Herzmuskelzell-basierter Aktuator und selbststabilisierender Biorobot - Teil 2

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, mikrofabrizierte Bauelemente mit Herzmuskelzellen zu besiedeln und die biochemischen und biomechanischen Eigenschaften der Zellen auf diesen Bauelementen sowie ihre Leistungsfähigkeit im Laufe der Zeit zu charakterisieren. Die hier beschriebene Materie kann leicht für andere Experimente modifiziert werden, die eine Zelladdition mit hoher Dichte auf mikrofabrizierten Bauelementen erfordern. Der Hauptvorteil des in diesem Video entwickelten Bioaktors besteht darin, dass er leicht zur Quantifizierung der Zellkontraktionskräfte jedes anderen Zelltyps eingesetzt werden kann.

Es kann auch verwendet werden, um die Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften von Stammzellen zu untersuchen, wenn sie sich differenzieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte des Cell Seedings mit Beschreibungen aus Texten schwer zu erlernen sind. Sie müssen ordnungsgemäß durchgeführt werden, um die konfluente Zellanhaftung an den Auslegerarmen zu gewährleisten, die für eine ordnungsgemäße biologische Funktion unerlässlich ist.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Neerajha Nagarajan aus meinem Labor durchgeführt. Beginnen Sie mit dem Bioroboter in der T25-Flasche. Halten Sie es mit einem Magneten am Boden des Kolbens fest.

Der Magnet wird für die biologischen Aktuatoren nicht benötigt, da sie sich aufgrund des Gewichts der Glasperle in der Basis nicht bewegen. Rollen Sie eine kleine quadratische Plastikfolie als Trichter und platzieren Sie den sterilen Trichter über den Aktuatoren in den Biorobotern. Passen Sie den Durchmesser am breiteren Ende an das Gerät und die Höhe an, so dass er eng anliegt, wenn die Oberseite des Kolbens festgezogen wird.

Verwenden Sie einen separaten Kolben, um die Passform des Trichters zu testen und einzustellen. Ein fester Sitz des Trichters stellt sicher, dass die Zellen nicht wie erwähnt in den Rest des Mediums austreten. Dies ist wichtig, um eine konfluente Abdeckung des Auslegerarms zu gewährleisten.

Wenn der Trichter an Ort und Stelle ist, resuspendieren Sie Kardiomyozyten in vollständigem DMEM mit einer Dichte von 16 Millionen Zellen pro Milliliter und lassen Sie langsam 400 Mikroliter der Suspension durch jeden Trichter auf die Geräte fallen. Schieben Sie dann die Kolben langsam zurück in den Inkubator, ohne die Geräte oder die Trichter darin zu stören. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius anheften.

Entfernen Sie nach der Inkubationszeit langsam den Trichter. Waschen Sie die Proben vorsichtig mit PBS und füllen Sie jeden Kolben mit 10 Millilitern frischem DMEM Complete auf. Entfernen Sie dann den Magneten vom Bioroboter, so dass er über Wasser ist, und legen Sie die Kolben zurück in den Inkubator.

Montieren Sie eine Kamera mit einem Zoomobjektiv im Inkubator, um die Geräte in Kultur zu visualisieren. Fügen Sie dann einen LED-Lichtstreifen hinzu, der als Lichtquelle verwendet werden soll. Schließen Sie als Nächstes die Kamera an einen Computer an und öffnen Sie das Bildgebungsprogramm.

Sobald Sie sich im Programm befinden, klicken Sie auf das Kamerabild auf der Registerkarte Datei, um alle Kameraoptionen zu öffnen und die angeschlossene Kamera auszuwählen. Wählen Sie in der Liste der Registerkarten Live und bringen Sie das Bild manuell in den Fokus, indem Sie das Objektivrad anpassen. Wählen Sie als Nächstes im oberen Bereich den Zuschnitt des interessierenden Bereichs aus.

Zeichnen Sie dann manuell ein Rechteck in den Videorahmen, das die biologische Aktuatorvorrichtung und die Auslegerarme umschließt, um den interessierenden Bereich zu markieren. Erfassen Sie bei Biorobotern den gesamten Bildschirm, um die Schwimmbewegung des Geräts aufzuzeichnen. Wählen Sie als Nächstes Kameraeinstellungen und stellen Sie die Bildrate ein, indem Sie die Belichtung und das Pixelverhältnis des Livebildes anpassen.

Stellen Sie die Bildraten auf etwa 30 Bilder pro Sekunde ein. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Aufnehmen, um die Aufnahme der Videos zu starten. Öffnen Sie die Programmiersoftware, indem Sie auf das Symbol klicken.

Klicken Sie nach dem Laden auf Datei, Öffnen, und wählen Sie die m-Skriptdatei zum Ausführen der Bildanalyse aus. Stellen Sie sicher, dass sich die aufgezeichneten TIF-Bilder und ihre AVI-Versionen im selben Ordner wie die m-Datei befinden, und klicken Sie dann auf Ausführen, um das Skript auszuführen. Drücken Sie Play, um das eigentliche Programm zu starten.

