Verwendung von außergewöhnlichen optischen Übertragung kardiale Biomarker in humanem Serum quantifizieren

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Biomarker zu messen, die in einem komplexen biologischen Flüssigkeitshintergrund in klinisch relevanten Konzentrationen in einer Point-of-Care-Umgebung vorhanden sind, ohne dass aufwändige optische oder elektrische Setups erforderlich sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Biosensoren, die auf außergewöhnlicher Übertragung basieren, in Point-of-Care-Szenarien Realität werden zu lassen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine komplizierten elektrischen oder optischen Setups erforderlich sind.

In unseren Experimenten konnte es Biomarker in klinisch relevanten Konzentrationen zuverlässig nachweisen. Die Herstellung des Sensorchips erfolgt im Reinraum und kann nicht gefilmt werden. Zu Demonstrationszwecken wird das Verfahren hier durch eine Animation dargestellt.

Zur Vorbereitung der Nickelformschicht wird eine 220 Nanometer dicke Schicht aus negativem Elektronenstrahlresist auf einen 600 Mikrometer dicken vier Zoll großen Siliziumwafer aufgebracht. Schreiben Sie das entworfene Nanoloch-Array mit einem Elektronenstrahllithographiesystem auf diesen Wafer. Um das Schreiben des Elektronenstrahls zu beschleunigen, schreiben Sie die Muster mit einer Low-Dot-Map von 20.000 pro 300 Mikrometer Feldgröße.

Entwickeln Sie den Resist, indem Sie den vier Zoll großen Siliziumwafer 10 Sekunden lang in die Entwicklerlösung eintauchen und den Wafer an der Luft trocknen lassen. Scheiden Sie eine Ausgangsschicht eines Metalls wie Nickel, Kupfer oder Aluminium auf dem Siliziumwafer ab. Anschließend galvanisiert man den Wafer in einer Beschichtungsanlage innerhalb eines Nickel-Sulfamat-Bades in zwei Schritten.

Trennen Sie die Nickelform vom Silikonsubstrat, indem Sie sanfte, mechanische Kraft anwenden. Als nächstes prägen Sie mit einem Nanoimprinter die Nanomuster auf einen vier Zoll großen Glaswafer, der mit einem später 300 Nanometer dicken photohärtenden Nanoimprinting-Lithographie-Resist beschichtet wurde. Übertragen Sie die Form, den Fotolack und den Glaswafer in ein UV-Lichthärtungssystem und härten Sie es aus.

Wenn alle Schritte korrekt befolgt wurden, sollte die Nickelform leicht vom Fotolack entformt werden können. Nach dem Ätzen des Fotolacks auf dem Glas substraight, auf dem Glaswafer, scheiden Sie in einer Elektronenstrahlabscheidungsmaschine eine Chromschicht für die Metallhaftung und eine Goldschicht für den plasmonischen Sensor ab. Führen Sie das Abheben des Fotolacks durch dreiminütiges Ätzen mit Sauerstoffplasma durch, gefolgt von einem 15-sekündigen Sonofikationsschritt in Aceton.

Würfeln Sie dann die Probe in fünf mal fünf Millimeter große Chips. Das Nanoloch-Array wird das zentrale Quadrat von zwei mal zwei Millimetern des Chips einnehmen. Um die Daten zu erfassen, richten Sie die Vorrichtung so ein, dass sie die optischen Messungen durchführt, so dass ein Strahl aus weißem Licht, der durch das Ende der optischen Faser des Senders austritt, säulenförmig ist und in einem Winkel von 90 Grad auf die Sensoroberfläche einfällt.

Das Licht wird durch das gesamte Nanoloch-Array geleitet. Sammeln Sie das gesendete Signal mit der optischen Empfängerfaser und zeichnen Sie es mit einem UV-sichtbaren Spektrometer auf, das im Bereich von 300 bis 1.000 Nanometern arbeitet. Für den Empfindlichkeitstest des Sensorvolumens geben Sie die Standardflüssigkeit mit dem Brechungsindex in die Flüssigkeitszelle mit einem Brechungsindex von 1,31 bis 1,39.

Tauchen Sie den Sensorchip in die Standardflüssigkeit mit Brechungsindex und richten Sie ihn auf den weißen Lichtstrahl aus. Ermitteln Sie dann das Übertragungsspektrum. Reinigen Sie den Sensorchip nach jeder Messung mit einem oberflächenaktiven Reinigungsreagenz und trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas.

Reinigen Sie die Sensorchips für die Modifikation der Sensoroberfläche durch sequentielles Eintauchen in Isopropanol, Aceton und deionisiertes Wasser, bevor Sie chemisch modifiziert werden. Trocknen Sie dann die Sensorchips bei Raumtemperatur in einem Dampf aus trockenem Stickstoffgas. Als nächstes inkubieren Sie die Sensorchips 12 Stunden lang in einer ethanolischen Lösung bei Raumtemperatur.

