Name: Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch radioaktiv markierte GTP-Bindung charakterisieren. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung von GPCR-Pharmakologie und Ligandeninteraktionen in Zellmembranen.

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Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grant DA-000266 und der Medical Scientist Training Program T32 Grant (CV, NWZ und PCS) unterstützt. Die Autoren würden auch gerne sagen, somersault18: 24 (somersault1824.com) für die Library of Science &amp; Medical Illustrationen.

1. Expression von rekombinantem HA-MOR1 in kultivierten Zellen HINWEIS: Befolgen Sie alle Zellkulturprotokolle in einer sterilen laminaren Strömungshaube. <ol><li> Sterilisieren Sie die Zellkultur-Laminar-Flow-Kapuze mit 70% Ethanol und halten Sie sterile Technik in der gesamten Zellkultur. </li><li> Bereiten menschliche embryonale Nierenzellen vor 293 (HEK293) Zellkulturmedium, vollständiges Dulbecco&#39;s modifiziertes Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS ). </li><li> Platte 2,5 x 10 6 HEK293 Zellen auf eine 10 cm Gewebekulturplatte in 10 ml vollständigem DMEM auftragen und bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren, bis 70-80% Konfluenz erreicht sind (O / N). ANMERKUNG: Um genug Protein für ein komplettes GTP-Bindungsexperiment zu sammeln, muss mindestens 3 x 10 cm Platten von Zellen platzen. </li><li> Transformieren Sie die Zellen mit HA-MOR1 mit einem Transfektionsreagenz der Wahl und indem Sie dem Hersteller &quot;Richtlinien. Inkubieren für 36-48 h. HINWEIS: Die menschliche MOR-1-cDNA (NCBI-Referenzsequenz: NM_000914.4) war ein großzügiges Geschenk von Gavril Pasternak und wurde in pCMV-HA kloniert. </li></ol> 2. Zellfraktionierung und Membransammlung <ol><li> Vorbereitung der folgenden Lysepuffer: <ol><li> Puffer 1: 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,4; 1 mM Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N &#39;, N&#39;-tetraessigsäure (EGTA); 10% Saccharose; Protease-Inhibitor-Cocktail; Und 1 mM Dithiothreitol (DTT). Füge das DTT frisch am Tag der Membranisolation hinzu. </li><li> Puffer 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl &amp; sub2 ;; Und 1 mM DTT. Füge das DTT frisch am Tag der Membranisolation hinzu. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die transfizierten Zellen aus dem Inkubator (Schritt 1.4), saugt das Medium an und spülen Sie die Zellen mit 5 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Aspirieren Sie die PBS und überschüssige Flüssigkeit ausder Teller. </li><li> Füge 600 μl Puffer 1 zu den Zellen hinzu. Mit einem Zellschaber werden die Zellen von der Plattenoberfläche entfernt und die Zellsuspension in ein 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. </li><li> Sofort das Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren. Sobald die Proben eingefroren sind, tauen Sie die Lysate auf Eis auf oder legen Sie sie bei -80 ° C für die Langzeitlagerung auf. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 mit allen Platten der Zellen. </li><li> Sobald die Lysate aufgetaut haben, verwenden Sie einen Single-Puls-Mikroröhren-Homogenisator, um die Zellen aufzubrechen. Den Homogenisator 3-5 mal für 10 s anziehen und das Röhrchen für 30 s zwischen den Impulsen auf Eis legen. <ol><li> Sammle 20 μl als ganze Zellfraktion. </li></ol></li><li> Die restliche Probe für 10 min bei 1000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand sammeln und in ein neues 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis geben. </li><li> Das Pellet in 100 μl Puffer 1 resuspendieren und mit einer Pistille rehomogenisieren. Puls den HomoGenizer 3-5 mal für 5 s, Platzierung der Röhre wieder auf Eis für 30 s zwischen Impulsen. <ol><li> Zentrifugieren Sie die Probe ein zweites Mal für 10 min bei 1000 xg und 4 ° C. Kombinieren Sie den Überstand mit dem Überstand aus Schritt 2.7. HINWEIS: Das verbleibende Pellet enthält Kern- und Membranproteine. </li></ol></li><li> Zentrifugieren der vereinigten Überstände für 20 min bei 11.000 xg und 4 ° C. Trennen Sie den Überstand (die zytosolische Fraktion) in ein neues 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Das Pellet wird in 200 &amp; mgr; l Puffer 2 resuspendiert. Das Pellet wird durch Triturieren 3-5 mal homogenisiert. Die Probe 20 Minuten lang bei 21.100 xg und 4 ° C zentrifugieren. Sauge den Überstand. Das Pellet, das die Rohmembranfraktion enthält, in 50 &amp; mgr; l Puffer 2 resuspendieren. </li><li> Verlassen Sie sofort die GTPγS-Bindungsexperimente (Abschnitt 3) oder Snap-Freeze in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 ° C. </li></ol> 3. [ 35 S] GTPγS Bindung </P&gt; HINWEIS: Bei der Handhabung von [ 35 S] GTPγS und bei der Durchführung von [ 35 S] GTPγS-Bindungsexperimenten ein standardmäßiges radiochemisches Sicherheitsprotokoll verwenden. Tragen Sie Schutzhandschuhe und einen Laborkittel zu jeder Zeit. Überprüfen Sie das Verpackungsmaterial auf Lecks oder Risse. Entsorgung von Abfällen und überschüssigen Reagenzien nach institutionellen Protokollen. <ol><li> Vorbereiten des unvollständigen Bindungspuffers (IBB) durch Mischen von 