Molekül-Medikament nicht-invasiv innerhalb des menschlichen Körpers zu verfolgen, hat ein großes Potenzial für Präzisionsmedizin. Unter den molekularen Bildgebungsverfahren hat die Positronenemissionstomographie (PET) viele günstige Eigenschaften: Die hohe Empfindlichkeit von PET-Detektoren ermöglicht die Detektion und Quantifizierung von sehr geringen Mengen an radioaktivem Material und die Eigenschaften der Scanner ermöglichen eine genaue räumliche Abbildung der Arzneimittellokalisation 1 , 2 , 3 Beispielsweise ermöglicht PET die Detektion und Lokalisierung von Tumoren und Metastasen auf der Grundlage der Aufnahme eines radioaktiven Glukose-Analogons [ 18 F] FDG 4 . PET kann auch Lokalisation und Quantifizierung von spezifischen Hirnrezeptoren und deren Belegung bereitstellen, die für die Diagnose und das Verstehen neurologischer und psychiatrischer Störungen wertvoll sein können. Um zu entwickelnEin kleiner Molekül-PET-Tracer, muss die interessierende Verbindung mit einem Positronen emittierenden Isotop, typischerweise 11 C oder 18 F, markiert werden. Zwischen diesen beiden Radioisotopen hat 18 F eine längere Halbwertszeit (109 min gegen 20,3 für 11 C) , Die eine Mehrfachdosis- und Offsite-Produktion ermöglicht. Trotzdem kann das Hinzufügen von 18 F zu einem Molekül schwierig sein. 18 F-Etikettierung erfordert schnelle Reaktionen, die mit der Automatisierung kompatibel sind, wodurch der Chemiker die direkte Handhabung der Aktivität erleichtert und hochabsorbierte Strahlendosen empfängt. Wir haben vor kurzem die Verwendung von Pyridin-N-Oxiden als Vorläufer für die Fluorierung von Pyridinen und die Verwendung dieser Chemie in der radiochemischen Synthese von [ 18 F] 3F4AP 6 beschrieben, ein radiofluoriertes Analogon des FDA-zugelassenen Arzneimittels für Multiple Sklerose, 4- Aminopyridin (4AP) 7 , 8 , 9 ThIst neuartiger Radiotracer wird derzeit als PET-Tracer zur Demyelinisierung 10 , 11 , 12 untersucht. In diesem Videoprodukt demonstrieren wir die halbautomatisierte Synthese dieser Verbindung unter Verwendung einer IBA Synthera Synthese Unit (im Folgenden als &quot;Synthesizer&quot; bezeichnet) und einer eigens entwickelten Strömungshydrierungsvorrichtung. Die Synthese basiert auf der in Abbildung 1 dargestellten Reaktion. Die Vorbereitung für das Verfahren dauert ca. 1 h, Radiomarkierung und Reinigung 1,5 h und Qualitätskontrollverfahren 0,5 h.

