Bewertende primäre Explosion Effekte In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, repräsentative Schockwellen zu erzeugen, die während Explosionsereignissen auftreten können, und die Auswirkungen dieses mechanischen Schocks auf die Lebensfähigkeit von Primärzellen in Kultur zu bewerten. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen zu beantworten, die sich auf die Reaktion einzelner Zelltypen auf hochenergetische Ereignisse wie die Exposition gegenüber einer Stoßwelle beziehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, unterschiedliche Zellreaktionen auf eine einzelne Schockwelle im Gegensatz zu Reaktionen auf Gewebe- oder Organebene zu bewerten.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Identifizierung der zellulären Mechanismen, die durch primäre Explosionsverletzungen verändert werden, die durch die Exposition gegenüber einer Schockwelle verursacht werden. Obwohl diese Methode mit einem bestimmten Zelltyp von Interesse demonstriert wird, können alle Zellen kultiviert und in den Testaufbau platziert werden, um die zellspezifischen Reaktionen auf eine Stoßwelle zu bewerten. Kultivieren Sie zunächst die interessierende Zelllinie in Standardkultur, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreicht.

Saugen Sie dann das Medium an. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie sie fünf Minuten lang unter Standardkulturbedingungen.

Prüfen Sie kurz, ob sich die Zellen erfolgreich vom Kolben gelöst haben. Geben Sie dann vier Milliliter FBS-haltiges Kulturmedium in den Kolben, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 200 mal g, um die Zellen zu pelletieren.

Saugen Sie dann den Überstand langsam an und achten Sie darauf, dass sich das Pellet nicht löst. Und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Medium. Stellen Sie drei beschriftete 35-Milliliter-Schalen in eine 90-Milliliter-Schale.

Geben Sie dann zwei Milliliter Medium in jede Schale und besäen Sie sie mit jeweils 70.000 Zellen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht, um eine angemessene Zelladhäsion zu ermöglichen, bevor Sie sie der Schockwelle aussetzen. Bevor Sie mit der Montage des Stoßdämpferrohrs beginnen, ziehen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich Arbeitsstiefeln mit Stahlkappe und einem Laborkittel.

Beginnen Sie damit, zwei Ausrichtungsstangen durch die Schraubenlöcher in der horizontalen Ebene des Auslassflansches einzuführen. Legen Sie dann eine Dichtungsplatte aus Nitrilkautschuk über das Ende der Ausrichtungsstangen, so dass sie zwischen dem Auslassflansch und dem Ex-vivo-Organkultur-Rig sitzt. Befestigen Sie das EVOC-Rig am Auslassflansch des Stoßdämpferrohrs, indem Sie die Halterung über die Ausrichtungsstangen schieben.

Stellen Sie sicher, dass sie richtig ausgerichtet ist, so dass sich der Abschnitt, in dem sich die Petrischale befindet, an ihrer Basis befindet. Führen Sie als Nächstes vier M24-Schrauben und Unterlegscheiben in die verbleibenden Löcher ein und ziehen Sie die Schrauben und Muttern nacheinander diagonalsymmetrisch fest, während Sie visuell überprüfen, ob das EVOC-Rig und das Stoßdämpferrohr erfolgreich ausgerichtet sind. Befestigen Sie dann einen Druckmessumformer an der EVOC-Prüfstand und verbinden Sie ihn über ein Sensorkabel mit der Stromquelle.

Verwenden Sie zusätzlich ein BNC-Kabel, um die Stromquelle mit dem Oszilloskop zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass alle Ablassventile und Durchflussregler am Stoßdämpferrohr geschlossen sind. Öffnen Sie dann die eingebaute externe Druckluftleitung und drehen Sie den Druckregler manuell im Uhrzeigersinn, um den Magneten auf 2,5 bar aufzuladen.

Öffnen Sie die Druckluftflasche und drehen Sie den Druckregler langsam im Uhrzeigersinn, um den Druck auf ca. 15 bar zu erhöhen. Bereiten Sie als Nächstes Membranen vor, indem Sie eine 0,125 Milliliter dicke Plastikfolie in 10 Zentimeter x 10 Zentimeter große Quadrate schneiden. Erstellen Sie Griffe aus Klebeband und befestigen Sie sie oben und unten an der Membran.

Positionieren Sie die Membran vorsichtig neben dem vorderen kleinen Flansch an der Verschlusskammer. Stellen Sie sicher, dass die Membran gerade und richtig positioniert ist, bevor Sie den Verschluss schließen. Und befestigen Sie es dann mit vier M24-Schrauben und Muttern.

Bereiten Sie in der sterilen Haube gasdurchlässige Klebemembranen so vor, dass jede groß genug ist, um die Oberseite einer 35-Milliliter-Petrischale zu bedecken. Übertragen Sie dann eine 90-Milliliter-Petrischale mit drei experimentellen Proben in die Haube. Saugen Sie das Medium aus einer der Schalen an und decken Sie es mit zwei Membranabschnitten ab, um sicherzustellen, dass die Membran und der Rand der Schale dicht abdicht sind.

Übertragen Sie die Probe auf das EVOC-Rig und befestigen Sie sie so an der Basis der Vorrichtung, dass die Oberseite der Schale mit der inneren Basis des Stoßrohrs ausgerichtet ist. Setzen Sie an dieser Stelle einen Gehörschutz, eine Schutzbrille, Sicherheitsstiefel und einen Laborkittel an. Setzen Sie das Stoßdämpferrohrsystem unter Druck, indem Sie den Durchflussregler am Regler im Uhrzeigersinn drehen.