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl &amp; sub2 ;; 100 mM NaCl; Und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in destilliertem Wasser. </li><li> Verdünnungsmittel [ 35 S] GTPγS bis 50 nM in 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 10 mM DTT. Mischen Sie 500 μl Aliquots und lagern Sie sie bei -80 ° C. Verwenden Sie vor dem Einleiten des Experiments nur ein frisch aufgetautes Aliquot. Tausche die Aliquots auf Eis. </li><li> Vorbereiten von nicht radioaktiv markiertem GTP &amp; ggr; S durch Auflösen von 1 mg GTP &amp; ggr; S-Pulver in 177,62 &amp; mgr; l reinem Wasser für eine Stammkonzentration von 10 mM. Machen Sie 10-μl Aliquots und speichern Sie sie bei-20 ° C </li><li> Vorbereiten des vollständigen Bindungspuffers (CBB) durch Ergänzung des IBB um eine Endkonzentration von 1 mM DTT, 0,1% (wt / vol) Rinderserumalbumin (BSA), 10 μM GDP und 0,1 nM [ 35 S] GTPγS. HINWEIS: Die CBB enthält jetzt radioaktiv markiertes GTP. Bei der Arbeit mit radioaktiven Lösungen geeignete Sicherheitsvorkehrungen treffen. </li><li> Die Membranfraktion aus Schritt 2.11 auf Eis auftauen. </li><li> Quantifizierung der Proteinkonzentration der Membranfraktion über einen Bradford-Protein-Assay unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 595 nm. <ol><li> Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von BSA-Proteinstandards mit Puffer 2 bei Endkonzentrationen von 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 und 5.000 μg / ml vor. </li><li> 2 &amp; mgr; l von jedem Standard oder Membran zu 1 ml Bradford-Reagenz in einer Küvette geben. Mischen Sie gründlich durch Vortexen. </li><li> Stellen Sie das Spektrophotometer auf eine Wellenlänge von 595 nm und leeren Sie es mit der Küvette mit 0 μg / ml Protein. </li><li> Warte 5 min und rEad jeder der Standards und jede der Proben bei einer Wellenlänge von 595 nm. </li><li> Zeichnen Sie die Absorption der Standards gegenüber der Konzentration. Mit dem Beer-Lambert-Gesetz (A = εcl, wobei ε = Extinktionskoeffizient, l = Länge der Küvette und c = Konzentration) die Konzentration der Membranproben berechnen. </li></ol></li><li> Die Membranfraktionen auf eine Konzentration von 100 μg Protein / ml in IBB verdünnen. HINWEIS: Eine 10-cm-Schale mit HEK293-Zellen ergibt typischerweise zwischen 1 &amp; 3 mg Protein / ml. </li><li> Bereiten Sie die folgenden experimentellen Bedingungen in einzelnen 1,6-mL-Mikrozentrifugenröhrchen vor: eine Ligand-Verdünnungsreihe, eine basale Aktivitätsbedingung zur Messung der basalen GTP-Bindung und eine unspezifische Bindungsbedingung zur Messung der unspezifischen GTP-Bindung. <ol><li> Für die Liganden-Verdünnungsreihe wird eine Verdünnungsreihe des interessierenden Liganden in einem Endvolumen von 100 &amp; mgr; l CBB hergestellt. Bereiten Sie die Ligandenreihe bei 2x die gewünschte Endkonzentration vorOns Platzieren Sie die Ligandenkonzentrationen, um eine Reihe von Antworten adäquat abzudecken. <ol><li> Um die Wirkung von DAMGO auf die GTP-Bindung über MOR1 zu untersuchen, werden DAMGO-Verdünnungen von 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM und 2 pM in CBB (endgültig) Volumen: 100 &amp; mgr; l). HINWEIS: Wenn zum Beispiel der interessierende Ligand einen erwarteten EC 50 -Wert von 10 μM aufweist, so erhält man Ligandenverdünnungen von 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM und 2 mM. Diese fünf Bedingungen decken einen breiten Bereich von Konzentrationen ab und sind 2x die für den Assay gewünschte Konzentration. </li></ol></li><li> Für die basale Bindung wird ein Röhrchen nur mit 100 μl CBB hergestellt. </li><li> Zur unspezifischen Bindung wird ein Röhrchen mit 99 μl CBB, ergänzt mit 1 μl 2 mM nicht radioaktiv markiertem GTPγS, hergestellt. </li></ol></li><li> Füge 100 μl der verdünnten Membranlösung (Schritt 3.7) zu jeder experimentellen Bedingung hinzu. </li><li> Inkubieren Sie die Membranen mit den verschiedenen ExperimentenBedingungen in 1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen für 30 min bei 25 ° C in einem Thermomixer oder auf einem Orbitalschüttler. </li></ol> 4. Membranfiltration <ol><li> Vorbereiten von Waschpuffer durch Kombinieren von 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl &amp; sub2 ;; Und 50 mM NaCl in destilliertem Wasser. </li><li> Die Glasfaserfilter in Wasser für 10 min abschleifen. HINWEIS: Die Filter haben eine Porengröße von 1 μm, einen Durchmesser von 2,1 cm und eine Dicke von 675 μm. </li><li> Entfernen Sie die Proben aus dem Thermomixer oder dem Orbitalschüttler (Schritt 3.10). Die Proben für 5 s kurz spülen, um jede Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Entfernen Sie den Deckel des Vakuumfiltrationsgeräts. Legen Sie die vorgespannten Filter auf die Vakuumanschlüsse des Gerätes. Sichern Sie den Apparat Deckel, um eine Vakuumdichtung zu bilden. Schalte das Vakuum ein. </li><li> Pipette von 195 μl jeder 200 μl experimentellen Bedingung auf Filter, um den Fehler der Adsorption an den Wänden des Röhrchens und / oder der Pipette zu minimierenTing </li><li> Waschen Sie die Filter dreimal mit 1 ml eiskaltem Waschpuffer. </li></ol> 5. Flüssigkeitszintillationszählung <ol><li> Legen Sie 5 ml