<table><tbody><tr><td>Zyklotron hergestellt [18F]Fluorid</td><td>Haus geliefert/Zevacor</td><td>IBA Zyklon 18</td><td>100-200 mCi</td></tr><tr><td>Integrierter Fluidprozessor für die Produktion FLT/FDG</td><td>ABX</td><td>K-2715SYN</td><td>Kassette zur nukleophilen Substitution</td></tr><tr><td>Wasserfreies Acetonitril</td><td>Janssen</td><td>36431-0010</td><td>Transfer unter Stickstoff</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Janssen</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>hausgeliefert</td><td></td><td>Millipore MilliQ System</td></tr><tr><td>TBA-HCO3</td><td>ABX</td><td>808.0000.6</td><td>abx.de</td></tr><tr><td>QMA</td><td>Waters</td><td>WAT023525</td><td>Quartäres Methylammonium: Anionenaustauscher-Festphasenextraktionskartusche zum Auffangen und Freisetzen von 18F- aus dem Zielwasser</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>ABX</td><td>K-28XX.03</td><td>Vorgefüllte 5-ml-Spritzen</td></tr><tr><td>Aluminiumoxid-N-Wasser</td><td></td><td>WAT020510</td><td>Aluminiumoxid-N-Festphasenextraktionskartusche (zum Auffangen von nicht umgesetzten 18F-)</td></tr><tr><td>3-Fluor-4-nitropyridin-N-oxid</td><td>Synthonix</td><td>76954-0</td><td>Im Exsikkator aufbewahren. Vorläufer</td></tr><tr><td>3-Fluor-4-aminopyridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>704490-1G</td><td>Referenzstandard</td></tr><tr><td>Oxalsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75688-50G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S80191-1</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04885-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>DSP-MD.43</td><td>USP</td></tr><tr><td>Endproduktfläschchen</td><td>ABX</td><td>K28XX.04</td><td></td></tr><tr><td>Millex Filterspritze</td><td>Millex</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>10% Pd/C Kartusche</td><td>Sigma Aldrich</td><td>THS-01111-12EA</td><td></td></tr><tr><td>11 mm Fläschchen + Bördeldichtungen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>03-250-618, 06-451-117 oder gleichwertige</td><td></td></tr><tr><td>13-mm-Fläschchen + Bördelverschlüsse</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-718-992, 06-718-643 oder gleichwertige</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Fläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-16, 03-391-17 oder gleichwertige</td><td></td></tr><tr><td>SEMIPREP C18-Säule</td><td>Agilent</td><td>990967-202</td><td></td></tr><tr><td>V-Fläschchen</td><td>Alltech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzen: 1, 3, 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G oder gleichwertig</td><td></td></tr><tr><td>Komprimierte Gase: N2, He, H2</td><td>Airgas</td><td>UHP N300, UHP HE300, UHP H300 oder gleichwertige</td><td></td></tr><tr><td>DC-Platten</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z193275 oder gleichwertige</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalog Anzahl</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthera automatisierter Synthesizer</td><td>IBA SA, Belgien, iba-worldwide.com</td><td>Synthera, 250.001</td><td>Automatische Syntheseeinheit</td></tr><tr><td>Hauseigener Hydrator</td><td>Siehe Bild</td><td></td><td>Siehe Text Beschreibung</td></tr><tr><td>Heiße Zellen</td><td>Comecer</td><td></td><td>For Manipulation von radioaktivem Material</td></tr><tr><td>RadioTLC-Scanner</td><td>Eckert und Ziegler</td><td></td><td>Für den Umgang mit sterilem Material</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>Dosiskalibrator</td><td>Capintec</td><td>CRC15</td><td>Oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Gamma-Zähler</td><td>Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932</td><td>CRC 15, PET-CRC25 oder gleichwertig</td><td>Zur Messung der Radioaktivität</td></tr><tr><td>Personendosimeter</td><td>Packard</td><td>Cobra II</td><td>Zur Messung des Gammaspektrums</td></tr><tr><td>Persönliche Strahlungsabzeichen und -ringe</td><td>Atlantic Nuclear</td><td>Rados Rad-60 Elektronisches Dosimeter oder gleichwertig</td><td></td></tr><tr><td>Rotavap + Vakuumpumpe</td><td>Landauer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleimolche + Spritzenschutzschilde</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Geigerzähler</td><td>Pinestar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geigerzähler</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 + Pancake GM Detektor, 4801605, 47-1539 oder gleichwertig</td><td></td></tr></tbody></table>

automatisierte radiochemische synthese von [<sup&gt; 18</sup&gt; f] 3f4ap: ein neuartiger pet-tracer zur bildgebung von demyelinisierenden krankheiten

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3- [ 18 F] fluor-4-aminopyridin, [ 18 F] 3F4AP, ist ein radiofluoriertes Analogon des FDA-zugelassenen Arzneimittels für Multiple Sklerose 4-Aminopyridin (4AP). Diese Verbindung wird derzeit als PET-Tracer zur Demyelinisierung untersucht. Wir haben vor kurzem eine neuartige chemische Reaktion beschrieben, um metafluorierte Pyridine herzustellen, die aus einer direkten Fluorierung eines Pyridin-N-Oxids und der Verwendung dieser Reaktion für die radiochemische Synthese von [ 18 F] 3F4AP bestehen. In diesem Artikel zeigen wir, wie man diesen Tracer mit einem automatisierten Synthesizer und einem hauseigenen Durchfluss-Hydrierungsreaktor herstellt. Wir zeigen auch die Standard-Qualitätskontrollverfahren, die vor der Freisetzung des Radiotracers für präklinische Tierbildgebungsstudien durchgeführt wurden. Dieses halbautomatisierte Verfahren kann als Grundlage für die zukünftige Produktion von [ 18 F] 3F4AP für klinische Studien dienen.