Wählen Sie unten auf dem Bedienfeld entweder den doppelten Verschlusseinlass für eine kurzzeitige Stoßwelle oder den Treiberrohreinlass für eine längere Wellendauer. Schalten Sie dann die Gleichstromquelle und das Oszilloskop ein, um die Signaldaten anzufordern. Schalten Sie als Nächstes die Sicherheitsbeleuchtung mit dem Schalter an der Wand gegenüber dem Bedienfeld ein, um andere Forscher darauf hinzuweisen, den Raum nicht zu betreten, wenn das Stoßrohr aufgeladen wird.

Drücken Sie am Schaltkasten des Magneten den Schalter, um den Magneten zu schließen. Öffnen Sie dann auf dem Bedienfeld langsam die Durchflussregelung, indem Sie den Knopf gegen den Uhrzeigersinn drehen, um den Druck in der Kompressionskammer allmählich zu erhöhen. Wenn der Berstdruck der Membran erreicht ist, reißt die Membran und es ist ein Knall zu hören.

Sobald dieses Geräusch zu hören ist, schließen Sie schnell den Durchflussregler. Öffnen Sie dann den Magneten, indem Sie den Schalter am Schaltkasten des Magnetventils ausschalten, und schalten Sie die Sicherheitsleuchte aus. Übertragen Sie die Zellprobe in die Sterilhaube.

Entfernen Sie dort die selbstklebende gasdurchlässige Membran und füllen Sie die Schale mit zwei Millilitern frischem Wachstumsmedium. Geben Sie 200 Mikroliter Redoxindikator-Reagenz direkt in jede Versuchsschale, nachdem Sie sie mit zwei Millilitern frischem Wachstumsmedium befüllt haben. Dann stellen Sie das Gericht für vier Stunden in einen Standard-Inkubator.

Nach der Inkubation werden zwei 100-Mikroliter-Aliquots aus jeder Schale auf eine geeignete 96-Well-Platte übertragen. Lesen Sie die Platte auf einem Fluoreszenzplatten-Reader ab und exportieren und speichern Sie die Daten. Für die Fluoreszenzbildgebung von lebenden und toten Zellen müssen die Zellen zunächst auf einem gläsernen Deckglas in den 35-Milliliter-Kulturplatten plattiert werden.

Nach der Stoßwellenbehandlung aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal in einem Milliliter PBS. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter des lebenden toten Reagenzes aus dem Bildgebungskit auf jede Probe. Inkubieren Sie die Zellen und das Reagenz bei Raumtemperatur und schützen Sie sie 15 Minuten lang vor Licht.

Entfernen Sie nach der Inkubation das Reagenz und waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter PBS. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig das Deckglas von der 35-Milliliter-Schale und legen Sie es mit der Vorderseite nach unten auf einen Objektträger aus Glasmikroskopie. Nehmen Sie Bilder für jede Probe mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer 5-fach-Objektivlinse mit einer numerischen Apertur von 0,25 ausgestattet ist.

Verwenden Sie dann eine Bildanalysesoftware, um die Anzahl der lebenden grünen und roten toten Zellen aus jedem Bild entweder manuell oder automatisch zu zählen. Mit der hier beschriebenen Methode wurden Zellen, die in einer Monoschicht gezüchtet wurden, Stoßwellen ausgesetzt, die mit einem Stoßrohr erzeugt wurden. Sensoren im Stoßdämpferrohr zeigen die Druckprofile an, die an verschiedenen Stellen entlang des Rohrs beobachtet werden.

Unter Verwendung eines Redox-Indikationsassays wurde festgestellt, dass die Anwendung einer 127-Kilopascal-Schockwelle die Lebensfähigkeit der dermalen Papillenzellen im Vergleich zu Kontrollen nach 24 Stunden in Kultur signifikant reduzieren konnte. Die Anwendung einer Schockwelle von 72 Kilopascal oder weniger verringerte die Lebensfähigkeit nicht. Um diese Beobachtungen zu untermauern, zeigte ein Lebendtot-Assay auch eine Verringerung der Zellviabilität bei denjenigen, die der 127-Kilopascal-Schockwelle ausgesetzt waren, im Vergleich zur Kontrolle.

Einmal gemeistert, kann diese Technik variabel schnell mit einer Geschwindigkeit von 60 Samples pro Stunde durchgeführt werden. Das Stoßrohr kann verwendet werden, um Schockwellen zu erzeugen, um eine Reihe von primären Explosionsverletzungen zu untersuchen. Diese können von der Blast-Lunge bis hin zur heterotopen Ossifikation reichen, d. h. der unangemessenen Bildung von Knochen in den Weichteilen des Körpers.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich an die Risiken zu erinnern, die mit der Arbeit mit komprimierten Gasen und hochenergetischen Stoßwellen verbunden sind, und immer die richtigen Sicherheitsrichtlinien zu befolgen. Kleinere Modifikationen an einem Stoßdämpferrohr können es uns ermöglichen, die Stoßwelle zu verändern. Wir können dann die zelluläre Reaktion auf verschiedene Druckprofile und -intensitäten bewerten, die unterschiedliche Explosionsszenarien darstellen.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Forschungsfragen zu beantworten, wie z. B. wie verändert die Exposition gegenüber einer Stoßwelle unsere natürliche Einschreibung in Zellen?