Name: Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von rekombinantem mCD1d-Protein in High Five-Insektenzellen durch Baculovirus-Infektion. Diese Methode ermöglicht die Produktion von Tetrameren für NKT-Zell-Studien in der Entwicklungsimmunologie.

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I. auftauen Cells Nehmen Sie das Gefriergut Fläschchen TN5-Zellen und Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Fügen Sie 5ml von Insekten Express-Medium (Invitrogen, Katalog-Nummer-10486) in 25cm 2 TC Kolben. Beachten Sie, dass Express fünf, ohne Glutamin kommt; müssen 10ml 100X Glutamin Stift Strep oder Glutamin allein zu 1 lt Medien hinzufügen. Add TN5 Zellen hinein und inkubieren für 30 Minuten in ein 27 ° C Inkubator. Dann saugen das Medium mit DMSO vorsichtig, ohne die Zellen an der Unterseite der Flasche. Add 5 ml frisches Medium. II. Anbau und Ausbau der Zellen Überwachen Sie die Zellen jeden Tag. Wenn Kolben fast 70% konfluent ist, bringen die Zellen in Suspension durch Klopfen der Flasche auf beiden Seiten und den Transfer der Zellen bis 175cm 2 Flasche, indem 21 ml des Insect ausdrückliche mittel-und 5 ml Zellkultur. Jeder T175 Flasche sollte etwa 25-30ml Medium als ein Endvolumen haben. Split konfluenten Flasche (ca. 1 Mio. / ml konz.) 4.1 oder 5.1, wie gebraucht. Lassen Sie sich nicht Zellen überwuchern. Zählen Sie die Anzahl der Durchgänge, dass Sie die Zellen aufgeteilt. Nicht über Durchgang Nummer 30 wachsen, weil sie dazu führen können Alterung der Zellen, die Zell-Lyse. Wenn Sie die gewünschte Lautstärke erreicht bei einer Konzentration von 1 Mio / ml, infizieren die Zellen. I in der Regel werden bis zu 2 bis 2,5 Liter, die in der Regel Beträge bis siebzig 175cm 2 Flaschen und ca.. 25 bis 30 ml / Kolben oder fünf 1-Liter-Erlenmeyerkolben und ca.. 400ml und 500 ml in jeder Flasche Hinweis: Sie können entweder Zellen in T-175 Kegeldichtung Kolben oder Corning Erlenmeyerkolben wachsen. Wachsende Zellen in Erlenmeyerkolben ist schneller und einfacher. III. Titrierung der Virus durch End Point Dilution Method <ol><li> Platte 3000-5000 Zellen pro Well in Flachboden 96 well Platte in 200 &amp;mgr; l der Express fünf SFM Medium. Lassen Sie die Zellen bei 27 ° C für mindestens 30 Minuten absetzen. </li><li> Machen Verdünnungsreihe Baculovirus Lager. Man sollte 1 / 10 Verdünnung in einer Linie von 96-Well-U Bodenplatte zu tun, mit 250ul pro Vertiefung. Verdünnungen sind in Express Five SFM-Medium hergestellt. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette einen festen Betrag (meist 20 ul) aus verschiedenen Verdünnungen in die Zellen. </li><li> Kultur bei 27 ° C für 7 Tage. Um die Verdunstung von der Kante Reihen, wickeln Sie die Kanten der Platte mit Parafilm. </li><li> Nach 7 Tagen, überprüfen Sie die Platte und bestimmen, welche Verdünnung des Virus erhält eine 50%-Infektion - die Hälfte der Brunnen an dieser Viruskonzentration infiziert sind). Dann nutzen Sie eine Formel, um den Titer, die in pfu / ml (pfu-Plaque-bildenden Einheiten) ausgedrückt ist zu berechnen. Die Formel ist in den meisten Baculovirus Handbüchern. </li></ol> IV. Infektion der Zellen Es ist sehr wichtig, die genaue Titer der Viren wissen. Fügen Sie benötigte Menge an Virus. Bei viralen Stoffaufbereitung der Zellen sollte bei Multiplizität der Infektion (MOI) von nicht mehr als 1 (1pfu to Five Zelle 1High) Höhere MOI führt zur Produktion von Virus-Mutationen infiziert werden. Für Protein-Produktion, ist übliche Menge MO1 5-10. Beispiel: Der Titer mCD1d Baculovirus = 1X108 pfu / ml Add MOI = 1 (um den Virus zu verstärken) = 20X10 ^ 6 Zellen / Kolben / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / Kolben MOI = 5 bis 10 (für die Protein-Produktion) = 1 ml bis 2 ml Für 20x10 ^ 6 Zellen / Kolben Am Tag 4 nach der Infektion bei den infizierten Zellen zu suchen. Sie sollten gelöst werden, schwimmende, geschwollen und bilden Würstchen. V. Wiederherstellen Überstände Nehmen Sie das Medium von infizierten Kolben, und Transfer zum 250ml blaue Kappe Falcon Spinning-Flaschen. Sie können autoklaviert und wiederverwendet werden. Füllen Sie die Flaschen gleichmäßig und Zentrifuge die Zellen in Sorvall GSA Rotor bei 200rpm, 20 Minuten, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und fahren zur weiteren Reinigung. VI. Reinigung von rekombinantem mCD1d <ol><li> Dialyse und Konzentration in 150 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) </li><li> Mit Ni-NTA Agarose-Chromatographie eluieren Protein mCD1d + b2m mit 150mm Natriumphosphat +200 mm Immidazole </li><li> Run Entsalzungssäule mit 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 8 loswerden Immidazole </li><li> Run Anionenaustauschchromatographie mit MonoQ Spalte, um die restlichen Verunreinigungen zu beseitigen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf 1mg/ml mit YM 30-Konzentrator (Millipore) </li><li> BirA enzymatische biotynlation von mCD1d nach dem Protokoll des Herstellers (Avidität) </li><li> Das freie Biotin wird durch S200-Säule (Size Exclusion Chromatograpy) mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 eliminiert. Ein Durchschnitt von 2 bis 3 mg des biotynlated Protein könnte aus 2 Liter Überstand erhalten </li><li> Herstellung von a-GalCer CD1d Tetramer. </li></ol> Um CD1d Molekül mit a-GalCer Last, lösliche biotynlated CD1d-b2m wird über Nacht bei Raumtemperatur mit drei fachen molaren Überschuss an a-GalCer, in 0,5% zwischen -20 in PBS,% o, 9 Natriumchlorid aufgelöst inkubiert. Streptavidin und Inkubation für 4 Stunden bei Raumtemperatur - Tetramere werden durch Mischen von a-GalCer geladen CD1d Monomeren mit 4-fach molaren Überschuss von PE erzeugt. Lagerung bei 48 ° C.