Klicken Sie nach dem Ausführen auf die Schaltfläche Öffnen und suchen Sie die TIF- oder AVI-Datei, die analysiert werden soll. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Basis. Wählen Sie oben den Punkt aus, an dem der Ausleger an der Basis befestigt ist, und drücken Sie die Eingabetaste.

Dadurch wird für jeden Rahmen eine quadratische Markierung auf dem Bild platziert, um die Position der freitragenden Basis zu kennzeichnen. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche "Skalieren" und dann manuell auf eine Kante der Glasperle. Bringen Sie den Mauszeiger auf die gegenüberliegende Seite der Glasperle und drücken Sie die Eingabetaste.

Dadurch wird eine Linie gezeichnet, die den Durchmesser der Glasperle misst und den Durchmesser mit den angezeigten Pixeln in Beziehung setzt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren. Klicken Sie dann in geringem Abstand von der ersten quadratischen Markierung, die die Auslegerbasis darstellt, entlang des Auslegers.

Klicken Sie weiter entlang des Auslegers einschließlich der Spitze und drücken Sie die Eingabetaste, wenn Sie fertig sind. Dadurch wird ein X auf jeden Punkt gesetzt, der auf den Ausleger geklickt wird. Prüfen Sie abschließend, ob der überlagerte Kreis das Auslegerprofil korrekt nachzeichnet.

Wenn dies korrekt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche "Nächster Rahmen". Dadurch wird zum nächsten Frame in der TIF-Datei gewechselt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Frames.

Sobald alle Frames verarbeitet wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren. Öffnen Sie zunächst die Bildanalysesoftware und laden Sie die Videodatei des schwimmenden Bioroboters. Öffnen Sie dann die Tabellenkalkulationssoftware.

Suchen Sie im geladenen Bioroboter-Video nach einer Größenreferenz, z. B. der Glasperle. Ziehen Sie mit dem Werkzeug "Gerade" eine Linie über die Glasperle. Klicken Sie dann auf Analysieren und wählen Sie Skalierung festlegen aus.

Legen Sie das Feld "Bekannte Entfernung" auf 3.000 Mikrometer fest, und klicken Sie auf "OK". Wählen Sie einen Punkt auf einem Gerät aus, der nicht zwischen den Bildern hin und her wackelt, um als Markierung zu fungieren, und notieren Sie die X- und Y-Koordinaten dieses Punktes in der Tabelle. Wechseln Sie zurück zum Fenster der Bildanalysesoftware und drücken Sie die rechte Pfeiltaste, um zum nächsten Bild zu wechseln. Zeigen Sie erneut auf die Markierung und notieren Sie die neuen X- und Y-Koordinaten in der Tabelle.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Frames und verwenden Sie die Daten, um die Bewegung des Bioroboters zu analysieren, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Die statischen und dynamischen Spannungen des Aktuators wurden täglich aus der Oberflächenspannung extrahiert. Statischer Stress ist der kontraktile Stress, den die Zellen im Ruhezustand auf der Oberfläche aufweisen, und dynamischer Stress ist der Stress, der von den Zellen bei maximaler Kontraktion erzeugt wird.

Während die Zellen in Kultur reiften, wurde im Laufe der Zeit ein allmählicher Anstieg der statischen und dynamischen Belastungen beobachtet. Sie zeigten am sechsten Tag eine maximale Zellzugkraft von 50 Millinewton pro Meter und eine maximale Kontraktionskraft von etwa 165 Millinewton pro Meter. Parallel zu den statischen und dynamischen Belastungen nehmen auch die Marker für die Reifung, das Wachstum und die Ausbreitung von Kardiomyozyten sowie die Zellvernetzung bis zum sechsten Tag zu.

Basierend auf der Videoanalyse wird hier der Vergleich der durchschnittlichen Schwimmgeschwindigkeit, der Schlagfrequenz und der pro Zug zurückgelegten Strecke für drei Bioroboter mit unterschiedlichen Schwimmprofilen gezeigt. Obwohl die vertikalen Bioroboter die geringste Schwebungsfrequenz haben, wiesen sie die höchste Schwimmgeschwindigkeit und die höchste zurückgelegte Strecke auf. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Herzmuskelzellen auf mikrofabrizierten Geräten sät, die als biologische Aktuatoren und Bioroboter fungieren könnten.

Der in diesem Video beschriebene Prozess der Bildaufnahme und der anschließenden Datenanalyse demonstriert eine bequeme Möglichkeit, das Zellverhalten sowie die Leistung des Geräts zu charakterisieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Lebensdauer der Kardiomyozyten begrenzt ist und die Aktivität der Zellen am sechsten Tag ihren Höhepunkt erreicht. Danach nimmt es mit der Zeit ab.