Mehrschicht-Cortical Ca ²⁺ Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die gleichzeitige Visualisierung der neuronalen Aktivität über mehrere Schichten kortikaler Neuronen hinweg mit Hilfe von Kalziumindikatoren in einer sich frei verhaltenden Maus zu ermöglichen und die Funktionsweise neuronaler Schaltkreise mit Hilfe eines miniaturisierten Fluoreszenzmikroskops am Kopf zu verstehen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der systemischen Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie der Informationspropagator über mehrere Schichten des Kortex verteilt ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, große Populationen genetisch kodierter Neuronen über mehrere kortikale Schichten hinweg in frei verhaltenden Tieren zuverlässig über die Zeit zu visualisieren.

Um genetisch kodierte Neuronen aus mehreren kortikalen Schichten in einem sich frei verhaltenden Tier sichtbar zu machen, müssen die folgenden Verfahren durchgeführt werden, und dieses Protokoll hebt die Implantation der Prismensonde, die Installation der Grundplatte und die In-vivo-Bildgebung in einer sich frei verhaltenden Maus hervor. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, legen Sie das Tier ein bis zwei Wochen nach der Virusinjektion in den stereotaktischen Apparat und bereiten Sie sich auf die Operation des Prismensondenimplantats vor, indem Sie es mit 70%igem Ethanol desinfizieren und mit Linsenpapier reinigen. Öffnen Sie anschließend eine runde Kraniotomie mit einem Mikrobohrer mit einem 0,5-Millimeter-Grat

Stellen Sie sicher, dass der Durchmesser der Kraniotomie nur größer ist als der Prismendurchmesser. Positionieren Sie dann die Kraniotomie so, dass die flache Kante des Prismas beim Einsetzen in den Kortex zur Virusinjektionsstelle zeigt und sich in einem Radius von 150 bis 200 Mikrometern befindet. Entfernen Sie danach die Dura mit einer feinen Pinzette.

Halten Sie das Gewebe immer mit steriler Kochsalzlösung feucht, sobald das Hirngewebe freigelegt ist. Dadurch wird auch der Druck auf das Gewebe aufrechterhalten. Um den Druck im Hirngewebe während des Einführens der Prismensonde zu verringern, erstellen Sie einen Einführtrakt, indem Sie ein gerades Präpariermesser am Elektrodenhalterarm des stereotaktischen Apparats anbringen.

Montieren Sie es in einem Winkel, so dass die Messerplatte senkrecht zur Krümmung des Schädels und in einer Ebene parallel zur Virusinjektionssäule steht. Positionieren Sie das Messer vorsichtig über der Kraniotomie, entlang der inneren Medienkante und etwa 200 Mikrometer lateral der Virusinjektionsstelle, wobei die Schneide nach hinten zeigt. Stellen Sie die Z-Achse auf Null, wenn die Messerspitze die Pia berührt.

Senken Sie es dann allmählich auf eine Tiefe ab, in die die Prismensonde eingeführt wird. Bewegen Sie anschließend das Messer einen Millimeter nach hinten, um einen Weg für die Vorderkante des Prismas zu schaffen. Ziehen Sie das Messer mit dem stereotaktischen Armmikromanipulator langsam in Schritten von 10 Mikron pro Sekunde zurück und legen Sie ein Stück Gelschaumschwamm, der mit steriler Kochsalzlösung getränkt ist, über den Schnitt.

Befestigen Sie anschließend den Objektivhalter am stereotaktischen Manipulatorarm im gleichen Winkel wie das Messer im vorherigen Schritt. Richten Sie das Prisma so aus, dass sich die flache Seite des Prismas über dem Einschnitt und parallel zur Virusinjektionssäule befindet. Sobald sich das Prisma im richtigen Winkel befindet, senken Sie es für diese Sonde schrittweise in 10-Mikrometer-Schritten auf ein endgültiges Z-Niveau von 1,1 Millimeter von der Gehirnoberfläche ab.