Die radiochemische Synthese von [ 18 F] 3F4AP besteht aus zwei Schritten (Abbildung 1 ). Der erste Schritt wird vollautomatisch mit der Syntheseeinheit durchgeführt (Abbildung 3 ). Dieses kassettenbasierte System verwendet vier Reagenzgefäße und eine Reaktorfläschchen und verfügt über computergesteuerte Ventile, die den Transfer und das Mischen von Reagenzien sowie die Erwärmung, Druckbeaufschlagung und Evakuierung des Reaktors ermöglichen. Darüber hinaus unterstützt es Standard-Festphasen-Extraktionskartuschen zur Trennung von Reagenzien. Die Computerschnittstelle ermöglicht es Benutzern, Skripte zu schreiben und zu modifizieren, um eigene Synthesen auszuführen. Im Falle von [ 18 F] 3F4AP besteht das Syntheseverfahren aus fünf Grundteilen. Im ersten Teil führt der Synthesizer Selbstkontrollschritte durch, wärmt den Reaktor vor und wartet auf das Signal des Bedieners, dass die 18 F bereit sind. Während des zweiten Teils wird das [ 18 F] Fluorid übertragenM die 18 F-Durchstechflasche in die Anionenaustauschpatrone geben und aus der Kartusche in den Reaktor unter Verwendung einer Lösung Tetrabutylammoniumbicarbonat eluieren. Der dritte Teil, der Synthesizer azeotropisch trocknet das [ 18 F] Fluorid unter Vakuum, um es reaktiv gegenüber nukleophilen Verschiebung zu machen. Im vierten Teil wird der Vorläufer automatisch dem Reaktor zugesetzt, wo er mit dem 18 F - reagiert, um die markierte Verbindung zu erzeugen. Schließlich wird die Reaktion durch Zugabe von 0,2% Oxalsäure in Methanol abgeschreckt, was eine Base-geförderte Zersetzung des Produkts verhindert, und die endgültige Lösung wird nach Durchlaufen einer Aluminiumoxid-N-Patrone, die irgendwelche einfließt, auf das Sammelfläschchen übertragen Nicht umgesetztes Fluorid Nachdem der Etikettierungsschritt abgeschlossen ist, kann eine kleine Probe zur Qualitätskontrolle genommen werden. Das Ausführen einer Probe auf der HPLC gibt Bestätigung an, dass der Etikettierungsschritt funktioniert und ein SchätzwertOn der radiochemischen Reinheit (Abbildung 4 ). Auch aus der UV-Spur auf der HPLC kann die Massenmenge des Produktes mit einer vorgegebenen Eichkurve berechnet werden. Während die in Betrieb befindliche Qualitätskontroll-HPLC läuft, wird der zweite Reaktionsschritt, die Reduktion der N-Oxid- und Nitrogruppen, durchgeführt. Um dies zu erreichen, wird das markierte Produkt automatisiert in eine hauseigene Hydrierungsvorrichtung auf der Grundlage der von Yoswathananont et al. 13 ( Fig. 2 ). Diese Vorrichtung besteht aus einer HPLC-Pumpe und einem komprimierten Wasserstofftank, der mit der Durchfluss-Hydrierungsvorrichtung verbunden ist, durch Leitungen, die mit Rückschlagventilen ausgestattet sind, um ein Rückströmen zu verhindern. Das Produkt wird durch die HPLC-Pumpe geschoben und mit Wasserstoff in einem T-förmigen Mischer vermischt. Diese Mischung wird dann durch eine kleine Patrone geführt, die 10% Pd / C-Katalysator auf einem festen Träger enthält. Nach dem Durchlaufen der CataLyst das reduzierte Produkt wird dann in kleinen Fraktionen gesammelt. Nach der Hydrierung wird das Rohprodukt zur Reinigung des Endprodukts transportiert und manuell in die HPLC injiziert (Abbildung 5 ). Die mobile Phase der HPLC wurde so ausgewählt, dass sie mit der Tierinjektion kompatibel ist. Die dem Produkt entsprechenden Peaks werden dann gesammelt und filtriert-sterilisiert, um die endgültige Dosis zu erhalten. Vor der Freisetzung der Dosis für PET-Imaging-Studien werden Qualitätskontrolltests durchgeführt. Diese Tests werden durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Tracer die chemische Einheit ist, die es sein soll und