Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit

Das übergeordnete Ziel dieser Probennahmemethode besteht darin, Metabolitenproben von Staphylococcus aureus zu gewinnen, um diese anschließend mittels Tandem-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie zu quantifizieren. Unser Labor beschäftigt sich mit der Untersuchung der Schnittstelle zwischen Stoffwechsel und Pathogenese bei für die menschliche Gesundheit relevanten Bakterien. Derzeit verwenden wir den humanen opportunistischen Erreger Staphylococcus aureus als Modellorganismus.

Eine zentrale Frage, die wir beantworten möchten, ist, wie Bakterien ihre Physiologie und Pathogenität anpassen, wenn sie während einer Wirtsinfection mit Nährstoffmangel konfrontiert werden. Diese Technik ist vorteilhaft, da sie einen Überblick über die Verteilung spezifischer Metabolite innerhalb der zahlreichen Stoffwechselwege in aktiv wachsenden Zellen ermöglicht, wobei der physiologische Zustand nur minimal gestört wird. Zunächst werden die interessierenden S.aureus-Stämme zur Isolierung auf Tryptic-Soy-Agar aus der gefrorenen Glycerin-Stammlösung ausgestrichen.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 16–24 Stunden. Inokulieren Sie am nächsten Tag jeweils 4 mL tryptonhaltige Sojabrühe (Tryptic Soy Broth, TSB) in sterilen Glasinkubationsröhrchen mit Einzelkolonien jedes Stammes. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius für 16–20 Stunden im Schräglage mit Rotation.

Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die optische Dichte der Kulturen bei 600 Nanometern, abgekürzt als OD600, zu messen. Verdünnen Sie anhand dieser Messung die Zellen auf einen OD600-Wert von 0,05 in 50 mL sterilen TSB-Medium in 250-mL-Delong-Flaschen. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad unter Schütteln mit 280 U/min.

Alle 30 Minuten OD600-Messungen durchführen. Während die optischen Dichten ansteigen, kann es notwendig werden, die Kulturen mit TSB zu verdünnen, damit sie im linearen Absorptionsbereich des Spektrophotometers liegen. Während die Zellen wachsen, frisch die Extraktionspufferlösungen unter Verwendung der reinsten verfügbaren Reagenzien gemäß der schriftlichen Protokollanleitung herstellen.

Wenn die Kulturen einen OD600 zwischen 0,8 und 1,0 erreicht haben, überimpfen Sie sie in 50 mL frisches, vorgewärmtes TSB auf einen OD600 von 0,01 bis 0,05 und wiederholen Sie die Inkubations- und Messschritte. Bereiten Sie eine Schicht aus zerkleinertem Trockeneis in einem geeigneten Behälter, wie einer Glaswanne, Eiskübel oder Kühlbox, vor. Während die optischen Dichten der Kulturen dem gewünschten Erntepunkt entgegengehen, geben Sie 1 mL Lösungsmittel zum Abstoppen in eine 35-mm-Petri-Schale aus unbeschichtetem Material und kühlen Sie diese mindestens 5 Minuten auf Trockeneis vor.

Für unsere Zwecke liegt der gewünschte Erntezeitpunkt bei einer optischen Dichte von etwa 0,4 bis 0,5. Dieser kann jedoch je nach experimentellen Zielen variiert werden. Als Nächstes setzen Sie einen Edelstahlfilterschwamm in einen Gummistopfen ein und platzieren diesen auf einem Vakuumkolben, der an eine Hausvakuumquelle oder eine Vakuumpumpe angeschlossen ist.

Schalten Sie das Vakuum ein und legen Sie eine gemischte Celluloseester-Membran darauf. Verwenden Sie einen Filter mit dem gleichen Durchmesser wie der Sinter, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden. Es ist entscheidend, die Zellen schnellstmöglich zu sammeln und die Stoffwechselaktivität zu stoppen, um einen Momentaufnahme der Stoffwechselkonzentrationen unter einer bestimmten Bedingung zu erhalten.

Selbst kleine Verzögerungen können die physiologische Gleichgewichtslage der Zellen beeinflussen. Bei einem OD600 zwischen 0,4 und 0,5 entnehmen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 13 mL Kultur aus dem Kolben. Tragen Sie die Probe unverzüglich auf den Filter auf.

