Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von Drosophila Fotorezeptoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Ganzzell-Spannungsklemmenaufzeichnungen von einer einzelnen Photorezeptorzelle zu erhalten, um lichtinduzierte Ströme zu messen, die sich aus der Einzelphotonenabsorption und aus den wiederholten Reaktionen auf intensives Licht ergeben. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselthemen des sensorischen Transduktionsfeldes zu adressieren, wie z. B. die visuelle Transduktion sowohl für physikalische als auch für ionische Mechanismen, die der Phototransduktion zugrunde liegen, und die Eigenschaften von TRP-Kanälen. Zu den Vorteilen dieser Technik gehören die vollständige Kontrolle über die Membranspannung und das extrem hohe Signal-Rausch-Verhältnis sowie die Möglichkeit, spezifische Indikatoren für optische Messungen einzuführen.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, mit der winzigen Größe des Präparats und der Notwendigkeit, die Dissektion aufgrund einer zeitlichen metabolischen Anfälligkeit schnell durchzuführen, zu kämpfen. Für dieses Verfahren züchten Sie die Fliegen in einer Dichte von etwa 20 pro Fläschchen. Zum Zeitpunkt des Experiments sollten Sie einige Fläschchen mit Puppen haben, die kurz vor dem Schließen stehen und mindestens 24 Stunden lang unter ständiger Dunkelheit standen.

Entfernen Sie zwei Stunden vor dem Einsammeln der erwachsenen Tiere alle geschlossenen Erwachsenen. Behandeln Sie die dunkel eingestellten Fliegen in Taschentüchern immer unter roter Lichtbeleuchtung. Während Sie auf die frisch eingeschlossenen Fliegen warten, bereiten Sie die Aufnahmekammer vor.

Befestigen Sie das Deckglas auf dem Boden der Kammer mit geschmolzenem Paraffin oder Hochvakuum-Silikonfett, um das Bad zu vervollständigen. Montieren Sie dann das Bad auf den Tisch des inversen Mikroskops. Legen Sie den Schlauch des Perfusionssystems, den Schlauch des Saugsystems und das Erdungskabel für die elektrophysiologische Einrichtung in das Bad.

Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie einige Lösungen auf der Rückseite einer 60-Millimeter-Petrischale vor. Geben Sie vier separate Tropfen kalziumfreies ES und einen Tropfen TS ab. Fangen Sie nun mit einer groben Pinzette eine Fliege, die sich kürzlich an ihren Flügeln oder ihrem Körper geschlossen hat. Nehmen Sie dann mit einer feinen Pinzette den Kopf ab und geben Sie den Kopf schnell auf den ersten Tropfen kalziumfreies ES. Präparieren Sie den Kopf unter einem Stereoskop mit einer zweiten feinen Pinzette entlang der Sagittalebene in zwei Hälften.

Achten Sie darauf, dass beide Augen intakt bleiben. Übertragen Sie nun 1/2 des Kopfes auf den zweiten calciumfreien ES-Tropfen und die andere Hälfte des Kopfes auf den dritten calciumfreien ES-Tropfen. Fahren Sie dann mit dem Präparieren eines der beiden Augen fort.

Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette so viel wie möglich von dem Gewebe, das das Auge umgibt, um sicherzustellen, dass die Netzhaut nicht geschädigt wird. Fassen Sie dann den Rand der Hornhaut mit einer feinen Pinzette fest an und schöpfen Sie die Netzhaut aus. Das Ergebnis sollte eine leere intakte Hornhaut sein, die von einer intakten Netzhaut getrennt ist.

Die Pipetten werden in Ethanol aufbewahrt, daher spülen Sie sie bei Verwendung einer neuen Verreibpipette immer zuerst mit Wasser ab. Füllen Sie nun die gespülte Pipette mit einer kleinen Menge kalziumfreiem ES aus dem vierten Tropfen. Anschließend wird die isolierte Netzhaut mit einer sanften Mundaspiration in die Pipette gezogen.

Vermeiden Sie das Einfangen von Luftblasen mit äußerster Vorsicht. Legen Sie dann die Netzhaut in den TS-Tropfen. Wiederholen Sie als Nächstes die Netzhautisolierung auf dem zweiten Auge, so dass sich nun beide im TS-Tropfen befinden. Wischen Sie dann vorsichtig nur das kalziumfreie ES von der Petrischale ab und geben Sie sechs weitere Tropfen TS auf die Oberfläche der Schale.

Übertragen Sie beide Netzhäute in neue TS-Tropfen. Ersetzen Sie dann die Verreibpipette durch eine mit einer Öffnung mit kleinem Durchmesser. Füllen Sie die Pipette nach dem Ausspülen mit einem Tropfen TS. Mit dieser Pipette aspirieren und expirieren Sie schnell und wiederholt beide Netzhauten, um einige Ommatidien von den Pigmentzellen zu trennen. Der TS wird sich trüben, wenn dies geschieht.

Übertragen Sie als Nächstes die Überreste beider Netzhäute auf einen weiteren Tropfen TS. Laden Sie dann die Pipette mit dem trüben TS-Tropfen, der die isolierten Ommatidien enthält. Lassen Sie die Lösung in die Badkammer auslaufen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verkleinerten Verreibpipetten mit kleinerem Durchmesser, bis sich die Netzhaut vollständig aufgelöst hat.

Warten Sie einen Moment. Während dieser Pause binden sich die isolierten Ommatidien an den Boden der Kammer. Beginnen Sie nach einer Minute mit dem Fließen von ES mit 1,5 millimolarem Kalzium unter Verwendung des Perfusionssystems.