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

In diesem Verfahren wird gezeigt, wie zu initiieren, zu wachsen, zu infizieren Insektenzellen und wie die Baculovirus Verwendung dieser Zellen Titer. Die wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens sind Wartung von Zellen und die genaue Titer von Baculovirus wissen. Sobald Sie CD1 Tetramere erzeugt wird, kann sie als ein mächtiges Werkzeug zur Analyse von Glycolipid reaktiven T-Zellen verwendet werden. Baculovirus-Systeme sind ebenfalls weit verbreitet, rekombinante Proteine, darunter MHC-Klasse-II-Tetramere so dieses Verfahren hat eine viel brei...

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td> Serumfreies Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td> Insektenzellen</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>Antibiotika</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25 cm² TC-Flasche</td><td> Kunststoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm² TC-Flasche</td><td> Verschlussflasche</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben</td><td> Zellkulturgefäß</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>YM 30 Konzentrator</td><td>30.000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>FPLC-Gerät</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrA Enzym und Puffer</td><td> Biotinylierungs-Kit</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose-Säule</td><td>His-Tag-Proteinreinigungssäule</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desalting-Säule</td><td> Zum Entfernen von Salz aus Protein</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoQ-Säule</td><td>Anionenaustausch-Chromatographie</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200-Säule</td><td> Größenausschluss-Chromatographie</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td> Glykolipid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-Streptavidin</td><td> Zum Konjugieren von Protein</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