Szintillationszählröhrchen in ein Zählgestell ein. Füge 5 ml Szintillationsflüssigkeit zu jeder Durchstechflasche hinzu. </li><li> Schalte das Vakuum aus (Schritt 4.4). Entfernen Sie den Deckel des Vakuumfiltrationsgeräts. Mit Pinzetten die Filter aus den Vakuumanschlüssen des Filtrationsapparates aufnehmen und jeden Filter in eine einzelne 5 ml Szintillationsfläschchen geben. </li><li> Bereiten Sie eine Durchstechflasche mit 195 μl CBB vor, um das maximale Signal zu bestimmen. </li><li> Kappe jede Durchstechflasche sicher. Inkubieren Sie die Fläschchen auf einem Orbitalschüttler bei 25 ° C für 10 min. </li><li> Schalte den Szintillationszähler ein. Programmieren Sie den Szintillationszähler, um die 5 S-Isotopenemission für 5 min pro Probe mit dem standardbezogenen Szintillationsprogramm zu messen. </li><li> Drücken Sie &quot;Start&quot;, um eine Zählung zu nehmen. </li><li> Wenn die Zählung erfolgt ist, entsorgen Sie die gezählte DurchstechflascheS als gefährlicher Abfall. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Geben Sie die Daten in die Statistik- und Analysesoftware ein. <ol><li> Subtrahieren Sie die unspezifische Bindung von jeder der anderen Messungen, um die spezifische Bindung zu bestimmen. HINWEIS: Der Grad der unspezifischen Bindung wird durch die mit nicht-radioaktiv markiertem GTPγS inkubierte Probe bestimmt (Schritt 3.8.3). </li><li> Öffnen Sie die Statistik- und Analysesoftware und wählen Sie einen XY-Datensatzeintrag aus. </li><li> Geben Sie die spezifischen Bindungsdaten aus den [ 35 S] GTPγS-Bindungsexperimenten in eine Datentabelle in der Statistik- und Analysesoftware ein. Geben Sie die Agonistenkonzentrationen als molare Konzentrationen in die &quot;X&quot; -Säule ein. Geben Sie die zugehörigen 35 S-Werte als &quot;Y&quot; -Werte ein. </li></ol></li><li> Verwandeln Sie die Daten. <ol><li> Konvertieren Sie die X-Werte in ihren jeweiligen Logarithmus, indem Sie auf &quot;Analysieren&quot; klicken. Wählen Sie &quot;Transformieren&quot; aus dem eingebauten iN analysiert. </li><li> Wählen Sie im Dialogfeld &quot;Transformieren&quot; die Option &quot;X-Werte umwandeln&quot; und wählen Sie die Funktion &quot;X = log (X)&quot;. Wählen Sie, um einen neuen Graphen der Ergebnisse zu erstellen. </li><li> OK klicken.&quot; </li></ol></li><li> Normalisieren Sie die Y-Werte. <ol><li> Wenn die umgewandelten Ergebnisse angezeigt werden, klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot;. Wählen Sie &quot;Normalisieren&quot; aus den eingebauten Analysen. </li><li> Wählen Sie im Dialogfeld &quot;Normalisieren&quot; das Optionsfeld aus, um 0% als &quot;kleinsten Wert in jedem Datensatz&quot; und 100% als den &quot;größten Wert in jedem Datensatz&quot; zu definieren. Wählen Sie das Feld aus, um die Ergebnisse als Prozentsätze darzustellen. Markieren Sie das Feld, um ein neues Diagramm der Ergebnisse zu erstellen. </li><li> OK klicken.&quot; </li></ol></li><li> Setzen Sie eine nichtlineare Regressionskurven auf die gezeichneten Daten. Führen Sie eine nichtlineare Regressionsanalyse durch. <ol><li> Wenn die normalisierten Ergebnisse angezeigt werden, klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot;. Aus den eingebauten AnalysenWählen Sie &quot;Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung)&quot;. </li><li> Bei der Untersuchung eines Agonisten wählen Sie aus dem Dialogfenster &quot;log (agonist) vs. normalisierte Antwort - Variable Slope&quot; aus. </li><li> Bei der Untersuchung eines Antagonisten, &quot;Select Log (Antagonist) vs. normalisierte Antwort - Variable Slope&quot; aus dem Dialogfeld. </li><li> OK klicken.&quot; </li></ol></li><li> Überprüfen Sie die Grafik und die Ergebnisse, um sicherzustellen, dass die Passform und die Daten in angemessener Übereinstimmung sind. Stellen Sie sicher, dass die Regression mit dem allgemeinen Muster der aufgezeichneten Daten übereinstimmt und dass die Residuen nicht so groß sind, dass sie die Dosis-Wirkungs-Kurve flach machen. HINWEIS: Die Software fasst die Ergebnisse der nichtlinearen Regression zusammen und beschreibt die Konzentration, die die halbmaximale Antwort (EC 50 ), den Hill-Koeffizienten (n H ) und die halbmaximale Hemmkonzentration (IC 50 ) hervorruft. </li><li> Ableitung der Agonisten / Antagonisten-Parameter-Potenz. <ol><li> Leitet den Agonisten gleichIlibrium-Dissoziationskonstanten (K b ) aus einem der folgenden Experimente 16 , 17 , 18 <ol><li> Beurteilen Sie die Verschiebung in der Dosis-Antwort eines Agonisten im Wettbewerb mit einer festen Konzentration von Antagonisten. Hier ist EC 50 &#39;= EC 50 (1 + [Antagonist] / Antagonist Kb ), wobei EC 50 &#39; die rechtsverschobene EC 50 ist. </li><li> Assess [ 35 S] GTPγS-Bindung mit variierenden Konzentrationen des Antagonisten im Wettbewerb mit einer festen Konzentration von Agonisten. Hier ist K b = IC 50 / (2 + ([Agonist] / Agonist EC 50 ) n ) 1 / n - 1, wobei n der Hangkoeffizient des Agonisten ist. </li></ol></li></ol></li><li> Abhängig von der Variabilität der Daten, wiederholen Sie den Versuch (Schritte 3.8-5.6) für jeden Liganden etwa 3-5 mal und durchschnittlich die Ergebnisse mit einer Statistik und Analyse Softwsind. </li></ol>

