Die Verwendung eines zentralen Venenkatheter für Flüssigkeiten, Drugs und Nährstoffverwaltung in einem Maus-Modell der Critical Illness
2. Mai 2017
Dieses Protokoll beschreibt ein zentral katheterisiertes Mausmodell für anhaltende kritische Erkrankungen. Wir kombinieren die Zäkalligatur und die Punktionsmethode zur Induktion einer Sepsis mit der Verwendung eines zentralen Venenzugangs für die Verabreichung von Flüssigkeiten, Medikamenten und Nährstoffen, um das klinische Umfeld des Menschen nachzuahmen.
Das übergeordnete Ziel dieser zentral kategorisierten Maus-Methode zur Zäkalligation und -punktion, oder CLP, besteht darin, ein reproduzierbares Modell für einen lang andauernden kritischen Krankheitszustand unter intensivmedizinischen Maßnahmen zu schaffen, um die menschliche klinische Situation nachzuahmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Intensivmedizin zu beantworten, insbesondere bezüglich der Pathogenese endokriner und metabolischer Veränderungen während akuter und langanhaltender kritischer Krankheiten.
Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die gut standardisierte CLP-Technik mit der Verwendung einer zentralen Venenleitung zur Verabreichung von Flüssigkeiten, Medikamenten und Nährstoffen kombiniert. Die Demonstration des Verfahrens übernimmt Thomas Dufour, ein Techniker aus unserem Labor. Um die Spitze der Venenleitung vorzubereiten, tauchen Sie den mittleren Abschnitt eines 60 Zentimeter langen Micro-Renathane-Schlauchs kurz in 220 Grad Celsius heißes oder heißeres Sesamöl.
Ziehen Sie vorsichtig an den Enden des Schlauchs, um die Mitte des Schlauchstücks zu dehnen und einen engen mittleren Durchmesser zu erzeugen, und schneiden Sie den Schlauch mit einer Skalpellklinge in zwei gleich lange Stücke à 30 Zentimeter. Verbinden Sie nun den Schlauch mit einem Polyethylen-PE-50-Verbinder, einem Swivel und einer Luer-Stopfnadel, um den Katheter wie gezeigt aufzubauen, und tragen Sie einen starken, schnell härtenden Kleber an allen Verbindungsstellen auf. Sobald der Kleber ausgehärtet ist, spülen Sie den Katheter mit Luft durch, um auf Dichtheit zu prüfen. Schneiden Sie danach ein 80 Zentimeter langes Stück von einem Metalldraht mit 0,8 Millimeter Durchmesser ab und falten Sie den Draht zurück, um eine Schleife zu bilden.
Führen Sie drei Perlen über den doppelten Draht der Schlaufe und leiten Sie die Spitze des sterilisierten Katheters durch die drei Perlen, um den Katheter am Draht zu befestigen. Betäuben Sie eine 27 bis 32 g schwere, 24 Wochen alte männliche c57 black six Maus, und bestätigen Sie die Sedierung durch das Fehlen einer Reaktion auf einen Zehenquetschtest. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Zunge vorsichtig aus dem Mund zu ziehen, um ein Verschlucken der Zunge zu vermeiden.
Als Nächstes rasieren Sie den Operationsbereich, bringen Sie die Maus in Bauchlage auf eine vorgewärmte Heizplatte. Desinfizieren Sie die freiliegende Haut mit 70 % Ethanol und tragen Sie eine kleine Menge Augenschmiermittel auf. Infiltrieren Sie die Operationsstellen mit Analgetika und führen Sie einen kleinen Schnitt an der Basis der Rückenseite des Kopfes durch.
Exponieren Sie die hinteren Halsmuskeln, und führen Sie ein Stück 3,0-Nylon unter den Muskeln hindurch, um die Schleife des Befestigungsdrahts an dem Muskel zu befestigen. Danach machen Sie bei der Maus in rechter Seitenlage einen kleinen vertikalen Schnitt in die Haut des vorderen Halsbereichs. Führen Sie eine 18-Gauge-Nadel subkutan durch diesen vorderen Schnitt in Richtung des Rückenschnitts und ziehen Sie den Katheter durch die Nadel, um die Nadel an der Ventralseite zu exteriorisieren.