Decken Sie das freiliegende Gewebe um das Prisma in der Kraniotomie mit einer sehr dünnen Schutzschicht Elastomerkleber mit einer 25-Gauge-Nadel ab. Um zu verhindern, dass sich die Linse in der Kraniotomie bewegt, tragen Sie nach dem Aushärten des Elastomerklebers mit einer 25-Gauge-Nadel etwas Cyanacrylatkleber auf, um das Glas der Prismenlinse am angrenzenden Schädel über der Schicht aus Elastomerkleber zu befestigen. Sobald der Cyanacrylat-Kleber ausgehärtet ist, schrauben Sie den Linsenhalter ab und entfernen Sie vorsichtig das Mikroskop.

Ziehen Sie dann den stereotaktischen Manipulatorarm langsam ein, um die Prismensonde sicher implantiert zu lassen. Tragen Sie eine Schicht Zahnacrylat- oder Cyanacrylatkleber um das Implantat auf, um die freiliegende Schädeloberfläche zu bedecken, ohne das umgebende zurückgezogene Muskelgewebe zu berühren. Wenn Sie einen großen Bereich des Schädels mit dieser Schädelkappe abdecken, hilft dies später bei der Befestigung der Basisplatte.

Mischen Sie anschließend die Katalysatorendbasis aus einer Silikon-Klebespritze und geben Sie einen Tropfen des Elastomers in die Prismensondenmanschette, um die Oberseite der Sondenlinse abzudecken, um Schäden und Staubablagerungen zu verhindern. Eine Woche bis 10 Tage nach der Implantation der Prismensonde ist die Virusexpression im Gewebe durch die implantierte Prismensonde zu überprüfen. Entfernen Sie dazu die Silikonklebekappe über der Oberfläche der implantierten Prismensondenlinse.

Untersuchen Sie die Oberfläche der Sondenlinse und reinigen Sie alle Ablagerungen vorsichtig mit Linsenpapier und 70 % Ethanol, um sicherzustellen, dass die Bildgebungsoberfläche sauber ist. Befestigen Sie als Nächstes eine Grundplatte am Mikroskop und befestigen Sie die Stellschraube der Grundplatte, um sie in Position zu halten. Befestigen Sie dann das Mikroskop im Mikroskopgreifer am stereotaktischen Mikromanipulatorarm.

Befestigen Sie den Greifer an einer Stange, die am stereotaktischen Mikromanipulatorarm montiert werden kann. Positionieren Sie anschließend das Mikroskop mit dem stereotaktischen Mikromanipulatorarm über der Prismensondenlinse. Überprüfen Sie die Ausrichtung visuell, indem Sie die Prismenlinse von der Seite und von der Rückseite des Tiertisches betrachten.

Die optische Achse sowohl des Mikroskopobjektivs als auch der Prismensonde muss ausgerichtet sein. Starten Sie anschließend die Erfassungssoftware, wählen Sie das Projekt aus und schalten Sie die Mikroskop-LED über die Software ein. Bewerten Sie die Qualität der Mikroskopausrichtung, indem Sie sich in der Erfassungssoftware auf die obere Phase der implantierten Prismensondenlinse konzentrieren, indem Sie den Manipulatorarm der Stereotax bewegen.

Wenn sie richtig ausgerichtet sind, sollten die Ränder der Prismensondenlinse scharf erscheinen. Passen Sie den physikalischen Abstand des Mikroskops über der implantierten Prismensonde an, indem Sie den stereotaktischen Manipulatorarm verwenden, um die gewünschte Fokusebene im Gewebe zu erhalten. Verwenden Sie dann Dentalacrylat oder Cyanoacrylat, um die Grundplatte dauerhaft an der Acrylkappe zu befestigen und den Spalt zu überbrücken.