Nachdem die gesamte Probe filtriert wurde, spülen Sie den Filter sofort mit nicht mehr als 5 mL eiskalter PBS, um mediumassoziierte Metaboliten zu entfernen. Trennen Sie dann das Vakuum ab und verwenden Sie ein Paar steriler Pinzette, um den Filter vom Fritte zu entfernen. Drehen Sie den Filter in die vorab gekühlte Abbruchlösung um.

Den Filter mindestens 20 Minuten im Abpufflösung auf Trockeneis inkubieren. Den Filter mithilfe der sterilen Pinzette in der Petrischale umdrehen und die Zellen mit einer Mikropipette von der Membran abwaschen, wobei die Abwaschflüssigkeit in die Abpufflösung gelangt. Die Zellen in der Abpufflösung resuspendieren und anschließend die Zellsuspension in ein steriles, schlagfestes 2-mL-Röhrchen überführen, das etwa 100 Mikroliter 0,1-mm-Kieselglaskügelchen enthält.

Lagern Sie dies auf Trockeneis oder bei 80 Grad Celsius. Um die Metabolit-Extraktion zu beginnen, tauen Sie die Proben zunächst auf Nass-Eis auf. Anschließend lysieren Sie die Zellen in einem Homogenisator mit vier 30-Sekunden-Stößen bei 6000 U/min, wobei zwischen den Zyklen jeweils zweiminütige Kühlphasen auf Trockeneis erfolgen.

Klären Sie die Lysate 15 Minuten lang in einem vorab gekühlten Mikrozentrifugenröhrchen bei maximaler Geschwindigkeit. Nach der Zentrifugation überführen Sie das Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie mithilfe einer Mikropipette einen kleinen Teil der Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen zur Quantifizierung des restlichen Peptidgehalts, wie im Textprotokoll beschrieben.

Lagern Sie den Rest der Probe bei 80 Grad Celsius. Weitere Informationen zur Analyse der Metaboliten mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie finden Sie im Textprotokoll. Der CodY-Nullmutant wurde verwendet, um den Mangel an verzweigtkettigen Aminosäuren zu untersuchen, da das CodY-Protein die Expression von Dutzenden von Genen als Reaktion auf den Abfall der Konzentration dieser Nährstoffe reguliert.

Die codY-Mutation hat kaum Auswirkungen auf die Wachstumsrate von S.aureus-Zellen. Der Abfall der optischen Dichte zum Zeitpunkt von 3 Stunden weist auf den Back-Dilution-Schritt hin, der die Anzahl der Zellteilungen vor der Ernte erhöht und verschiedene Moleküle verdünnt, die sich während des Übernachtwachstums angesammelt haben. Eine RNA-Sequenzanalyse der Transkriptome der beiden Stämme zeigt signifikante Veränderungen in der Expression von Genen, die an der Synthese der Aspartat-Familie von Aminosäuren beteiligt sind.

Hier zeigen die Zahlen unter den Genbezeichnungen die Expression der jeweiligen Gene im codY-Null-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp-Stamm, angegeben als Fold-Change. Nach der LC-MS-Quantifizierung der extrahierten Metabolite wurden die Mengenverhältnisse zwischen den beiden Stämmen verglichen. Bei Betrachtung einiger Verbindungen, die zur Aspartat-Familie der Aminosäuren gehören, sind die Mengen der Vorläuferstoffe wie Aspartat und O-Acetylhomoserin im codY-Mutanten verringert.

Umgekehrt steigen die Endprodukte wie Threonin und Isoleucin an. Hier zeigt die gestrichelte Linie die Grenze für die Mengenänderungen in diesem Experiment an. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Metaboliten aus Staphylococcus aureus für die Quantifizierung mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie gewinnt.

Dieses Protokoll ist mit Modifikationen auch zur Metabolitengewinnung aus anderen Bakterienspezies geeignet. Da Bakterien auf dynamische Umgebungen reagieren, ist es wichtig, die Filtrations- und Waschschritte schnell durchzuführen, um potenzielle physiologische Veränderungen durch die Probennahme zu minimieren. Veränderungen können ebenfalls minimiert werden, indem der Fritte und das PBS während der Probennahme kalt gehalten werden.