dass es für die Injektion sicher ist. Einige dieser Tests sind möglicherweise nicht für die Injektion in Tiere erforderlich, aber es wird allgemein empfohlen, den Richtlinien für die menschliche Verwendung zu folgen. Damit sorgt die Qualität des Produktes, was das Vertrauen in die Ergebnisse erhöht und stark fokussiertIlitiert den künftigen Übergang zur Herstellung des Produkts für die menschliche Injektion. Tabelle 1 enthält die typischen Syntheseparameter einschließlich Anfangsmenge Radioaktivität, Anfangsmenge des Vorläufers, Ausbeute für jeden Schritt, spezifische Aktivität, Filterung verliert, etc. Diese Parameter sind nützliche Fehlerbehebung gelegentliche Ausfälle und zukünftige Optimierung des Verfahrens. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig1.jpg" /> Abbildung 1. Reaktionsschema. Die radiochemische Synthese besteht aus der Markierung durch 19 F / 18 F-Austausch, gefolgt von einer palladiumkatalysierten Hydrierung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2"<html> Src = &quot;/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Hydrierungssystem. Schema des Gerätes. Dieses Gerät basiert auf der Veröffentlichung von Yoswathananont et al. (Ref 13). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schema des Synthesizer-integrierten fluidischen Prozessors (IFP) und Reagenzien. IFP enthält vier Reagenzgefäße, eine QMA-Patrone und eine Reaktor-Durchstechflasche. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig4.jpg" /> Abbildung 4. UV- und RadioHPLC-Tracer für Zwischenprodukt. 3-fluor-4-nitropyridin-N-oxid hat eine charakteristische Absorption bei 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig5.jpg" /> Abbildung 5. UV- und RadioHPLC-Tracer für Endprodukt. 3-fluor-4-aminoopyridin absorbiert bei 254 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Konzept </td><td> Mittler (n = 4) </td><td> SD </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> Anfängliche 18 F-Aktivität (mCi) </td><td> 148,0 </td><td> 44,9 </td><td> Beginn der Synthese </td></tr><tr><td> Vorläufermenge (μg) </td><td> 50 </tD&gt; <td></td><td> Verwenden Sie 50 μl 1,0 mg / mL Lager </td></tr><tr><td> Aktivität in QMA (mCi) </td><td> 3,0 </td><td> 1.7 </td><td> Gemessen am Ende des Etikettierungsschrittes </td></tr><tr><td> Radiomarkierungsausbeute </td><td> 29,7% </td><td> 6,3% </td><td> Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) </td></tr><tr><td> Radiochemische Reinheit (HPLC-1) </td><td> &gt; 98% </td><td></td><td> Von HPLC-1 QC </td></tr><tr><td> Spez. Handlung. Zwischenprodukt (mCi / μmol) </td><td> 122.9 </td><td> 29.7 </td><td> Von HPLC-1 mit Kalibrierkurve </td></tr><tr><td> Hydrierungsrückgewinnung (dc) </td><td> 74% </td><td> 9,0% </td><td> Für den Verfall korrigiert </td></tr><tr><td> HPLC-radiochemische Reinheit (HPLC-2) </td><td> 90,7% </td><td> 2,9% </td><td> Berechnet aus HPLC-2 </td></tr><tr><td> Trocknungseffizienz </td><td> &gt; 98% </td><td></td><td> Für den Verfall korrigiert </td></tr><tr><td> Filterwiederherstellung </td><td> 93,5% </td><td> 1,7% </td><td> Für den Verfall korrigiert </td></tr><tr><td> Dosisvolumen (ml) </td><td> 3.3 </td><td></td><td> Sammeln Sie Fraktionen mit höchster Radioaktivität </td></tr><tr><td> Spez. Handlung. Endprodukt (mCi / μmol) </td><td> 75,5 </td><td> 30.0 </td><td> Von HPLC-3 mit Kalibrierkurve </td></tr><tr><td> Syntheseeffizienz </td><td> 8,5% </td><td> 3,6% </td><td> Nicht-Zerfall korrigiert </td></tr><tr><td> Synthesezeit (min) </td><td> 104. </td><td> 11.2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Radiochemische Syntheseparameter <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Allgemeine Probleme </td><td> Mögliche Gründe und Lösungen </td></tr><tr><td rowspan="3"> [ 18 F] Fluorid wird nicht effizient aus dem QMA eluiert </td><td> · TBA-HCO 3 wurde nicht richtig vorbereitet. