NMR-Spektroskopie als robustes Werkzeug für die schnelle Bewertung des Lipidprofil von Fischöl
1. Mai 2017
Hier hochauflösenden 1 H und 13 C - Kernresonanzspektroskopie (NMR) wurde als ein schnelles und zuverlässiges Werkzeug für die quantitative und qualitative Analyse von verkapselten Fischölergänzungen verwendet.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das Lipidprofil von Fischölzusätzen mittels Kernspinresonanzspektroskopie zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen für die Lipidanalyse zu beantworten, wie z. B. den Lipidgehalt von Fischölzusätzen und die Positionsverteilung verschiedener Fettsäuren auf dem Glycerinskelett. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die schnelle und robuste Analyse mehrerer verschiedener Moleküle in einem Schnappschuss ermöglicht, ohne dass Trenn- und Aufreinigungsschritte erforderlich sind.
Um die Proben für die Protonen- und Kohlenstoff-NMR-Analyse vorzubereiten, extrahieren Sie zunächst 120 Mikroliter, das sind etwa 110 Milligramm Fischöl, mit einer Spritze aus einer Diätkapsel und geben Sie sie in ein 4-ml-Glasfläschchen. Notieren Sie das Gewicht des Fischöls. Verwenden Sie 500 Mikroliter einer BHT-Stammlösung, um 100 Milligramm plus oder minus 10 Milligramm Fischöl aufzulösen.
Nachdem Sie das Öl aufgelöst haben, geben Sie die gesamte Lösung direkt in ein hochwertiges Fünf-Millimeter-NMR-Röhrchen und bringen Sie eine Kappe an. Analysieren Sie die Proben innerhalb von 24 Stunden nach der Vorbereitung der Proben. Setzen Sie den NMR-Schlauch in eine Spinnerturbine ein.
Platzieren Sie den Spinner und das Rohr auf der Oberseite eines abgestuften Tiefenmessers und drücken Sie vorsichtig auf die Oberseite des Rohrs, bis der untere Teil den Boden des Messgeräts berührt. Platzieren Sie dann das NMR-Röhrchen an einer offenen Stelle des Probengehäuses. Notieren Sie sich die Steckplatznummer, in der sich das Muster befindet.
Um die Probe in das NMR-Gerät zu laden, kehren Sie zum Steuercomputer zurück und geben Sie SX-number ein, wobei number der Schlitz im Probenkoffer ist, in dem sich die Probe befindet. Warten Sie, bis das Deuteriumsignal von deuteriertem Chloroform auf dem Bildschirm erscheint. Sobald das Deuteriumsignal sichtbar ist, geben Sie lock" in der Befehlszeile ein und wählen Sie deuteriertes Chloroform aus der Lösungsmittelliste aus, um die Probe anhand ihrer Deuteriumresonanz zu sperren.
Geben Sie bsmsdisp" in die Befehlszeile ein, um sicherzustellen, dass das Drehen nicht aktiv ist. Wenn die Schaltfläche "Drehen" grün ist, klicken Sie darauf, um das Drehen zu deaktivieren. Nachdem Sie den Befehl new" eingegeben haben, um einen neuen Datensatz zu erstellen, geben Sie auf der Registerkarte "Name" einen Namen für den Datensatz und auf der Registerkarte "Experimentnummer" die Experimentnummer mit dem Namen EXPNO ein.
Verwenden Sie die Nummer eins auf der Registerkarte Prozessnummer mit dem Titel PROCNO. Schreiben Sie den Titel des Experiments auf die Registerkarte TITEL. Klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Auswählen und wählen Sie die C13IG-Parameterdatei aus.
Klicken Sie dann auf Ausgewähltes Element im Editor festlegen"und klicken Sie auf OK. Geben Sie getprosol" in die Befehlszeile ein, um die Standardparameter für die aktuelle NMR-Sonde und das Lösungsmittel zu erhalten. Geben Sie dann den Befehl atma" ein, um eine automatische Abstimmung und Anpassung der Sonde sowohl für Kohlenstoff- als auch für Protonenkerne durchzuführen. Führen Sie anschließend ein eindimensionales Gradienten-Shimming durch, um ein hochhomogenes Magnetfeld und damit eine optimale Linienform für die NMR-Signale zu erreichen.
