Vorbereitung und Charakterisierung von neuartigen HDL-imitierenden Nanopartikeln für die Nervenwachstumsfaktorverkapselung

Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist die Vorstellung von Methoden zur Herstellung und Charakterisierung von mit Nervenwachstumsfaktor beladenen, hochdichten Lipoproteinen nachempfundenen Nanopartikeln. Zur Herstellung von normalen, hochdichten Lipoproteinen nachempfundenen Nanopartikeln wurde eine einfache Homogenisierung verwendet. Das Verfahren ist einfach und skalierbar.

Außerdem verbesserte das Nanopartikel die Einschlusswirkung erheblich, ebenso NGF und APOA1 in den Nanopartikeln. Verschiedene Herausforderungen bei der Charakterisierung eines Nanopartikels wurden überwunden, darunter die Trennung von nicht eingekapseltem NGF von den NGF-Nanopartikeln, die Durchführung zuverlässiger in-vitro-Radiustudien sowie die Bioverfügbarkeit von NGF-Nanopartikeln. Zunächst mischen Sie 10 Mikroliter NGF mit 10 Mikrolitern Protamin USP in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lassen die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um den Komplex zu bilden.

Fügen Sie als Nächstes 59 µL Phosphatidylcholin und 11 µL Sphingomyelin einem Glasvial hinzu. Geben Sie außerdem 4 µL Phosphatidylserin, 15 µL Cholesterylolat und 45 µL Tocopheryl-polyethylenglycol-succinat hinzu. Mischen Sie die Komponenten und verdampfen Sie das Ethanol unter einem schwachen Stickstoffstrom für etwa fünf Minuten.

Alle Hilfsstoffe sollten einen ölig-dünnen Film am Boden des Glasfläschchens bilden. Ein Milliliter ultrareines Wasser wird dem Fläschchen zugesetzt und fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 9.500 U/min homogenisiert, um die Prototyp-Nanopartikel oder NPs zu bilden. Anschließend wird der vorbereitete Komplex zu den Prototyp-NPs gegeben.

Die Suspension unter Verwendung eines kleinen Rührstabs in der Glasflasche 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Die NPs durch Rühren bei Raumtemperatur weitere 30 Minuten abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen 106 Mikroliter Apolipoprotein A-1 hinzufügen und über Nacht bei Raumtemperatur rühren, um die endgültigen NGF-HDL-mimetischen NPs zu bilden.

Messen Sie die Partikelgröße und das Zetapotential mithilfe eines Partikelanalysators gemäß den Herstelleranweisungen. Eine vernetzte Gelfiltrations-Chromatographiesäule wird verwendet, um das nicht eingekapselte NGF von den NGF-HDL-mimetischen Nanopartikeln zu trennen und die Einschlusswirkung des NGF zu bestimmen. Für die Säulenvorbereitung überführen Sie 15 Milliliter der Sepharose-4B-CL-Suspension in einen 50-Milliliter-Becher.

Rühren Sie die Perlsuspension um und geben Sie etwas davon in eine Säule. Klopfen Sie die Säule vorsichtig, um Blasen zu entfernen. Lassen Sie das Lösungsmittel ablaufen und die Perlen einige Minuten lang absetzen.

Fügen Sie die restliche Suspension weiterhin hinzu. Spülen Sie die Innenwand der Säule, um die Kügelchen zu reinigen. Lassen Sie das Lösungsmittel ab, bis der Lösungsmittelspiegel leicht über der Oberseite der stationären Phase steht.

Anschließend waschen und konditionieren Sie die Säule mit 20 Milliliter 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Um die Einschlusswirkung des NGF zu messen, geben Sie 200 Mikroliter NGF-HDL-mimetische NPs auf die Säule und eluieren mit 1X PBS. Wie zuvor sammeln Sie insgesamt 12 Fraktionen zu je einem Milliliter.

Behandeln Sie acht Dialysegefäße gemäß den Herstelleranweisungen vor. Geben Sie 30 Milliliter Freisetzungsmedium in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Erwärmen Sie es anschließend auf 37 Grad Celsius in einem Schüttler mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 135 U/min.

Schließen Sie das Dialyseröhrchen und geben Sie es in das Freisetzungsmilieu. Entnehmen Sie umgehend 100 Mikroliter des Freisetzungsmilieus außerhalb des Dialyseröhrchens als Probe für den Zeitpunkt null. Geben Sie die Probe sofort bei minus 20 Grad Celsius zur späteren Analyse ein.

Fügen Sie 100 Mikroliter frisches Freisetzungsmedium in das Zentrifugenröhrchen hinzu, um die entnommene Probe zu ersetzen. Starten Sie dann die Stoppuhr. Entnehmen Sie nach 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 und 72 Stunden jeweils 100 Mikroliter des Freisetzungsmediums und ersetzen Sie diese durch 100 Mikroliter frisches Medium.

Die entnommenen Proben sofort bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Analyse lagern. Nach einer dreiminütigen Homogenisierung wurden für die Prototyp-Nanopartikel gleichmäßige Partikelgrößen erzielt. Die endgültigen NGF-Nanopartikel wiesen eine Partikelgröße von 170 Nanometern mit einer engen und monodispersen Größenverteilung auf.

Unbeladene NGF und Nanopartikel wurden auf der Gelfiltrationssäule vollständig getrennt. Die Nanopartikel wurden in den Fraktionen zwei bis vier eluiert. Die ELISA-Messung zeigte, dass freie NGF in Fraktion 7 bis Fraktion 10 eluiert wurde.

Die berechnete Einschlusswirkung von NGF betrug etwa 66 %. Hier ist die in-vitro-Freisetzung von NGF-Nanopartikeln dargestellt. Durch Zugabe von PBS und BSA zum Freisetzungsmedium gelangte freies NGF mit einer Rückgewinnungsrate von über 85 % durch die Dialysemembran. Im Gegensatz dazu zeigten NGF-Nanopartikel ein langsames Freisetzungsprofil, wobei innerhalb von 72 Stunden etwa 10 % des NGF aus den Nanopartikeln freigesetzt wurden. NGF-Nanopartikel stimulierte das Neuritenwachstum in PC12-Zellen in ähnlichem Ausmaß wie freies NGF.

Das Auswachsen von Neuriten war unter dem Mikroskop bei beiden Gruppen deutlich zu beobachten, wenn eine Dosis von 50 Nanogramm pro Milliliter verabreicht wurde. NGF-Nanopartikel erhöhten deutlich die Plasma-Konzentration und verringerten die Aufnahme von NGF in Leber, Niere und Milz der Mäuse. HDL-mimetische Nanopartikel unterstützten NGF und ermöglichten eine lange Halbwertszeit bei der in-vivo-Stabilität.

Wenn die Methode einmal beherrscht ist, können monodisperse Nanopartikel innerhalb von drei Minuten mittels einer Homogenisierungsmethode hergestellt werden, sofern diese korrekt durchgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, einen sanften Stickstoffstrom zum Verdampfen des Lösungsmittels zu verwenden und sicherzustellen, dass nach der Homogenisierung kein Lipidrückstand an der Wand des Behälters haften bleibt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie HDL-mimetische Nanopartikel mittels einer Homogenisierungsmethode hergestellt und wie mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) beladene Nanopartikel charakterisiert werden können.