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration ausreichend ist. </td></tr><tr><td> · Es gibt Lecks auf der TBA-HCO 3 Durchstechflasche. Achten Sie darauf, dass die Crimpdichtung fest sitzt und das Septum nicht vor dem Einbau auf dem IFP durchbohrt wird. </td></tr><tr><td> · TBA-HCO 3 ist nicht in gutem Zustand. Bestellen Sie eine neue Charge. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Die Markierungsausbeute ist gering </td><td> · Es gibt Feuchtigkeit in der Vorläuferlösung. Trockener Vorläufer und Lösungsmittel. </td></tr><tr><td> · Die Temperatur ist zu niedrig. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Reaktionslösung ist gelb </td><td> · Das Produkt zersetzt sich aufgrund der Basis. Verwenden Sie weniger TBA-HCO 3 . </td></tr><tr><td> · Es gibt tOo viel Vorläufer. Verwenden Sie weniger Vorläufer. </td></tr><tr><td> · Es gibt zu wenig Lösungsmittel für die Menge von 18 F - . Verwenden Sie mehr Lösungsmittel. </td></tr><tr><td> Zusätzliche Spitzen auf radioHPLC </td><td> · Nitro-Gruppe wird substituiert: reduzieren die Reaktionstemperatur oder verkürzen die Reaktionszeit. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Die Hydrierungsreaktion funktioniert nicht </td><td> · Katalysator ist nicht gut Verwenden Sie eine neue Patrone. </td></tr><tr><td> · Der Durchfluss ist zu schnell und erlaubt keinen ausreichenden Kontakt zwischen Katalysator und Substrat. Abfluss verringern </td></tr><tr><td> · Der Wasserstoffdruck ist zu niedrig. H 2 Druck erhöhen </td></tr><tr><td> Der Wasserstoffdruck steigt während des Verfahrens dramatisch an </td><td> · Die Patronenintegrität ist kompromittiert und die feste Unterstützung verstopft die Linien. Stoppen Sie den Fluss und schalten Sie das Gas ab. Lassen Sie Radioaktivität abklingen. Entfernen Sie die Katalysatorpatrone und spülen Sie das System aus. Setzen Sie einEw Patrone </td></tr><tr><td> Die Hydrierungsausbeute ist gering </td><td> · Zu viele Verunreinigungen, die um den Katalysator konkurrieren (MeCN, Oxalsäure). Verringerung der Menge an Verunreinigungen oder Erhöhung der Masse des Vorläufers (Warnung: Erhöhung der Vorläufermenge verringert die spezifische Aktivität). </td></tr><tr><td rowspan="2"> Die Wiederherstellung der Radioaktivität aus dem Hydrierungsschritt ist gering </td><td> · Es gibt ein Leck im System. Auf Dichtheit prüfen und in die Wasserstoffleitung zurückspülen. </td></tr><tr><td> · Die Verbindung entleert sich im Reaktor. Auswertung verschiedener Reaktionsbedingungen (Druck, Temperatur, Durchfluss etc. ). </td></tr><tr><td rowspan="2"> Zu viel Radioaktivität geht während der Filtration verloren </td><td> · Den Filter vor dem Gebrauch benetzen. </td></tr><tr><td> · Verwenden Sie Filter mit einem niedrigeren Totvolumen. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Die Endproduktspitze auf der HPLC sieht breit aus </td><td> · Zu viel Volumen injiziert. Injizieren Sie tieferOunt Spalte mit größerem Durchmesser verwenden. </td></tr><tr><td> · Die Säule ist nicht gut konditioniert. Bedingung der Spalte für mindestens 30 Spaltenvolumina. </td></tr><tr><td> · Der pH-Wert der mobilen Phase ist niedrig. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert ≥ 8 ist. </td></tr><tr><td> · Die Säule ist nicht in gutem Zustand. Spalte ersetzen Verwenden Sie die Säule mit dem basischen pH-Wert. </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Fehlerbehebung.