Um dies zu tun, verwenden Sie die standardmäßige automatische Prozedur für 1D-Shimming, indem Sie einfach nacheinander die Befehle ausführen qu topshim 1dfast ss; qu Topshim Tuneb SS; und qu topshim report" in der Befehlszeile. Nach der Parameteroptimierung, wie im Textprotokoll beschrieben, erfassen Sie eindimensionale Kohlenstoff-NMR-Spektren. Gehen Sie dazu zum Kohlenstoffdatensatz und verwenden Sie eine inverse Gated Decoupled Pulssequenz, indem Sie pulprog zgig" in die Befehlszeile eingeben.
Geben Sie Befehle in der Befehlszeile ein, um das Spektral mit nppm, das Zentrum des HF-Senders, die Anzahl der Scans, die Anzahl der Dummy-Scans, die Anzahl der Datenpunkte und die Impulsdauer für einen Impulswinkel von neunzig Grad einzurichten. Geben Sie digmod baseopt" in die Befehlszeile ein, um ein Spektrum mit einer verbesserten Basiszeile zu erhalten. Stellen Sie dann eine Entspannungsverzögerung von 60 Sekunden für das 850-Megahertz-Instrument ein, indem Sie di 60s" in die Befehlszeile eingeben.
Stellen Sie die Empfängerverstärkung mit dem Befehl rga" auf einen geeigneten Wert ein, um die Empfängerverstärkung automatisch zu berechnen. Starten Sie abschließend die Erfassung, indem Sie den Befehl pulse acquire zg" in die Befehlszeile eingeben. Um die Daten zu verarbeiten, geben Sie zuerst si 64K" in die Befehlszeile ein, um eine Nullfüllung anzuwenden, und legen Sie die Größe des Schienenspektrums auf 64K fest.
Legen Sie dann den Parameter für die Zeilenverbreiterung auf 1,0 Hertz fest, indem Sie lb 1,0" in die Befehlszeile eingeben, um eine Wartefunktion mit einem Zeilenverbreiterungsfaktor von 1,0 Hertz vor der 4ea-Transformation anzuwenden. Führen Sie die 4ea-Transformation aus, indem Sie efp" in die Befehlszeile eingeben. Führen Sie als Nächstes die automatische Phasenkorrektur durch, indem Sie den Befehl apk"in der Befehlszeile eingeben.
Wenn zusätzliche Phasenanpassungen erforderlich sind, um das Spektrum weiter zu verbessern, klicken Sie auf die Registerkarte Prozess. Klicken Sie dann auf das Symbol Phase anpassen und die Symbole Phasenkorrektur für die Phasenkorrektur nullter Ordnung und erster Ordnung. Während Sie auf die Symbole für die Phasenkorrektur der Nullordnung und der ersten Ordnung klicken, ziehen Sie die Maus, bis sich alle Signale im positiven Absorptionsmodus befinden.
Wenden Sie die Phasenkorrekturwerte an und speichern Sie sie, indem Sie auf die Schaltfläche Zurück und Speichern klicken, um den Phasenkorrekturmodus zu verlassen. Wenden Sie eine polynomiale Funktion vierter Ordnung für die Basislinienkorrektur bei der Integration an, indem Sie den Befehl abs n" in die Befehlszeile eingeben. Um chemische Verschiebungen in ppm von TMS zu melden, zoomen Sie auf das TMS-Signal, klicken Sie dann auf das Symbol Kalibrierung und platzieren Sie den Cursor mit der roten Linie über dem NMR-Signal, das referenziert werden soll, in diesem Fall TMS.
Um die Schwellenwertintensität anzupassen, verwenden Sie bei Bedarf die mittlere Maustaste. Klicken Sie mit der linken Maustaste und geben Sie 0 ein. Wenn Sie BHT als internen Standard verwenden, integrieren Sie den Peak bei Delta 151,45, der sich um fünf Hertz von jeder Seite des Peaks erstreckt.