Legen Sie die Maus auf den Rücken, führen Sie einen drei Nullen umfassenden Nylonfaden hinter den oberen Schneidezähnen vorbei und befestigen Sie den Nylonfaden mit Klebeband auf der Heizplatte. Befestigen Sie anschließend Schwanz und Vordergliedmaßen in ausgestreckter Position. Richten Sie nun das Stereomikroskop scharf und lösen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Fettgewebe und die Drüsen im ventralen Schnittbereich, bis die Vena jugularis sichtbar wird.
Platzieren Sie die Spitze der Pinzette zwischen der Vene und dem Bindegewebe und öffnen Sie die Pinzette wiederholt parallel zur Vene, um die V. jugularis stumpf vom umgebenden Bindegewebe und subkutanem Gewebe zu lösen. Sobald die Vene isoliert ist, legen Sie die stumpfe Pinzette unter die V. jugularis und führen zwei Stücke Dreinull-Seidenfaden unterhalb der Vene hindurch. Positionieren Sie ein Stück nahe der Bifurkation der V. jugularis für die kraniale Ligatur und ein weiteres Stück in der Nähe des Musculus sternocleidomastoideus für die kaudale Ligatur.
Ziehen Sie die kraniale und kaudale Ligatur fest, um die Vene zu dehnen und übermäßiges Bluten während der Katheterplatzierung zu verhindern. Verwenden Sie einen dritten Faden, um eine lose Ligatur anzulegen, und führen Sie dann mit Mikroscheren einen Schnitt entlang der Vene zwischen der kranialen und kaudalen Ligatur durch, der groß genug ist, um den Katheter hindurchzuführen. Führen Sie den Katheter mithilfe einer Pinzette 11 Millimeter in die Vene ein und fixieren Sie ihn locker mit der mittleren Ligatur.
Spülen Sie den Katheter vorsichtig mit steriler Kochsalzlösung, um die korrekte Platzierung zu überprüfen. Danach ziehen Sie die kaudale und mittlere Ligatur fest an. Verknoten Sie die Enden der kaudalen und mittleren Ligatur miteinander, um den Katheter zu sichern.
Überprüfen Sie, dass die Vene durch die Knoten nicht verschlossen ist, indem Sie den Katheter nach jedem Knoten spülen. Schließen Sie abschließend auch die kraniale Ligatur. Anschließend verschließen Sie den Schnitt mit fünf Null Seidenfäden.
Bei der Zäkalligation und -punktion einen einen Zentimeter langen medianen Schnitt durch die Haut der unteren Baushälfte führen, wobei darauf zu achten ist, dass die Peritonealhöhle nicht durchbrochen wird. Nach Identifizierung der Linea alba der Bauchmuskulatur einen zwischenmuskulären Schnitt durchführen, um in die Peritonealhöhle vorzudringen.
Unter Verwendung stumpfer anatomischer Pinzette wird der Z盲kum isoliert und nach au脽en gef眉hrt. Der Z盲kum wird bei 50 % seiner L盲nge mit drei Seidenligaturen der St盲rke 0 abgebunden, wobei darauf zu achten ist, dass der Ileoz盲kalklappen nicht eingeengt wird, um die intestinale Kontinuit盲t aufrechtzuerhalten. Anschlie脽end wird der Z盲kum mit einer 18-Gauge-Nadel mittig zwischen der Ligatur und der Z盲kumspitze mit einer einzigen Durchstichpunktion perforiert, wobei eine kleine Menge F盲zes aus der 脰ffnung austritt, um die Durchg盲ngigkeit nach Entfernen der Nadel sicherzustellen.
Bringen Sie den Darm in die Bauchhöhle zurück und schließen Sie das Peritoneum und die Haut mit fünf Null-Seiden-Nähten. Befestigen Sie bei der Maus in Rückenlage den Katheter mit Klebeband am Befestigungsdraht. Anschließend stellen Sie die Maus in einen Einzelkäfig mit Nestmaterial und einem Holzblock.