<ol><li>Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+coupled+receptor+structure+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">G protein coupled receptor structure and activation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).</li>
<li>Neubig, R. R., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-protein+signalling+as+new+central+nervous+system+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov+1%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets.</a> Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).</li>
<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+drug+targets+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How many drug targets are there?</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li>
<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>Kobilka, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+sequencing%2C+and+expression+of+the+gene+coding+for+the+human+platelet+alpha+2-adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor.</a> Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).</li>
<li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin%3A+A+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).</li>
<li>Neer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/abstract/0092-8674(95)90407-7">Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals.</a> Cell. 80 (2), 249-257 (1995).</li>
<li>Londos, C., Salomon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Guanylylimidodiphosphate%2C+a+Potent+Activator+of+Adenylate+Cyclase+Systems+in+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).</li>
<li>Ross, E. M., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+Some+Components+of+Adenylate-Cyclase+Necessary+for+Catalytic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity.</a> J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).</li>
<li>Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholamine-Induced+Desensitization+of+Turkey+Erythrocyte+Adenylate-Cyclase+Is+Associated+with+Phosphorylation+of+the+Beta-Adrenergic-Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).</li>
<li>Wilden, U., Kuhn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Dependent+Phosphorylation+of+Rhodopsin+-+Number+of+Phosphorylation+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites.</a> Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).</li>
<li>Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Arrestin%3A+a+protein+that+regulates+beta-adrenergic+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function.</a> Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).</li>
<li>Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+receptor+signals+by+beta-arrestins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transduction of receptor signals by beta-arrestins.</a> Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).</li>
<li>Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+a+brief+history+and+personal+retrospective+of+seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).</li>
<li>Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+assessment+of+m1+muscarinic+acetylcholine+receptor-gq%2F11+protein+coupling+in+membranes+prepared+from+postmortem+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue.</a> J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).</li>
<li>Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+the+inhibition+constant+%28K1%29+and+the+concentration+of+inhibitor+which+causes+50+per+cent+inhibition+%28I50%29+of+an+enzymatic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction.</a> Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).</li>
<li>Lazareno, S., Birdsall, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+competitive+antagonist+affinity+from+functional+inhibition+curves+using+the+Gaddum%2C+Schild+and+Cheng-Pruso%C3%ADf+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations.</a> Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).</li>
<li>Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMar%C3%A9chal%2C+E+%22Chemogenomics+and+Chemical+Genetics%22">Chemogenomics and Chemical Genetics</a>. , Springer. 55-65 (2011).</li>
<li>Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Assessment+of+M1+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor-Gq%2F11+Protein+Coupling+in+Membranes+Prepared+from+Postmortem+Human+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue.</a> J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).</li>
<li>Milligan, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12559773">Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays.</a> Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Traynor, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14609727">The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology.</a> Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).</li>
<li>Traynor, J. R., Nahorski, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+by+mu-opioid+agonists+of+guanosine-5%27-O-%283-%5B35S%5Dthio%29triphosphate+binding+to+membranes+from+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells.</a> Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).</li>
<li>GTPγS Binding Assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).</li>
<li>Strange, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+GTP%CE%B3S+%28%5B35S%5DGTP%CE%B3S+and+Eu-GTP%CE%B3S%29+binding+assay+for+analysis+of+ligand+potency+and+efficacy+at+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors.</a> Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei getrennte, aber komplementäre Methoden: einen einfachen Ansatz zur Fraktionierung von Zellen und Geweben in breite, aber unterschiedliche Kompartimente und ein Mittel zur Untersuchung der GPCR-Signalisierung durch Messung der [ 35 S] GTPγS-Bindung. Die effiziente zelluläre Fraktionierung hat eine breite Palette von Anwendungen, angefangen von der Extraktion und Anreicherung von Proteinen bis hin zur Bewertung der subzellulären Lokalisation...