Stellen Sie dann das Integral auf die Mikromol BHT pro 0,5 Milliliter der Stammlösung ein. Integrieren Sie die Peaks of Interest, die sich von jeder Seite des Peaks über fünf Hertz erstrecken. Wenn es notwendig ist, sich auf eine Region zu konzentrieren, klicken Sie auf das Highlight-Symbol, um sie zu deaktivieren.
Klicken Sie dann mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um die Region zu vergrößern. Klicken Sie erneut auf das Highlight-Symbol, um die Integrationsfunktion zu aktivieren und zum nächsten Peak zu gelangen. Klicken Sie mit der linken Maustaste, und ziehen Sie den Cursor durch das Integral.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Gespeicherte Regionen zurückgeben. Hier ist ein repräsentatives Spektrum der Kohlenstoff-NMR-Analyse im Bereich des Carbonylkohlenstoffs dargestellt. Dargestellt sind die NMR-Signale von EPA und DHA an den Positionen sn-1, 3 und sn-2.
Diese Signale können für die quantitative Bestimmung von EPA und DHA verwendet werden. Hier ist ein repräsentatives Spektrum der Protonen-NMR-Analyse dargestellt. Dargestellt sind die NMR-Signale von EPA und DHA, die für ihre Bestimmung verwendet werden können.
Das Protonen-NMR-Spektrum zeichnet sich durch eine geringere spektrale Breite im Vergleich zum Kohlenstoff-NMR-Spektrum und damit durch eine geringere spektrale Auflösung aus. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Lipidanalyse, um verschiedene Lipidkomponenten, die in Mehrkomponentenmatrizen wie Nahrungsergänzungsmitteln, Pflanzenöl und Biokraftstoffen vorkommen, schnell zu analysieren.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Protonen- und Kohlenstoff- und NMR-Spektroskopie für die Analyse des Lipidprofils von Fischölpräparaten anwenden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit starken Magnetfeldern, die von NMR-Spektrometern erzeugt werden, für Herzschrittmacher und chirurgische Prothesen sowie für elektronische Geräte wie Kreditkarten und Uhren äußerst gefährlich sein kann.
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Übersicht
Diese Studie zeigt den Einsatz der hochauflösenden 1H- und 13C-Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zur Analyse von Fischölergänzungsmitteln. Die Methode ermöglicht sowohl eine quantitative als auch qualitative Lipidprofilerstellung und liefert Einblicke in die Zusammensetzung und Struktur der Fettsäuren.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biokemie
- Analysenchemie
Hintergrund
- Die Kernresonanzspektroskopie (NMR) ist eine leistungsstarke analytische Methode.
- Fischölergänzungsmittel werden aufgrund ihrer gesundheitlichen Vorteile weit verbreitet eingesetzt.
- Das Verständnis von Lipidprofilen ist entscheidend für die Ernährungswissenschaft.
- Die positionsabhängige Verteilung von Fettsäuren beeinflusst ihre biologische Funktion.
Zweck der Studie
- Bestimmung des Lipidprofils von Fischölsupplementen.
- Analyse des Lipidgehalts und der Verteilung von Fettsäuren.
- Bereitstellung einer schnellen und robusten analytischen Methode ohne umfangreiche Probenvorbereitung.
Verwendete Methoden
- Extraktion von Fischöl aus Nahrungsergänzungskapseln.
- Zubereitung von Proben zur Protonen- und Kohlenstoff-NMR-Analyse.
- Verwendung einer BHT-Stammlösung zur Probenauflösung.
- Aufzeichnung des Gewichts des extrahierten Fischöls für eine genaue Analyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bestimmung der Lipidprofile in Fischölergänzungsmitteln.
- Identifizierung verschiedener Fettsäuren und ihrer positionsabhängigen Verteilung.
- Nachweis der Effizienz von NMR in der Lipidanalyse.
- Erkenntnisse zur Zusammensetzung von Nahrungsergänzungsmitteln.