Platzieren Sie die Schwenkvorrichtung mithilfe eines Statives mit verstellbarer Klemme in der Klemme und befestigen Sie den freien Teil des metallenen Befestigungsdrahts fest mit Klebeband an der Drehachse des Schwenks. Stellen Sie dann den Käfig in einen auf 27 Grad Celsius temperaturgeregelten Tierkäfig mit 12-Stunden-Licht- und Dunkelzyklen. Befestigen Sie die Spritze, die die geeignete Mischung aus balancierten Kolloiden und Kristalloiden enthält, an der venösen Leitung und verwenden Sie eine präzise, spritzengetriebene Infusionspumpe, um die Flüssigkeitsresuscitation mit 0,3 Millimetern pro Stunde zu beginnen.
Nach sechs Stunden Analgetika und Antibiotika injizieren. Die Analyse der Überlebenskurven eines Fünf-Tage- und eines Sieben-Tage-Experiments zur Zäkalligatur und -punktion zeigt, dass die Überlebensraten in beiden Studien bis zum fünften Tag nicht signifikant unterschiedlich waren, was die Reproduzierbarkeit des experimentellen Aufbaus unterstreicht. Die Ligatur von 50 % des Zäkums in Kombination mit Antibiotika, Flüssigkeitsersatz und totaler parenteraler Ernährung über einen venösen Katheter in der Vena jugularis führt nach einem Tag schwerer Erkrankung zu einer Mortalität von 13 %.
24 % Mortalität nach drei Tagen schwerer Erkrankung und 27 % bis 31 % Mortalität nach fünf Tagen schwerer Erkrankung sowie 36 % Mortalität nach sieben Tagen schwerer Erkrankung. Die gesunden, para-fettpoligen Mäuse, denen kalorisch auf das Niveau der schwer erkrankten Mäuse beschränkt wurde, zeigten jedoch in keinem der Experimente eine Mortalität. Nachdem 10 bis 15 Tiere verwendet wurden, um die Technik zu beherrschen, kann der Katheter platziert und die CLP innerhalb von 45 Minuten durchgeführt werden, sofern die Verfahren ordnungsgemäß ausgeführt werden.
Bei Durchführung dieses Verfahrens muss darauf geachtet werden, den Katheter vorsichtig in die Vene einzuführen. Wird der Katheter zu weit ins Herz vorgeschoben, kann dies Herzrhythmusstörungen auslösen. Wird er nicht weit genug vorgeschoben, kann er leicht herausgezogen werden.
Stets überprüfen, ob der Katheter innerhalb des Lumens des Gefäßes platziert ist. Befindet sich der Katheter in den Schichten der Gefäßwand, treten Flüssigkeiten in das umgebende Gewebe aus. Dieses Modell kann ein umfangreiches chirurgisches Vorgehen und eine tägliche intensive Tierpflege erfordern.
Aber es führt zu einem stabilen und reproduzierbaren Modell, das die Untersuchung vieler Aspekte akuter und prolongierter kritischer Erkrankungen ermöglicht.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt ein zentral katheterisiertes Mausmodell für einen lang andauernden kritischen Krankheitszustand. Die Methode kombiniert eine Blinddarm-Ligatur und -Punktion zur Induktion einer Sepsis mit einer zentralen Venenkatheterisierung zur Verabreichung von Flüssigkeiten, Medikamenten und Nährstoffen und ahmt damit klinische Situationen beim Menschen nach.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Intensivmedizin
- Sepsis-Forschung
- Modellierung von schweren Erkrankungen
Hintergrund
- Das Modell zielt darauf ab, einen lang andauernden kritischen Krankheitszustand nachzubilden.
- Es berücksichtigt endokrine und metabolische Veränderungen während akuter und langanhaltender Erkrankungen.
- Kombiniert etablierte Techniken, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern.
- Verwendet eine zentrale Venenkatheterisierung zur umfassenden Versorgung.
Zweck der Studie
- Ein reproduzierbares Modell zur Untersuchung von schweren Erkrankungen erstellen.
- Die Pathogenese metabolischer Veränderungen bei kritischen Zuständen erforschen.
- Die Forschung zu Intensivpflege-Protokollen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Darmnahtligatur und Punktion (CLP) zur Induktion einer Sepsis.
- Zentralvenöse Linie zur Gabe von Flüssigkeiten und Nährstoffen.
- Mausmodell für eine prolongierte kritische Erkrankung.
- Standardisierte chirurgische Techniken zur Reproduzierbarkeit.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion eines prolongierten kritischen Krankheitszustands bei Mäusen.