Es ist wichtig, keinen Klebstoff auf einen Teil des Mikroskopgehäuses oder die Stellschraube aufzutragen, während die Grundplatte auf den Kopf des Tieres geklebt wird. Lösen Sie nun das Mikroskop vom Greifer und ziehen Sie den Greifer vom Mikroskop zurück. Wenn Cyanoacryl oder ein anderer transparenter Klebstoff verwendet wurde, bedecken Sie ihn mit schwarzem Nagellack oder einer Schicht schwarzem Zahnzement, um zu verhindern, dass Umgebungslicht in die Kopfkappe eindringt, was zukünftige Bilder, die während der Experimente aufgenommen wurden, verunreinigen kann.

Schützen Sie dann die implantierte Prismensonde mit der Abdeckung der Grundplatte. Schließen Sie bei diesem Verfahren das Mikroskop an die an den Computer angeschlossene Datenerfassungsbox an und starten Sie die Erfassungssoftware. Entfernen Sie dann die Abdeckung der Grundplatte, indem Sie die Stellschraube der Grundplatte gegen den Uhrzeigersinn drehen und die Abdeckung der Grundplatte herausheben.

Säen Sie das Mikroskop in die Grundplatte auf dem Tier. Das Mikroskop sollte mit Hilfe der Magnete auf der Grundplatte einrasten. Schieben Sie dann die Stellschraube der Grundplatte vor, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist.

Wählen Sie danach die Aufnahmeeinstellungen aus, die zum Erfassen der Daten verwendet werden sollen, einschließlich der Bildrate für die Datenerfassung. Überprüfen Sie bei der Auswahl der Einstellungen das Bildhistogramm, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten. Beginnen Sie dann mit dem Abrufen der Daten.

Wenn die Aufzeichnung abgeschlossen ist, lösen Sie die Stellschraube der Grundplatte und lösen Sie das Mikroskop von der Grundplatte, indem Sie das Mikroskop vorsichtig nach oben ziehen. Bringen Sie anschließend die Abdeckung der Grundplatte wieder an und ziehen Sie die Stellschraube der Grundplatte vorsichtig fest. Hier ist eine Demonstration eines Tieres, das mit dem Mikroskop montiert ist und frei mit den Objekten in der Verhaltensarena interagiert.

Während der Wachbildgebung mit dem System wurde die Aktivität der somatosensorischen kortikalen Neuronen aufgezeichnet, wenn die Maus drei verschiedenen Umgebungen ausgesetzt war. Offenes Feld am ersten Tag, Objektgewöhnung an den Tagen zwei bis vier und an neuen Objekten am fünften Tag. Nach der Zellextraktion mit der Calcium-Bilddatenanalysesoftware wurden räumliche Filter, die den Zellstandorten entsprachen, über die Projektion der mittleren Fluoreszenzintensität der Mikroskopaufzeichnungsdaten gelegt.

Eine weiße gestrichelte Linie trennt die Zellen zwei, drei und fünf. Entsprechende Kalziumspuren von fünf Zellen aus jeder der Schichten zeigen das Landwirtschaftsmuster der Zellen in zwei verschiedenen Verhaltenskontexten: Objektgewöhnung und neuartige Objektexposition. Die Zellen der zweiten Schicht waren an dem Tag, an dem die Maus einem neuartigen Objekt ausgesetzt war, aktiver als die Zellen der fünften Schicht.

Hier sind die restlichen Diagramme der Zellaktivitäten von den oberflächlichen Entitätsspielern, als sich das Tier auf offenem Feld befand, Objektgewöhnung und Erkundung neuartiger Objekte. Einmal gemeistert, kann jede Technik innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher der systemischen Neurowissenschaften, um spezifische Zelltypen in verschiedenen Gehirnbereichen zu erforschen und gleichzeitig unterschiedliche Verhaltensparadigmen beim Dröhnen und anderen Modellen der Neurophysiologie bei Krankheiten zu nutzen.

Anhand dieses Protokolls sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehrere Schichten des somatosensorischen Kortex markiert, eine Prismensonde implantiert und ein am Kopf montiertes miniaturisiertes Mikroskop anbringt.