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die für eine bemerkenswerte Reihe von physiologischen Prozessen verantwortlich sind, einschließlich Analgesie, Olfusion und Verhalten 1 . GPCRs wirken, indem sie spezifische externe Signale erfassen und anschließend die intrazelluläre Signalisierung stimulieren. Sie markieren daher eine Schlüsselverbindung zwischen den äußeren und inneren Umgebungen einer Zelle. Aufgrund der kritischen Rolle, die GPCRs in der Biologie spielen, sind sie zu Hauptzielen für die Grundlagenforschung und die Wirkstoffforschung geworden 2 , 3 . Im Gegensatz zu anderen Rezeptorfamilien, die diskrete Liganden binden, können GPCRs sehr unterschiedliche Molekülarten binden. Während ein GPCR mit Peptiden interagieren kann, kann ein anderer Photonen, kleine Moleküle oder Ionen 1 , 4 feststellen. Während ihre Liganden vielfältig sind, sind GPCRs in ihrem Gesamtarchitekten vereintUnd Funktion. Individuelle GPCRs bestehen aus sieben α-helicalen Transmembranproteinen mit extrazellulären Aminoterminals und intrazellulären Carboxylterminals 5 , 6 . GPCRs sind an intrazelluläre G-Proteine-heterotrimere Proteinkomplexe aus α-, β- und γ-Untereinheiten gekoppelt, die verschiedene Signalwege vermitteln 7 . Die G &amp; agr ; -Untereinheit ist ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein, das inaktiv ist, wenn es an Guanosindiphosphat (GDP) gebunden ist und aktiv ist, wenn es an Guanosintriphosphat (GTP) 8 , 9 gebunden ist. Wenn GPCRs ihre Liganden binden, unterliegen sie einer Konformationsänderung, die es ermöglicht, dass G &amp; agr; von G &amp; bgr; &amp; ggr ; abtrennt , wodurch G &amp; agr; das GDP für GTP 7 austauschen kann. Der Rezeptor selbst wird an seinem Carboxylterminal durch verschiedene Serin / Threon phosphoryliertIne-Kinasen 10 , 11 und verinnerlicht, um die Rezeptorsignalisierung 12 , 13 , 14 zu dämpfen. Mittlerweile verlaufen das aktivierte G &amp; agr; -Monomer und das G &amp; bgr; &amp; ggr ; -Dimer , um unterschiedliche Signalwege 7 zu aktivieren. Es gibt mehrere Isoformen jeder G-Protein-Untereinheit, und jede Isoform zielt auf bestimmte nachgeschaltete Wege und sekundäre Messenger-Systeme ab. Die Haupt-G &amp; agr; -Isoformen umfassen G s , G q , G i / o und G 12-13 . Typischerweise assoziieren einzelne GPCRs mit einer bestimmten G &amp; agr; -Isoform, wodurch ein externer Stimulus mit einer spezifischen zellulären Antwort 1 verbunden wird. Die Charakterisierung einer GPCR-Ligand-Interaktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie des Rezeptors. Da der BIP / GTP-Austausch einer der frühesten Vorabend istNts, die der Ligandenbindung folgen, die Überwachung der GTP-Bindung kann die GPCR-Aktivierung oder Hemmung messen. Das Testen von mehr nachgeschalteten Ereignissen in der GPCR-Signalisierung ist oft nicht so quantitativ oder stöchiometrisch, kann nicht vollständige Agonisten von partiellen unterscheiden und kann teure Reagenzien erfordern. Darüber hinaus ist eine erhöhte GTP-Bindung an G &amp; agr; -Proteine ​​ein fast universelles Ereignis nach der GPCR-Aktivierung, was bedeutet, dass die Messung der GTP-Bindung ein weitgehend anwendbarer Assay zur Überwachung der Aktivität der meisten GPCRs ist. Die Messung der GTP-Bindung ist ein einfacher und schneller Ansatz zur Überwachung der GPCR-Signalisierung in Zellen, die den Rezeptor von Interesse oder in nativem Gewebe überexprimieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen funktionellen GTP-Bindungsassay unter Verwendung eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1), um die Aktivität eines Agonisten und Antagonisten auf GPCR-Signalisierung quantitativ zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt zunächst, wie man Rohmembranen aus Zellen, die MOR1 überexprimieren, isoliert. Anmerkung thaDieses Protokoll ist nicht auf Überexpressionssysteme beschränkt und kann auf viele Membranquellen angewendet werden, einschließlich natives Gewebe oder Präparate, die mehrere Rezeptoren und G-Proteine ​​ausdrücken. Das Protokoll beschreibt dann, wie man die Bindung eines radioaktiven GTP-Analogons an diese Membranen in Abhängigkeit von variierenden Konzentrationen von [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -Enkephalin (DAMGO) oder Naloxon, einem MOR1-Agonisten und -Antagonisten, beziehungsweise. Das GTP-Analog-, [ 35 S] Guanosin-5&#39;-O- (3-thio) triphosphat ([ 35 S] GTPγS) ist nicht hydrolysierbar. Diese Eigenschaft ist kritisch, da G &amp; agr; -Untereinheiten eine intrinsische GTPase-Aktivität 7 aufweisen und das markierte Gamma-Phosphat auf einer hydrolysierbaren GTP-Radiochemie eliminieren würden. Membranen werden dann auf Glasfaserfilter gefangen und gewaschen, wonach das radioaktiv markierte GTP durch Flüssigszintillationszählung quantifiziert wird. Mehrere pharmakologische Parameter können zu charakterisiert werdenE die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, einschließlich der halbmaximalen Antwort (EC 50 ) und des Hill-Koeffizienten (n H ) für Agonisten und der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC 50 ) und der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K b ) für die Antagonisten 16 , 17 , 18

