Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Ganzzell-Voltage-Clamp-Aufzeichnungen von einer einzelnen Photorezeptorzelle zu erhalten, um lichtinduzierte Ströme zu messen, die durch die Absorption einzelner Photonen sowie durch wiederholte Antworten auf intensives Licht entstehen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragestellungen des Forschungsbereichs der Sinneswahrnehmung zu klären, insbesondere die visuelle Transduktion hinsichtlich sowohl der physikalischen als auch der ionischen Mechanismen, die der Phototransduktion zugrunde liegen, sowie die Eigenschaften von TRP-Kanälen. Zu den Vorteilen der Anwendung dieser Technik zählen die vollständige Kontrolle der Membranspannung, ein außerordentlich hohes Signal-Rausch-Verhältnis sowie die Möglichkeit, spezifische Indikatoren für optische Messungen einzubringen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit der geringen Größe der Präparation und der Notwendigkeit, die Dissektion schnell durchzuführen, da eine zeitliche metabolische Verwundbarkeit besteht. Für dieses Verfahren ziehen Sie Fliegen in einer Dichte von etwa 20 pro Röhrchen auf. Zum Zeitpunkt des Experiments sollten mehrere Röhrchen mit Puppen bereitstehen, die kurz vor dem Verschluss stehen und mindestens 24 Stunden lang konstantem Dunkel ausgesetzt waren.

Zwei Stunden vor dem Sammeln der erwachsenen Tiere alle geschlüpften erwachsenen Fliegen entfernen. Die an die Dunkelheit angepassten Fliegen stets unter roter Lichtbeleuchtung mit Gewebe behandeln. Während des Wartens auf die frisch geschlüpften Fliegen die Ableitungskammer vorbereiten.

Befestigen Sie die Deckglasunterseite im Kammerboden mit geschmolzenem Paraffin oder hochvakuumtauglichem Silikonfett, um die Badlösung abzuschließen. Anschließend montieren Sie das Bad auf dem Objekttisch des invertierten Mikroskops. Bringen Sie in das Bad das Perfusionsrohr, das Saugrohr und den Erdungsdraht für die elektrophysiologische Anordnung ein.

Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie einige Lösungen auf der Unterseite einer 60-Millimeter-Petri-Schale vor. Geben Sie vier getrennte Tropfen kalziumfreies ES und einen Tropfen TS ab. Fassen Sie nun mithilfe von groben Pinzetten eine kürzlich geschlüpfte Fliege an den Flügeln oder am Körper. Trennen Sie dann mit feinen Pinzetten den Kopf ab und übertragen Sie diesen schnell in den ersten Tropfen kalziumfreies ES. Zerteilen Sie unter einem Stereomikroskop den Kopf mit einem zweiten Paar feiner Pinzetten entlang der Sagittalebene in zwei Hälften.

Stellen Sie sicher, dass beide Augen intakt bleiben. Übertragen Sie nun die eine Hälfte des Kopfes auf den zweiten kalziumfreien ES-Tropfen und die andere Hälfte des Kopfes auf den dritten kalziumfreien ES-Tropfen. Fahren Sie dann mit der Dissektion eines der beiden Augen fort.

Entfernen Sie mit feinen Pinzetten so viel wie möglich vom das Auge umgebenden Gewebe, um sicherzustellen, dass die Netzhaut nicht beschädigt wird. Fassen Sie dann den Rand der Hornhaut mit feinen Pinzetten fest an und heben Sie die Netzhaut vorsichtig heraus. Das Ergebnis sollte eine leere, intakte Hornhaut sein, die von einer intakten Netzhaut getrennt ist.

Die Pipetten werden in Ethanol aufbewahrt. Daher spülen Sie bei Verwendung einer neuen Triturationspipette diese stets zuerst mit Wasser aus. Füllen Sie die gespülte Pipette anschließend mit einem kleinen Volumen kalziumfreiem ES aus dem vierten Tropfen. Ziehen Sie dann mit vorsichtiger Mundabsaugung die isolierte Netzhaut in die Pipette ein.

Vermeiden Sie mit äußerster Vorsicht das Einschließen von Luftblasen. Anschließend geben Sie die Netzhaut in den Tropfen TS. Wiederholen Sie danach die Netzhautisolation am zweiten Auge, sodass sich beide nun im TS-Tropfen befinden. Wischen Sie danach vorsichtig nur das kalziumfreie ES aus der Petrischale und geben Sie sechs weitere Tropfen TS auf die Oberfläche der Schale.

Überführen Sie beide Netzhäute in neue Tropfen von TS. Ersetzen Sie dann die Triturierpipette durch eine mit einer Öffnung kleineren Durchmessers. Spülen Sie diese aus und füllen Sie sie anschließend mit einem Tropfen TS. Aspirieren und expirieren Sie mit dieser Pipette rasch und wiederholt beide Netzhäute, um einige Ommatidien von den Pigmentzellen zu lösen. Dabei wird sich die TS-Tröpfchen trüben.

Überführen Sie anschließend die Reste beider Netzhäute in einen weiteren Tropfen TS. Danach saugen Sie den trüben TS-Tropfen, der die isolierten Ommatidien enthält, mit der Pipette auf. Geben Sie die Lösung in die Badkammer ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit Pipetten für die Trituration, deren Durchmesser immer weiter abnimmt, bis die Netzhaut vollständig aufgelöst ist.

Warten Sie nun eine Minute. Während dieser Pause binden die isolierten Ommatidien an den Boden der Kammer. Nach einer Minute beginnen Sie, ES mit 1,5 Millimolar Calcium über das Perfusionsystem zuzuführen.