- Nachgewiesene metabolische und endokrine Veränderungen.
- Validierung des Modells für zukünftige Intensivforschung.
- Bereitstellung eines Rahmenwerks zur Untersuchung therapeutischer Interventionen.
Schlussfolgerungen
- Das Modell bildet menschliche kritische Erkrankungsszenarien effektiv nach.
- Es kann zur Untersuchung therapeutischer Strategien bei Sepsis eingesetzt werden.
- Bietet Einblicke in die Stoffwechselreaktionen während einer schweren Erkrankung.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll etabliert ein reproduzierbares Mausmodell für einen lang andauernden kritischen Krankheitszustand, das die Induktion von Sepsis mit klinisch relevanten unterstützenden Maßnahmen über einen zentralvenösen Zugang kombiniert. Es ermöglicht die Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen endokriner und metabolischer Veränderungen während akuter und verlängerter Phasen kritischer Erkrankungen und schließt damit eine wichtige translativmedizinische Lücke in der Sepsisforschung. Das Modell erlaubt die präklinische Bewertung therapeutischer Interventionen unter Bedingungen, die dem intensivmedizinischen Management beim Menschen nachempfunden sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit metabolischer und endokriner Dysregulation bei länger andauernden kritischen Erkrankungen.
- Operationaler Wert: Bietet ein stabiles, reproduzierbares System zur Validierung von Zielstrukturen, die an Organversagen und metabolischer Anpassung beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Entwicklung standardisierter Assays zur Applikation von Flüssigkeiten, Arzneimitteln und Nährstoffen in Sepsismodellen.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine konsistente Verabreichung von Substanzen über eine zentrale Venenkatheterleitung, verbessert die Dosierungsgenauigkeit und verringert die Variabilität.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert die verlängerte Phase einer kritischen Erkrankung und ermöglicht die Untersuchung nicht abklingender Organversagen und metabolischer Dysfunktionen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Überwachung und Testung von Interventionen über mehrere Tage hinweg, was den klinischen Zeitabläufen entspricht.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode verbindet die frühe Entdeckungsforschung (Target-Validierung) mit der präklinischen Forschung, indem sie eine klinisch relevante Plattform zum Testen von Interventionen bei Sepsis und kritischen Erkrankungen bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich der Signalwege, die metabolische und endokrine Veränderungen bei schwerer Erkrankung antreiben.
- Screening: Ermöglicht die reproduzierbare Verabreichung von Therapeutika über einen zentralvenösen Zugang und verbessert dadurch die Zuverlässigkeit von Assays.
- Analytik: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse, einschließlich Überlebensraten, Sterblichkeitszeitpunkte und physiologische Parameter für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Modelliert eine für den Menschen relevante, langanhaltende kritische Erkrankung und verbessert so die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Sepsis- und Intensivforschung über mehrere therapeutische Bereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die verlängerte Phase einer kritischen Erkrankung modelliert wird, wodurch mechanistische Unschärfen in der Sepsis-Pathophysiologie reduziert werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Verabreichung von Flüssigkeiten, Medikamenten und Nährstoffen über einen zentralvenösen Zugang und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen Studien.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über die Weiterentwicklung von Therapieansätzen, indem er eine risikoadjustierte Bewertung von Interventionen in einem klinisch relevanten Modell einer prolongierten Erkrankung ermöglicht.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die Priorisierung von Kandidaten basierend auf deren Wirksamkeit bei der Modulation metabolischer und endokriner Reaktionen während einer kritischen Erkrankung.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in Mikrochirurgie, vaskulärem Zugang und intensivmedizinischer Nachsorge bei Nagetieren voraus.
- Benötigt spezialisierte Ausrüstung, einschließlich mikrochirurgischer Instrumente, Infusionspumpen und temperaturgeregelten Tierhaltungssystemen.
- Erfordert standardisierte Protokolle für die Katheterplatzierung, die Durchführung der CLP und die tägliche Überwachung der Tiere.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche Stämme, Altersgruppen oder geschlechtsspezifische Reaktionen bei der Modellierung kritischer Erkrankungen.
- Wird durch die technische Komplexität und den hohen Ressourcenaufwand für die chirurgische Vorbereitung sowie die langwierige Tierbetreuung begrenzt.