<table><tbody><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein</td><td>Glutamin Thermo Fisher Scientific</td><td>10313021</td><td>Warm in einem 37°; C Wasserbad vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Warm in einem 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Warm in einem 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Warm in einem 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Warm in einem 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Zellkultur 10 cm Platte</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>1,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tris( Hydroxymethyl)aminomethan (Trizma-Base)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Tabletten, Mini, EASYpack Proteasehemmer Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DO632</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-1</td><td></td></tr><tr><td>Pelletstößel Motor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359971</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Bel Art</td><td>F19923-0001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>[35S]Guanosin-5'-O-(3-thio)triphosphat ([35S]GTP&gamma; S)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG030H</td><td></td></tr><tr><td>nicht radioaktiv markiertes Guanosin-5'-O-(3-thio)triphosphat (GTP&gamma; S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89378</td><td></td></tr><tr><td>Guanosindiphosphat (GDP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51060</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS-Spektralphotometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU640</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer Küvetten</td><td>USA Scientific</td><td>9090-0460</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>535027903</td><td></td></tr><tr><td>Glasfaserfilter&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1821-021</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfiltrationsgerät</td><td>Millipore Corporation</td><td>XX2702550</td><td></td></tr><tr><td>Desktop-Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>65717</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationszähler</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsflüssigkeit</td><td>Ecoscint A</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>Szintillations-Gegenfläschchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>592690</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchendeckel</td><td>Beckman Coulter</td><td>592928</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>PRISM 6</td><td></td></tr><tr><td>ATP1A1 Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom</td><td>a6F</td><td>1:1000 in 3% BSA</td></tr><tr><td>GAPDH Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>CB1001</td><td>1:5000 in 3 % BSA</td></tr><tr><td>H2B Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2934S</td><td>1:2500 in 3 % BSA</td></tr><tr><td>PDI Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>3501S</td><td>1:1000 in 3 % BSA</td></tr><tr><td>HA Antikörper</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>1:2000 in 3 % BSA</td></tr></tbody></table>