Während die Kammer gefüllt wird, sicherstellen, dass der Erdungsdraht und der Saugschlauch untergetaucht sind. Die Lösung 60 bis 90 Sekunden lang fließen lassen, bevor fortgefahren wird. Beginnen Sie damit, mithilfe des 40x-Objektivs die Ommatidien im Bad sorgfältig zu untersuchen.

Beachten Sie, dass die langgestreckten Photorezeptorzellkörper, die das Ommatidium bilden, von ihren Axonen abgetrennt sind, aber weiterhin vital bleiben. Wählen Sie nun ein geeignetes Ommatidium für das Experiment aus. Die Auswahl sollte erfüllen, wenn die folgenden Kriterien erfüllt sind.

Die äußere Membran muss glatt und intakt sein. Die lange Achse muss nahezu im rechten Winkel zur Annäherung der Elektrode von der distalen Seite stehen. Außerdem sollte das Ommatidium nicht von überschüssigem Gewebe umgeben sein.

Wenn einmal ausgewählt, zentrieren Sie das Ommatidium im Sichtfeld. Füllen Sie nun eine Pipette mit der geeigneten intrazellulären Lösung für das Experiment. Und befestigen Sie die Pipette am Elektrodenhalter.

Blasen Sie dann in das Pipettierrohr, um einen leichten Überdruck zu erzeugen, und blockieren Sie diesen, indem Sie das Ventil am Rohr schließen. Führen Sie anschließend die Pipette in die Badkammer ein und nähern Sie sie dem distalen Bereich des Ommatidiums, bis eine kleine Delle in der Membran sichtbar wird, verursacht durch den Überdruck der Patch-Pipette. Öffnen Sie nun das Membran-Test-Modul in der Aufzeichnungssoftware, um kontinuierliche Rechteck-Spannungsimpulse von zwei Millivolt mit einer Frequenz von 100 Hertz anzulegen.

Als Nächstes stellen Sie mithilfe der Steuerung des Patch-Clamp-Verstärkers das Übergangspotential auf null ein, um die Basis des rechteckigen Impulses auf Nullstrom zu setzen. Öffnen Sie dann das Ventil, um den Druck in der Pipette abzulassen, und saugen Sie vorsichtig an, um Unterdruck zu erzeugen. Die Pipette sollte sich daraufhin an die Zellmembran anlagern.

Wenn dies erfolgt ist, schließen Sie das Ventil, um den Druck zu fixieren. Überprüfen Sie nun den Elektrodenwiderstand. Er sollte auf einen Wert zwischen 100 und 150 Megaohm angestiegen sein.

Danach lösen Sie den Unterdruck in der Pipette, indem Sie das Ventil erneut öffnen. Der Widerstand sollte nun auf einen Wert zwischen ein und zwei Gigohm ansteigen, was darauf hinweist, dass eine C-Form zwischen der Pipette und der Zelle gebildet wurde. Anschließend kompensieren Sie mithilfe des Patch-Clamp-Verstärkers den kapazitiven Strom der Pipette.

Um die Ganzzell-Konfiguration herzustellen, brechen Sie die Zellmembran durch Mundabsaugung auf. Erzeugen Sie kurze, rasche und kräftige Impulse mit negativem Druck in der Elektrode. Sobald die Ganzzell-Konfiguration erreicht ist, tritt ein plötzlicher Anstieg der Kapazität auf.

Danach mit dem Patch-Clamp-Verstärker das Haltepotential auf die erforderliche Spannung einstellen und die kapazitiven Ströme im Serienwiderstand kompensieren. Nun den schwarzen französischen Vorhang des Faraday-Käfigs schließen und das Experiment beginnen. Nach Erhalt der Ganzzell-Konfiguration mit einer Patch-Pipette, die den fluoreszierenden Farbstoff Lucifer Yellow enthält, ist zu erkennen, dass nur einer der Photorezeptoren, die das Ommatidium bilden, mit dem Farbstoff beladen wurde.

Dieser Photorezeptor wird außerdem elektrisch von seinen Nachbarn im Ommatidium isoliert sein. Ganzzell-Spannungsclamped Ommatidien von Wildtyp-Fliegen und Fliegen mit Mutationen in den Genen InaC oder InaD zeigten Quantenbumps als Reaktion auf kontinuierliches schwaches Licht. Bei beiden Mutanten wurde im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen eine langsame Beendigung der Bumps beobachtet.

Normalisierte Antworten auf 500 Millisekunden lange Lichtpulse mit einer Rate von 150.000 Photonen pro Sekunde veranschaulichen die veränderten Physiologien übersichtlich. Mit dieser Präparation war es sogar möglich, ganzzellige Spannungsgeklemmte Quantenstoß-Antworten auf einen nur eine Millisekunde langen, schwachen Lichtreiz zu messen. Solche Einzelphotonen-Antworten wurden bei Wildtyp-, Arrestin-Mutanten- und ninaC-Mutanten-Fliegen verglichen.

Beide Mutanten reagierten mit einer Serie von Ausschlägen. Normalisierte Antworten auf einen 500 Millisekunden langen Lichtimpuls mit einer Intensität von 15.000 Photonen pro Sekunde. Die langsame Beendigung der makroskopischen Antwort wird somit bei den Arrestin-2- und ninaC-Mutanten beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ganzzell-Aufzeichnungen aus Photorezeptorzellen von Drosophila durchführt. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb einer Stunde durchgeführt werden. Diese Technik hat es Forschern ermöglicht, TRP-Kanäle und die Inositol-Lipid-Signalübertragung besser zu verstehen, sowie die Rolle intrinsisch lichtempfindlicher retinaler Ganglienzellen bei Säugetieren, die an lichtabhängigen, bildfreien Prozessen beteiligt sind.