Wir zeigen die halbautomatisierte radiochemische Synthese von [ 18 F] 3F4AP und Qualitätskontrollverfahren.

Automatisierte radiochemische Synthese von [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Ein neuartiger PET-Tracer zur Bildgebung von demyelinisierenden Krankheiten

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, F-18-markiertes 3-Fluor-4-Aminopyridin mit ausreichender Reinheit und Qualität für PET-Bildgebungsversuche an Versuchstieren herzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Bildgebung bezüglich der Eignung von 3F4AP zu beantworten, und zwar als PET-Tracer für die Gehirnbildgebung zur Detektion demyelinisierender Erkrankungen und anderer Krankheiten.Die Hauptvorteile dieser Markierungsmethode liegen in der Flexibilität der pulsradiologischen Markierungshydrierung, die an die Herstellung anderer mit F-18 markierter PET-Radiotracer angepasst werden könnte. F-18 hat eine Halbwertszeit von zwei Stunden und muss daher mit einem Zyklotron hergestellt werden, bevor es synthetisiert wird, um sicherzustellen, dass das Produkt eine ausreichende Aktivität für die Injektion aufweist.Angesichts der kurzen Halbwertszeit von Fluor-18 wird dringend empfohlen, in Gruppen von zwei oder drei Personen zu arbeiten, um sicherzustellen, dass das Verfahren schnell aber sicher durchgeführt wird. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Synthese, indem Sie neue sterile Einwegspritzen mit einem Volumen von 1 ml verwenden, um 400 µL Tetrabutylammoniumbicarbonat und 800 µL Acetonitril in ein Glasfläschchen abzugeben. Verschließen Sie das Fläschchen mit der cremefarbenen Kappe.Geben Sie 50 µL der Vorläufer-Stammlösung und 450 µL wasserfreies Acetonitril in ein im Ofen getrocknetes Gefäß und verschließen Sie den Verschluss. Verschließen Sie 500 µL wasserfreies Acetonitril in einem weiteren im Ofen getrockneten Gefäß. Geben Sie vier Milliliter 0,2% Oxalsäure in Methanol in ein weiteres Glasgefäß und verschließen Sie den Verschluss.Conditionieren Sie dann eine starke anionenaustauschende Festphasen-Extraktionskartusche mit fünf Millilitern 8,4 %iger Natriumbicarbonatlösung tropfenweise, gefolgt von fünf Millilitern ultra-reinem, deionisiertem Wasser. Conditionieren Sie eine neutrale Aluminiumoxid-Festphasen-Extraktionskartusche tropfenweise mit fünf Millilitern ultra-reinem, deionisiertem Wasser, gefolgt von fünf Millilitern 0,2 %iger Oxalsäure in Methanol. Befüllen Sie die Reagenzgefäße und die Extraktionskartuschen in den integrierten Fluidikprozessor.Schalten Sie das HPLC-Gerät ein und konditionieren Sie die Säule 30 Minuten lang mit vier Millilitern pro Minute. Während der Säulen-Konditionierung laden Sie eine 10 % Palladium-Kohlenstoff-Katalysatorpatrone in den Hydriergeräte-Patronenhalter. Rüsten Sie das Produkt-Auffangfläschchen mit der Entlüftungsnadelkomponente aus, die aus einer sterilen 20-Gauge-1,5-Zoll-Nadel besteht, die mit einem 0,22-Mikrometer-Filter verbunden ist.Verbinden Sie das Vial mit dem Hydriergerät. Öffnen Sie das Wasserstoffventil, laden Sie die HPLC-Sequenz und starten Sie das Programm, um den Durchfluss von Methanol und Wasserstoff durch die Kartusche zu initiieren. Laden Sie das IFP mithilfe der Software in den Synthesizer ein.Dann starten Sie die Software des Synthesemoduls und führen Sie Systemprüfungen durch. Schließen Sie die Heißzelle. Öffnen Sie die 3F4AP-Synthesereihe und laden Sie die Sequenz in das Synthesemodul.Benennen Sie den Syntheselauf und starten Sie die Sequenz. Überwachen Sie das Gerät und die Software während der Vorstufen der Synthese, um sicherzustellen, dass das Synthesemodul ordnungsgemäß funktioniert. Sobald der Reaktionsbehälter 65 Grad Celsius erreicht hat, ist das Modul bereit für die Abgabe von F-18 aus dem Beschleuniger. Wenn der Zyklotron die gewünschte Menge an F-18 produziert hat und das Synthesemodul bereit ist, leiten Sie das F-18 an das Modul weiter. Sobald die Aktivität auf die Empfangsflasche übertragen wurde, setzen Sie die Synthese fort, indem Sie den grünen „Weiter“-Knopf drücken. Überwachen Sie die Synthese, während das F-18 an der starken Anionenaustauscherpatrone festgehalten, in tetrabutylammoniumfluorid-F-18 umgewandelt und getrocknet wird.Setzen Sie die Überwachung der Synthese fort, während das Tetrabutylammoniumfluorid in Acetonitril gelöst wird. Das Vorläufermaterial reagiert eine Minute lang mit dem F-18-Fluorid, woraufhin die Reaktion mit der Oxalsäurelösung abgebrochen wird. Es ist hilfreich, die Markierungsleistung mittels radioaktiver HPLC sowie die Effizienz der in einer Illusion gefangenen F-18-Aktivität durch Aktivitätsmessung zu bestimmen.Doch nur, wenn eine sehr geringe Menge an Radioaktivität verwendet wird. Überwachen Sie den Durchtritt des gelöschten Reaktionsgemischs durch die neutrale Aluminiumoxid-Kartusche in die Hydriererschleife sowie die Injektion des Gemischs auf die HPLC des Hydrierers. Sammeln Sie die Rohproduktlösung aus dem Hydrierer und messen