Achten Sie beim Befüllen der Kammer darauf, dass das Erdungskabel und das Saugrohr eingetaucht sind. Lassen Sie die Lösung 60 bis 90 Sekunden lang fließen, bevor Sie fortfahren. Verwenden Sie zunächst das 40-fach-Objektiv, um die Ommatidien in der Badewanne sorgfältig zu inspizieren.

Beachten Sie, dass die länglichen Photorezeptor-Zellkörper, die das Ommatidium bilden, von ihren Axonen gelöst sind, aber lebensfähig bleiben. Wählen Sie nun ein geeignetes Ommatidium für den Versuch aus. Wählen Sie diese Option aus, wenn die folgenden Kriterien erfüllt sind.

Die äußere Membran muss glatt und intakt sein. Die Längsachse muss nahezu im rechten Winkel zum Ansatz der Elektrode von der distalen Seite stehen. Und das Ommatidium sollte nicht von überschüssigem Gewebe umgeben sein.

Nach der Auswahl zentrieren Sie das Ommatidium im Sichtfeld. Füllen Sie nun eine Pipette mit der passenden intrazellulären Lösung für das Experiment. Und runden Sie die Pipette bis zum Elektrodenhalter.

Blasen Sie dann in das Rohr der Pipette, um einen Überdruck zu erzeugen, und schließen Sie den Druck, indem Sie das Schlauchventil schließen. Führen Sie dann die Pipette in die Badkammer ein und führen Sie sie nahe an den distalen Abschnitt des Ommatidiums, bis ein kleines Grübchen in der Membran zu beobachten ist, das auf den Überdruck der geflickten Pipette zurückzuführen ist. Öffnen Sie nun das Membrantestmodul in der Aufzeichnungssoftware, um kontinuierliche Rechteckspannungsimpulse von zwei Millivolt mit einer Rate von 100 Hertz anzulegen.

Stellen Sie anschließend mit den Reglern des Patch-Clamp-Verstärkers das Sperrschichtpotential auf Null ein, um die Basis des Rechteckimpulses auf Nullstrom zu setzen. Öffnen Sie dann das Ventil, um den Druck in der Pipette abzulassen, und saugen Sie vorsichtig ab, um einen Unterdruck zu erzeugen. Die Pipette sollte dann an der Zellmembran ansetzen.

Sobald dies geschieht, schließen Sie das Ventil, um den Druck zu verriegeln. Überprüfen Sie nun den Elektrodenwiderstand. Er sollte auf 100 bis 150 Megaohm angehoben werden.

Lassen Sie dann den Unterdruck in der Pipette ab, indem Sie das Ventil wieder öffnen. Der Widerstand sollte nun auf ein bis zwei Gigaohm ansteigen, was darauf hindeutet, dass sich zwischen der Pipette und der Zelle ein C gebildet hat. Versetzen Sie anschließend mit dem Patch-Clamp-Verstärker den kapazitiven Strom der Pipette.

Um die Ganzzellkonfiguration herzustellen, brechen Sie die Zellmembran durch Mundaspiration auf. Erzeugen Sie schnelle, kurze, kräftige Unterdruckschübe in der Elektrode. Beim Erreichen der Ganzzellkonfiguration kommt es zu einem plötzlichen Anstieg der Kapazität.

Stellen Sie dann mit dem Patch-Clamp-Verstärker das Haltepotenzial auf die erforderliche Spannung ein und versetzen Sie die kapazitiven Ströme in Reihenwiderstand. Schließen Sie nun den schwarzen französischen Vorhang des Faradayschen Käfigs und beginnen Sie mit dem Experiment. Nach Erhalt der Ganzzellkonfiguration mit einer Patch-Pipette, die den Fluoreszenzfarbstoff Lucifer Yellow enthält, ist zu sehen, dass nur einer der Photorezeptoren, die das Ommatidium bilden, mit dem Farbstoff beladen wurde.

Dieser Photorezeptor wird auch elektrisch von seinen Nachbarn im Ommatidium isoliert sein. Ganzzell-Spannungs-geklemmte Ommatidien von Wildtyp-Fliegen und Fliegen mit Mutationen in den Genen InaC oder InaD zeigten Quanten-Bumps als Reaktion auf anhaltend schwaches Licht. Ein langsames Ende der Beulen wurde bei beiden Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen beobachtet.

Normalisierte Reaktionen auf 500-Millisekunden-Lichtimpulse, die mit 150.000 Photonen pro Sekunde abgegeben werden, die veränderten Physiologien sind anschaulich dargestellt. Mit dem Präparat war es sogar möglich, die Quantenstoßreaktionen der gesamten Zellspannung auf kurzes schwaches Licht von einer Millisekunde zu messen. Solche Einzelphotonenantworten wurden in Wildtyp-Arrestin-Mutanten und ninaC-mutierten Fliegen verglichen.

Beide Mutanten reagierten mit einer Reihe von Beulen. Normalisierte Reaktionen auf einen 500-Millisekunden-Lichtimpuls, der mit 15.000 Photonen pro Sekunde abgegeben wird. Die langsame Beendigung der makroskopischen Reaktion wird also in den Arrestin-2- und ninaC-Mutanten beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ganzzellaufnahmen von Drosophila-Photorezeptorzellen macht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Diese Technik hat den Forschern den Weg geebnet, um TRP-Kanäle und Inositol-Lipid-Signale sowie die Rolle von intrinsisch lichtempfindlichen retinalen Ganglienzellen in Säugetieren besser zu verstehen, die an nicht bilderzeugenden lichtabhängigen Aktivitäten beteiligt sind.