messung der g-protein-gekoppelten rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte gtp-bindung

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Transmembran-Rezeptoren, die in der normalen zellulären Physiologie kritische Rollen spielen und ein großes pharmakologisches Ziel für multiple Indikationen darstellen, einschließlich Analgesie, Blutdruckregulation und Behandlung psychiatrischer Erkrankungen. Nach der Ligandenbindung katalysieren GPCRs die Aktivierung von intrazellulären G-Proteinen durch Stimulierung des Einbaues von Guanosintriphosphat (GTP). Aktivierte G-Proteine ​​stimulieren dann Signalwege, die zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die GPCR-Signalisierung kann durch Messung des Einbringens einer radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren Form von GTP, [ 35 S] Guanosin-5&#39;-O- (3-thio) triphosphat ([ 35 S] GTPγS) in G-Proteine ​​überwacht werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die mehr nachgeschaltete Signalisierungsprozesse beurteilen, misst [ 35 S] GTPγS-Bindung ein proximales Ereignis in der GPCR-Signalisierung und kann vor allem Agonis unterscheidenTs, antagonisten und inverse agonisten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine empfindliche und spezifische Methode zum Studieren der GPCR-Signalisierung unter Verwendung von Rohmembranpräparationen eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1). Obwohl alternative Ansätze zur Fraktionierung von Zellen und Geweben existieren, sind viele kostenaufwendig, langwierig und / oder erfordern nicht standardisierte Laborgeräte. Die vorliegende Methode liefert ein einfaches Verfahren, das funktionelle Rohmembranen angereichert. Nach der Isolierung von MOR1 wurden verschiedene pharmakologische Eigenschaften seines Agonisten, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) und Antagonist, Naloxon, bestimmt.