ein verfahren zur herstellung von rekombinantem protein in mcd1d insektenzellen.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1-Proteine ​​bilden eine dritte Klasse von Antigen-präsentierenden Molekülen. Sie sind Zelloberfläche Glykoproteine, wie etwa 50-kDa glykosylierten schweren Ketten, die kovalent mit beta2-Mikroglobulin assoziiert sind Ausdruck. Sie binden Lipide als Peptide. Obwohl die Struktur bestätigt die Ähnlichkeit der CD1-Proteine ​​auf MHC Klasse I und Klasse II Antigen-präsentierenden Molekülen ist die mCD1d Nut relativ schmal, tief und stark hydrophob und hat zwei Bindungstaschen statt der mehrere flache Taschen für die klassische beschriebenen MHC- kodierte Antigen-präsentierenden Molekülen. Basierend auf ihren Aminosäuresequenzen, bietet eine solche hydrobphobic Nut ein ideales Umfeld für die Bindung von Lipid-Antigene. Die Natural Killer T (NKT-Zellen) nutzen ihre TCR an Glykolipide gebunden oder presented by CD1d erkennen. Reaktive T-Zellen, Lipide zu CD1 präsentiert haben in den Schutz gegen Autoimmun-und Infektionskrankheiten sowie in Tumorabstoßung beteiligt. So ist die Fähigkeit zu erkennen, zu reinigen, und verfolgen Sie die Reaktion der CD1-reaktiven NKT Zellen von großer Bedeutung. Die Erzeugung von Tetrameren von alpha Galactosylceramid (a-GalCer) mit CD1d hat einen tiefen Einblick in die Biologie von NKT-Zellen. Tetramere aus anderen CD1-Moleküle konstruiert wurden ebenfalls erzeugt und diese neue Reagenzien haben stark das Wissen um die Funktionen von Lipid-reaktiven T-Zellen erweitert, mit potenziellen Einsatz bei der Überwachung der Reaktion auf Lipid-basierte Impfstoffe und in der Diagnostik von Autoimmunerkrankungen und andere Behandlungen.

Eine Methode, um Insektenzellen vorzubereiten und infizieren sie mit Baculovirus für die Zwecke der Produktion von rekombinanten mCD1d proteinand Erzeugung mCD1d Tetramere.

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

CD1-Proteine bilden eine dritte Klasse von Antigenpräsentationsmolekülen. Es handelt sich dabei um Glykoproteine der Zelloberfläche, die als glykosylierte Proteine von etwa 50 kDa exprimiert werden ...

Hallo, ich bin Ashra Corona aus dem Labor von Dr. Mitch Kronenberg in der Abteilung für Entwicklungsimmunologie am La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Heute zeige ich Ihnen, wie man High Five-Insektenzellen vorbereitet und mit VIR infiziert, um MA CD 1D-Tetramere herzustellen. CD 1D-Tetramere werden in unserem Labor und von anderen zur Erkennung von NKT-Zellen verwendet.Das VIR-System wird häufig zur Herstellung rekombinanter Proteine verwendet, einschließlich MS C-Klasse-zwei TE-Tremors. Daher ist das gezeigte Verfahren viel breiter anwendbar. Dieses Verfahren umfasst das Inokulieren und Kultivieren von High-Five-Insektenzellen, die Infektion der Zellen mit Reovirus, das CD1D-cDNA trägt, die Gewinnung des Überstandes durch Zentrifugation nach vier Tagen Infektion, die Lyse und Konzentrierung des Proteins in 150 Millimolar Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, die Reinigung des Maus-CD1D-Proteins mittels Nickel- und T-Agros- und Ionenaustausch-Romme-Methode, die Konzentration des CD1D-Proteins auf 1 mg pro ml mithilfe eines YM-30-Konzentrators sowie die enzymatische Biotionylierung des Maus-CD1D nach AVID-D-Protokoll und die Entfernung freier Biotinmoleküle durch eine S-200-Säu

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Forschung

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Biology

Biologie

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Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.

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Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine robuste Plattform für das Expressionsscreening und die Produktion von Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien verwendet werden sollen. Für die meisten PRMTs und andere Proteine von Interesse, die eine eukaryotische Expressionsplattform benötigen, können Milligrammmengen an Material produziert werden.

Herstellung rekombinanter PRMT-Proteine unter Verwendung des Baculovirus Expression Vector System

Lernen Sie die Herstellung von rekombinantem mCD1d-Protein in High Five-Insektenzellen durch Baculovirus-Infektion. Diese Methode ermöglicht die Produktion von Tetrameren für NKT-Zell-Studien in der Entwicklungsimmunologie.

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

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