Dadurch entsteht eine aminreaktive, selbstorganisierende Monoschicht. Nach der Inkubation die Chips mit Ethanol gründlich abspülen und bei Raumtemperatur trocknen. Tauchen Sie anschließend die Chips 15 Minuten lang in eine Mischung aus 75 Millimolar Sulfo n Hydroxysuccinimid und 15 Millimolar EDC.

Dadurch wird die Carboxsilic-Gruppe der selbstorganisierenden Monoschicht aktiviert. Spotten Sie dann 50 Mikroliter einer Anti-Triponent-Antikörperlösung mit 200 Mikrogramm pro Milliliter, die in einem Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 hergestellt wurde, auf die Sensoroberfläche. Nach einer 30-minütigen Inkubation deaktivieren Sie die nicht reaktiven Ester, indem Sie den Sensorchip 15 Minuten lang in eine molare Ethanolamin-HCL-Lösung eintauchen.

Zum Schluss wird der Chip mit entionisiertem Wasser abgespült und in einem Strom aus trockenem Stickstoffgas bei Raumtemperatur getrocknet. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung, indem Sie 100 Mikroliter 1%ige Rinderserumalbuminlösung auf die Oberfläche des Sensorchips aufbringen. 15 Minuten inkubieren.

Spülen Sie die Sensorchips dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Setzen Sie den Chip in die Messzelle ein, um das Übertragungsspektrum aufzuzeichnen. Dies ist das Referenzspektrum.

Platzieren Sie dann 50 Mikroliter des kardialen Troponin-Standards auf der Oberfläche des Chips. Inkubieren Sie den Chip 30 Minuten lang in einer feuchten Umgebung. Nachdem Sie die Sensorchips dreimal in PBS-Lösung gespült haben, setzen Sie diese in die Messzelle ein, um das Transmissionsspektrum aufzuzeichnen.

Dies ist das Nachbindungsspektrum. Tauchen Sie die Chips anschließend eine Minute lang in 50 Millimolare Glycin-HCL und spülen Sie sie dann dreimal in PBS-Lösung, um die Oberfläche des Chips zu regenerieren. Messen Sie das Übertragungsspektrum in PBS, um den Erfolg des Regenerationsschritts zu überprüfen.

Es wird gezeigt, wie sich das Transmissionsspektrum des Biosensors bei der Wechselwirkung mit 30 Nanogramm pro Milliliter humanem kardialem Troponin im Serum ändert. Das blaue Diagramm stellt die Zeit vor der Interaktion dar, während das rote Diagramm nach der Interaktion darstellt. Der gestrichelte Kreis zeigt das Band an, das verfolgt wird.

Hier ist die Verschiebung der Wellenlänge für die zweite Bande bei Troponinkonzentrationen von 2,5 Nanogramm pro Milliliter, 7,5 Nanogramm pro Milliliter, 30 Nanogramm pro Milliliter und 75 Nanogramm pro Milliliter dargestellt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Dieses Diagramm zeigt die Verschiebung der Wellenlängen von Banden, die nach der Regeneration für einen Nanoloch-Biosensorchip beobachtet wurde.

Das Verschieben der Position des zweiten Bandes zurück in seine ursprüngliche Position zeigt an, dass der Regenerationsschritt erfolgreich war. Einmal gemeistert, kann die Messung bei richtiger Durchführung in einer Stunde durchgeführt werden. Bei der Messung von Bioanalyten bei dieser Methode ist es wichtig, frisch zubereitete Reagenzien zu verwenden.

Bitte achte darauf, dass du deine Verbrauchsmaterialien herausgibst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Biosensoren herstellt, die nach dem Prinzip der außergewöhnlichen optischen Transmission arbeiten und Bioanalyten vor einem komplexen Hintergrund überwachen können. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, hochgenaue Nanoloch-Arrays zu erzeugen, die es ermöglichen, den Chip mit einer optischen Faser zu verbinden, ohne dass ein Mikroskop erforderlich ist und reproduzierbare Harze verwendet werden müssen.

Diese Technik ermöglicht es Ihnen, serielle Messungen durchzuführen, die im medizinischen Umfeld von entscheidender Bedeutung sind. Die Herstellung des Chips trägt wesentlich dazu bei, die Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten. Da die grundlegende Plattform gleich bleibt, werden weitere Verbesserungen dieser Technik durch die Verwendung der Technik mit besserer Auflösung erzielt, die die Empfindlichkeit verbessert, und durch die Verwendung von Signalverarbeitungsmethoden, um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Überwachung mehrerer Bioanalyten vor einem komplexen Serumhintergrund in einer Point-of-Care-Umgebung in Echtzeit.