Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert In vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die 5-Methylcytosin-Spiegel während der Chondrozyten-Dedifferenzierung zu bestimmen. Diese Methode zeigt, dass sie bei der Beantwortung wichtiger Fragen bei der Behandlung von zellbasierten Knorpeldefekten, wie z. B. der autologen Chondrozytenimplantation, helfen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine zuverlässige, einfache und schnelle Methode zum Nachweis des allgemeinen DNA-Methylierungsniveaus handelt, um den Chondrozyten-Phänotyp zu bewerten.

Die Implikation dieser Technologie ist Standard für unseren Anteil an der autologen Chondrozytenimplantation, da die DNA-Methylierung während der Chondrozyten-Dedifferenzierung ein großes Hindernis für die autologe Chondrozytenimplantationsbehandlung bei Knorpeldefekten darstellt. Obwohl diese Methode einen Einblick in den DNA-Methylierungsgrad bei der Chondrozyten-Dedifferenzierung geben kann, kann sie auch auf andere Studien von Krankheiten, wie z. B. Osteoarthritis, angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir die Protokolle in den Referenzen einer Dot-Blot-Methode lasen.

Bitte zeigen Sie, dass diese Methode von entscheidender Bedeutung ist, da die Zustände eines Dot-Blots schwer zu benennen sind. Genomische DNA sollte denaturiert und dann seriell verdünnt werden. Lassen Sie sich dann auf einer positiv geladenen Nylonmembran abstützen.

Die Verfahren werden von Zhaofeng Jia, einem Doktoranden aus unserem Labor, vorgeführt. Das in dieser Studie verwendete Gelenkknorpelgewebe wurde aus den Kniegelenken von Spenderpatienten nach einem Trauma isoliert. Würfeln Sie den Knorpel mit einem sterilen Skalpell in ein bis zwei Kubikmillimeter große Stücke.

Geben Sie dann ein Milligramm Kollagenase II und DMEM pro Milliliter zum gehackten Knorpel. Und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden, um die Chondrozyten zu verdauen. Am nächsten Tag filtrieren Sie die resultierende Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb.

Schleudern Sie die Zellen herunter. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie PBS hinzu und drehen Sie wieder nach unten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Und Samen mit einer Dichte von 20.000 bis 30.000 Zellen pro Quadratzentimeter und DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Kultur in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Ernten Sie subkonfluente Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA.

Und mit einer Dichte von 6.600 Zellen pro Quadratzentimeter neu plattieren. Kultivieren Sie die Chondrozyten in Monoschichten für bis zu sechs Passagen und beurteilen Sie sie an den Passagen eins, zwei, drei, vier und fünf. Um dieses Verfahren zu beginnen, sammeln Sie Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugation.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Lysepuffer pro 10 Millionen Zellen durch Pipettieren und schnelle Inversion. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Proteinase K in einer Konzentration von 160 Mikrogramm pro Milliliter Zelllysat zugeben und das Gemisch kräftig invertieren.

Sechs Stunden lang bei 55 Grad Celsius inkubieren. Zu jeder Probe wird ein Volumen Tris pH 7,9 gesättigtes Phenol zu Chloroform zu Isoamylalkohol hinzugefügt. Schütteln Sie die Probe von Hand etwa 20 Sekunden lang gründlich.

Die Proben werden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.000 μg zentrifugiert. Entfernen Sie die obere wässrige Phase und geben Sie sie in ein frisches Röhrchen. Um das Phenol zu entfernen, geben Sie ein gleiches Volumen Chloroform in jedes Röhrchen.

Mit der Hand schütteln und nach unten drehen. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie 0,1 Probenvolumen von drei molaren Natriumacetat mit einem pH-Wert von acht und zwei Volumen von 100 % Ethanol hinzu.

Lagern Sie die Röhrchen über Nacht bei minus 20 Grad Celsius, um die genomische DNA auszufällen. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 16.000 Mal G, um die genomische DNA zu pelletieren. Waschen Sie die Proben mit 70%Ethanol.

Und zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius für zwei Minuten bei 13.000 Mal G. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und trocknen Sie das DNA-Kügelchen an der Luft. Resuspendieren Sie die DNA in 10 Millimolar Tris pH acht 0,1 Millimolar EDTA. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die isolierte DNA 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in 0,1 molarem Natriumhydroxid denaturieren.

Neutralisieren Sie die DNA mit einem molaren Ammoniumacetat auf Eis. Und dann mit doppelt destilliertem Wasser zweifach verdünnen. Der wichtigste Schritt bei den Dot-Blot-Assays ist das Spotting der Proben, und denken Sie daran, dies langsam und vorsichtig zu tun.

Versuchen Sie, jedes gefleckte Array auf einen Durchmesser von drei bis vier Millimetern zu minimieren. Platzieren Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig zwei Mikroliter der seriell verdünnten genomischen DNA auf einer positiv geladenen Nylonmembran in der Mitte des Gitters. Tupfen Sie die Membran bei 80 Grad Celsius 30 Minuten lang ab.

Blockieren Sie anschließend die unspezifischen Antikörperbindungsstellen, indem Sie die Membran in einer 10 Zentimeter großen Petrischale eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer 10 Zentimeter großen Petrischale unter leichtem Schütteln in 5 %BSA in TBST einweichen. Waschen Sie die Membran nach einer Stunde dreimal für jeweils fünf Minuten in TBST. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit einem monoklonalen Anti-5-Methylcytosin-Antikörper der Maus in TBST bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal jeweils fünf Minuten lang in TBST. Dann mit einem Sekundärantikörper, Meerrettichperoxidase-konjugiertem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin G in TBST für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie die Membran wie zuvor in TBST gewaschen haben, fügen Sie der Membran das Enzymsubstrat hinzu und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang.

Visualisieren Sie abschließend das Sekundärantikörpersignal mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Chondrozyten, die bis zur sechsten Passage in einer Monoschicht kultiviert wurden, zeigten progressive phänotypische Veränderungen, die mit aufeinanderfolgenden Passagen stark eingeklemmt und abgeflacht wurden. Diese morphologische Veränderung ist typisch für den Prozess der Dedifferenzierung der Chondrozyten.

Genomische DNA wurde aus Chondrozyten isoliert, nachdem eine unterschiedliche Anzahl von Passagen und DNA-Methylierungsniveaus mit einem 5-Methylcytosin-spezifischen Dot-Blot-Assay bestimmt wurden. Die Intensitäten der Punkte wurden dann mit Bild J analysiert. Progressiv erhöhte fünf Methylcytosin-Spiegel wurden bei längerer Subkultur beobachtet, was auf einen Zusammenhang zwischen allgemein erhöhten Methylierungswerten und Chondrozyten-Dedifferenzierung hindeutet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 24 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die genomische DNA-Konzentration und -Reinheit zu maximieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie genomische DNA-Maschination, Profiling durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Chondrozyten der Dedifferenzierung in Monokulturen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der autologen Chondrozytenimplantation, um die DNA-Bearbeitung von Chondrozyten zu bewerten und den Chondrozyten-Phänotyp bei der Behandlung von Knorpeldefekten zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den 5-Methylcytosin-Dot-Blot verwenden, um degenerierte Bearbeitungshebel zu erkennen und den Chondrozyten-Phänotyp zu bewerten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol äußerst gefährlich sein kann und bei diesem Verfahren immer Handschuhe getragen werden sollten.