Zellfraktionierung kann verwendet werden, um Membran-assoziierte Proteine ​​aus zytosolischen und nuklearen Proteinen zu isolieren und zu bereichern. Abbildung 1 ist ein Western-Blot, der den Inhalt der drei primären Fraktionen demonstriert, die während des subzellulären Fraktionierungsprozesses gesammelt werden können. Speziell zeigt Fig. 1 , daß die Fraktionierung Membranproteine ​​( dh Na + / K + ATPase, Proteindisul...

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5&#39;-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zelluläre Membranen, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder GPCR enthalten, zu isolieren und die Pharmakologie von GPCR mithilfe eines funktionellen GTP-Bindungs-Assays zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biochemie bezüglich der pharmakologischen Eigenschaften etablierter oder sogenannter „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptoren zu beantworten. Die Hauptvorteile liegen in der Einfachheit, Schnelligkeit und der Messung des nächstgelegenen Ereignisses in der Signalübertragung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren.Zunächst humanen embryonalen Nierenzellen in 10 Milliliter vollständigem DMEM auf eine 10 cm große Zellkulturplatte aussäen. Die Zellen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren, bis eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht ist. Nach der Inkubation die Zellen mit HAMOR1 unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsreagenzes gemäß den Herstelleranweisungen transfectieren.Anschließend die Zellen wie zuvor beschrieben für 36 bis 48 Stunden inkubieren. Nach dem Entfernen der transfizierten Zellen aus dem Inkubator das Medium abziehen und die Zellen mit fünf Millilitern eiskalter PB

measuring-g-protein-coupled-receptor-signaling-via-radio-labeled-gtp

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschreiben wir detailliert Live Cell Imaging Verfahren zur Untersuchung Chemotaxis. Wir präsentieren fluoreszenzmikroskopische Methoden zur raum-zeitlichen Dynamik der Signalwege bei der Migration von Zellen zu überwachen. Die Messung der Signal-Ereignisse ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie ein GPCR-Signalisierung Netzwerk Gradienten Erfassung Lockstoffe und steuert direktionale Migration von eukaryotischen Zellen erreicht.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Eine Methode zur Abschätzung der Affinitätskonstante eines Agonisten für den aktiven Zustand...

Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Einfache Methoden zum Nachweis der selektiven Aktivierung von G-Proteinen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren stellen nach wie vor eine herausragende Herausforderung bei der zellulären Signalübertragung dar. Hier wurden Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) Biosensoren entwickelt, indem ein GPCR an G-Proteinpeptide paarweise gebunden wurde, um Konformationsänderungen bei kontrollierten Konzentrationen in lebenden Zellen zu untersuchen.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.

Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Prenylation und Guanosin-5'-Triphosphat (GTP) untersuchen-Laden von Rho GTPase. Dieses Protokoll besteht aus zwei detaillierte Methoden, nämlich Membran Fraktionierung und ein GTPase verbundene Immunosorbentprobe assay. Das Protokoll kann verwendet werden, zur Messung der Prenylation und GTP Laden von verschiedenen anderen kleinen GTPasen.

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

Da GPCRs attraktive arzneimittelfähige Ziele sind, ist das GPCR-Ligandenscreening daher für die Identifizierung von Bleiverbindungen und für Deorphanisierungsstudien unerlässlich. Im Rahmen dieser Bemühungen beschreiben wir PRESTO-Tango, eine Open-Source-Ressourcenplattform, die für die gleichzeitige Profilierung der vorübergehenden Rekrutierung von "Arrestin2" bei ca. 300 GPCRs mit einem TEV-basierten Reportertest verwendet wird.

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen über die Unterfamilie der S1P-Rezeptoren (S1PRs). Hier wird eine Pipeline beschrieben, um die Strukturen und Funktionen von S1PRs zu erläutern.

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von BRET-basierten Biosensoren zur Echtzeitmessung der G-Protein-Aktivierung in lebenden HEK293-Zellen nach Stimulation durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorliganden. Hier dienen der β2-adrenerge Rezeptor und der Cannabinoid-Typ-1-Rezeptor als Beispiele, um die Effizienz von Sensoren für mehrere G-Protein-Subtypen und über verschiedene GPCRs hinweg zu demonstrieren.

BRET-basierte G-Protein-Biosensoren zur Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivität in lebenden Zellen

Erfahren Sie, wie Sie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch radioaktiv markierte GTP-Bindung charakterisieren. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung von GPCR-Pharmakologie und Ligandeninteraktionen in Zellmembranen.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

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