Schlussfolgerungen
- Die NMR-Spektroskopie eignet sich zur Analyse von Fischölsupplementen.
- Die Methode liefert wertvolle Informationen für die Ernährungsforschung.
- Die schnelle Analyse ohne Trennschritte ist ein wesentlicher Vorteil.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels NMR-Spektroskopie lässt sich eine schnelle, zerstörungsfreie Lipidprofilerstellung von Fischölsupplementen durchführen, was die Qualitätskontrolle und Formulierungsentscheidungen in der Entwicklung von Nahrungsergänzungsmitteln unterstützt. Die Methode liefert quantitative Daten zu den wichtigsten Fettsäuren und deren positionspezifischer Verteilung ohne Reinigungsschritte und verkürzt dadurch die Analysezeiten. Diese Fähigkeit hilft bei der Screening-Phase von Inhaltsstoffen sowie bei der Beurteilung der Konsistenz von Charge zu Charge für Produkte auf Basis von Omega-3-Fettsäuren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Lipidzusammensetzung zur Unterstützung mechanistischer Hypothesen in der Nahrungsergänzungsforschung.
- Operativer Wert: Ermöglicht die direkte Profilierung von Lipiden aus komplexen Matrizes ohne Extraktion oder chromatographische Schritte.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative Fettsäureprofile zur Standardisierung von Assays bei der Bewertung lipidbasierter Supplemente.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Bereitschaft für Hochdurchsatz-Screenings durch schnelle 1H-NMR-Aufnahme in unter einer Minute.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die translationale Kontinuität, indem strukturelle Lipiddaten mit funktionellen Ergebnissen in präklinischen Modellen verknüpft werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht eine reproduzierbare Lipidprofilerstellung über Entdeckungs- und präklinische Arbeitsabläufe hinweg, unter Verwendung standardisierter NMR-Protokolle.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows für die Lipidanalyse integrieren und ermöglicht eine schnelle Profilierung vor der Identifizierung von Leitverbindungen in der Entwicklung von Nahrungsergänzungsmitteln. Sie unterstützt die Assay-Entwicklung, indem sie konsistente, quantitative Lipidauslesungen ohne Derivatisierung bereitstellt. Die Technik verbessert die unternehmensweite Wiederverwendbarkeit als standardisierte analytische Plattform für lipiddhaltige Formulierungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich der Lipidzusammensetzung und Verteilung von Fettsäuren in Supplementmatrizen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare, quantitative Lipidprofilerstellung mit minimalem Probenaufwand.
- Analytik: Bietet direkte quantitative Messungen durch Signalintegration in 1H- und 13C-NMR-Spektren für den Vergleichsanalysen.
- Translationale Forschung: Verbindet strukturelle Lipiddaten mit biologischer Relevanz für die Entwicklung doxorubicinfreier Nahrungsergänzungsmittel.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als skalierbare, geräteunabhängige Plattform, die auf 500-MHz- und 850-MHz-NMR-Systemen für routinemäßige Qualitätskontrolle eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Charakterisierung von Lipiden durch direkte, quantitative NMR-Messungen.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch interne Referenzierung (BHT) und konsistente Spektrumerfassung sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch von Formulierungen, indem eine schnelle Beurteilung des Lipidprofils während des Formulierungs-Screenings ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Omega-3-Inhaltsstoffen auf Basis verifizierter Zusammensetzungsdaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Interpretation von NMR-Spektren und der Zuordnung von Lipidsignalen.
- Setzt den Zugang zu NMR-Spektrometern (500 MHz oder 850 MHz) und gängigen Laborverbrauchsmaterialien voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Probenvorbereitung, Referenzierung und Integrationsprotokollen.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Verträglichkeit von Lösungsmitteln und die Wahl des internen Standards über verschiedene Lipidmatrizen hinweg.
- Praktische Einschränkungen umfassen längere Messzeiten bei 13C-NMR im Vergleich zu 1H-NMR sowie die Empfindlichkeit gegenüber der Homogenität des Magnetfelds.