Sie die Aktivität im Vial mithilfe eines Dosis-Kalibrators. Das Rohprodukt sollte in ein Halbpräparatives HPLC-System innerhalb einer heißen Zelle injiziert werden. Nach der Reinigung wird das Endprodukt gesammelt und gemäß den Vorschriften des USP und der FDA in eine sterilen ISO-Klasse-fünf-Laminar-Flow-Hot-Zelle abgefüllt. Zur Demonstration zeigen wir die Extraktion des Rohprodukts in dieser Abfüllzelle und veranschaulichen den Reinigungsschritt mit einer geringen Menge an Aktivität.Stellen Sie das Vial in einen abgeschirmten Behälter und transportieren Sie es zum HPLC-Gerät. Geben Sie 100 Mikroliter der Rohproduktlösung auf die HPLC auf und sammeln Sie den Peak des Endprodukts mit einem automatischen Fraktionssammler. Messen Sie die Aktivität jeder Fraktion und vereinigen Sie diejenigen mit der höchsten Aktivität.Notieren Sie die Endzeit der Synthese sowie das Volumen und die Aktivität des Produkts. Entnehmen Sie aseptisch etwa 0,8 Milliliter der Produktilösung aus dem Endproduktfläschchen zur Qualitätskontrolle. Prüfen Sie das Dosisfläschchen hinter einem bleihaltigen Glasschild und vergewissern Sie sich, dass das Produkt klar, farblos und frei von partikulärem Metall ist.Tragen Sie die Probe auf einer Dünnschichtchromatographie-Platte neben einem Referenzstandard auf. Laufen Sie die Platte mit der Lösung aus 95 % Methanol und 5 % Essigsäure. Sichtbarmachen Sie den Referenzstandard mit UV-Licht und markieren Sie den Fleck mit Bleistift.Befestigen Sie die DC-Karte an einem radioaktiven DC-Scanner und notieren Sie die Peak-Zeit. Überprüfen Sie, ob die Retentionsfaktoren von Produkt und Referenz innerhalb von 5 % zueinander liegen. Geben Sie 10 Mikroliter des Produkts auf eine HPLC, die mit einem Strahlungsdetektor ausgestattet ist.Überprüfen Sie bei den Ergebnissen der radioaktiven HPLC und Dünnschichtchromatographie, ob der Produktpeak mindestens 95 % der Gesamtfläche unter allen Gammapeaks in diesem Chromatogramm ausmacht. Geben Sie 10 Mikroliter der Referenzsubstanz zur qualitätsgeprüften Produktprobe hinzu und überprüfen Sie, ob ein einzelner UV-Peak in der HPLC erscheint. Injizieren Sie 10 Mikroliter des Produkts auf eine JC, um zu überprüfen, ob der Gehalt an Restlösemittel unterhalb der festgelegten Grenzwerte liegt.Mittels Radio-TLC wird sichergestellt, dass kein dreifacher Fluorid vorhanden ist, da dieser zu verfälschenden Ergebnissen bei der PET-Bildgebung führen kann. Mittels Radio-HPLC wird die Identität bestätigt und die spezifische Aktivität berechnet. Die Gaschromatographie (GC) dient der Analyse des Gehalts an Restlösemittel.Führen Sie einen Blasenpunkttest durch, um zu überprüfen, ob der im Endproduktfläschchen verwendete Filter den Spezifikationen des Herstellers hinsichtlich der Filterintegrität entspricht oder diese überschreitet. Berechnen Sie die spezifische Aktivität und die Halbwertszeit, überprüfen Sie die radiochemische Identität und Reinheit. Führen Sie einen Sterilitätstest durch und messen Sie die Endotoxin-Konzentration.Dokumentieren Sie die Ergebnisse der Qualitätskontrolltests. Mit dieser Methode wird der Radiotracer 3F4AP durch einen automatisierten Prozess synthetisiert, bei dem ein Fluorid-Austausch gefolgt von einer Reduktion der Oxid- und Nitrogruppen stattfindet. Der Tracer wurde mit ausreichender Reinheit und spezifischer Aktivität synthetisiert, um präklinische PET-Bildgebungsstudien an Tiermodellen der Demyelinisierung durchführen zu können.Das Zwischenprodukt wurde während der Tracerentwicklung analysiert und zeigte einen charakteristischen UV-Peak bei 313 Nanometern. Das Endprodukt ließ sich am besten per HPLC bei 254 Nanometern sichtbar machen. Die beobachtete radiochemische Reinheit in der Radio-HPLC wurde durch Radio-TLC bestätigt.Diese gesamte Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da viele Schritte in chemischen oder radiochemischen Laboren nicht üblich sind. In der Regel haben Personen, die neu in diesem Verfahren sind, Schwierigkeiten, die Synthesevorschrift genau zu befolgen und die umfangreichen Qualitätskontrolltests durchzuführen. Bei der Entwicklung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Menge an vorhandener Radioaktivität vor und nach jedem Schritt zu messen, um die Reaktionsausbeute zu bestimmen.Dies sollte jedoch nur mit geringen Mengen an Radioaktivität durchgeführt werden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden. Nach der Injektion am Tier und der Bildgebung können Verfahren wie Gewebesektion und Blutentnahme durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Biodistribution und zum Metabolismus des Tracers zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis des allgemeinen Arbeitsablaufs zur Synthese und Durchführung von Qualitätskontrolltests eines PET-Tracers haben. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das ALARA-Prinzip (As Low As Reasonably Achievable) stets beachtet werden sollten. Konsultieren Sie immer Ihre Strahlenschutzstelle.

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Mikrowellen-unterstützte Ein-Topf-Synthese von N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorbenzoat ([ 18 F] SFB)

Wir beschreiben ein Protokoll für die präklinische in Vivo Verfolgung von Krebsmetastasen. Es basiert auf einem Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter Kombination von Natrium Iodid Symporter, entdeckt nichtinvasive [18F] Tetrafluoroborate-PET, und ein fluoreszierendes Protein für optimierte ex Vivo Bestätigung. Die Methode ist anwendbar für präklinische in Vivo Zelle tracking über Tumorbiologie.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Positronen-Emissions-Tomographie (PET) imaging Websites, die mehrere frühen klinischen Studien beteiligt sind brauchen robuste und vielseitige Radiotracer Fertigungskapazitäten. Mit Hilfe der Radiotracer [18F] Clofarabin als Beispiel, wir zeigen, wie die Synthese von einem Radiotracer mit einer flexiblen, Kassetten-basierte Radiosynthesizer zu automatisieren und die Synthese für die klinische Anwendung zu validieren.

Automatisierung eines Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Radiotracer Synthese Protokolls für klinische Herstellung

Wir berichten über eine effiziente Carbon-11-Radiolabeling-Technik zur Herstellung klinisch relevanter Tracer für die Positronen-Emissionstomographie (PET) mit Festphasen-Extraktionspatronen. 11 C-Methylierungsmittel wird durch eine Patrone mit Vorläufer vorinstalliert und aufeinanderfolgende Elution mit wässrim Ethanol liefert chemisch und radiochemisch reine PET-Tracer in hohen radiochemischen Erträgen.

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Die Synthese von Fluor-18 (18F) markierten Radiopharmaka für die Positronenemissionstomographie erfordert in der Regel monatelange Erfahrung. Bei der Aufnahme in einen Radiotracer ermöglicht das Siliziumfluorid-Akzeptor (SiFA) ein einfaches 18-F-Kennzeichnungsprotokoll, das unabhängig von kostspieligen Geräten und Vorbereitungstrainings ist, während gleichzeitig die benötigte Vorläufermenge reduziert und mildere Reaktionsbedingungen genutzt werden.

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Hier beschreiben wir die Radiosynthese von 1-(2-[18F]Fluorethyl)-L-Tryptophan, einem bildgebenden Mittel zur Positronen-Emissions-Tomographie zur Untersuchung des Tryptophanstoffwechsels, unter Verwendung einer ein-Topf-, zweistufigen Strategie in einem radiochemischen Synthesesystem mit guten radiochemischen Ausbeuten, hohem enantiomerenübermäßigem Überschuss und hoher Zuverlässigkeit.

Radiosynthese von 1-(2-[18F]Fluorethyl)-L-Tryptophan unter Verwendung eines Eintopf-, zweistufigen Protokolls

In diesem Artikel wird die Methodik zur radioaktiven Markierung eines humanspezifischen monoklonalen Anti-CD19-Antikörpers beschrieben und erläutert, wie er zur Quantifizierung von B-Zellen im zentralen Nervensystem und in peripheren Geweben eines Mausmodells für Multiple Sklerose unter Verwendung von In-vivo-PET-Bildgebung, Ex-vivo-Gamma-Zählung und Autoradiographie-Ansätzen verwendet werden kann.

Bildgebung von CD19+ B-Zellen in einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mausmodell mit Positronen-Emissions-Tomographie

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Automatisierte radiochemische Synthese von 18 F 3F4AP: Ein neuartiger PET-Tracer zur Bildgebung von demyelinisierenden Krankheiten (Video) | JoVE Journal

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