Name: Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Erfahren Sie eine validierte Methode zur Identifizierung echter Stressgranula in Säugetierzellen mittels Immunfluoreszenz und FISH. Dieses Protokoll ermöglicht die Unterscheidung von zytoplasmatischen Foci und deren Charakterisierung.

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Wir danken den Mitgliedern der Iwanow- und Anderson-Labore für ihre hilfreiche Diskussion und Feedback zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [GM111700 und CA168872 bis PA, NS094918 bis PI], dem National Science Center in Polen [gewährt UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 an WS] unterstützt. WS erkennt auch das Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung in Polen (Mobility Plus-Programm) und die polnisch-amerikanische Fulbright-Kommission für ihre finanzielle Unterstützung seiner Forschung in den USA an.

1. Zellvorbereitung <ol><li> Fügen Sie autoklavierte Deckgläser zu 12 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen hinzu, wie in Fig. 1A gezeigt ; Dies kann mit einer sterilen Pasteurpipette erfolgen, die an einem Vakuum befestigt ist, um jedes Deckglas aufzunehmen. Vorsichtig auf das Deckglas auf der Seite des Brunnens klopfen, um das Absaugen zu lösen, so dass das Deckglas in den Brunnen fallen kann. </li><li> Platte 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) Osteosarkomzellen pro Vertiefung bei einem Endvolumen von 500 μl Medium. Bewegen Sie die Platte seitlich und nach oben und unten mehrmals, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind. </li><li> Drücken Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer sauberen P1000-Spitze nach unten, um sicherzustellen, dass sich das Deckglas auf der Unterseite des Brunnens befindet und dass es keine Blasen unter dem Deckglas gibt. </li></ol> 2. Stresszellen <ol><li> Am nächsten Tag kontrollieren Sie die Tafel visuell, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt und gleichmäßig über das Deckglas hinweg konfludern, da Variationen zwischen saMples kann die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nachteilig beeinflussen. Verwenden Sie ein 10X-Ziel auf einem invertierten Gewebekulturmikroskop. </li><li> Das Medium auf 37 ° C vorheizen. Vermeiden Sie es, kalte oder heiße Medien auf die Zellen zu applizieren, da diese Kälte- oder Hitzeschock verursachen. </li><li> Medikamente in vorgeheizten Medien verdünnen Für jede unterschiedliche Arzneimittelkonzentration werden 2 Vertiefungen mit 500 μl Medium hergestellt. Bereiten Sie weitere 500 μl vor, um während des Pipettierens einen Verlust zu ermöglichen. Aliquot-4-Röhrchen mit jeweils 1,5 ml <ol><li> Für Natriumarsenit: Zu jeder Vertiefung, die 500 μl enthält, werden 1,5 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 100 μM) zugegeben oder 0,75 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 50 μM) zugegeben. </li><li> Für Vinorelbin: Zu jeder Vertiefung, die 500 μl enthält, werden 22,5 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 150 μM) zugegeben oder 18,75 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 100 μM) zugegeben. HINWEIS: Natriumarsenit<html> Ist ein gut charakterisierter und gängiger Stressgranulat-Induktor und wird daher klassisch als Positivkontrolle eingesetzt. </li></ol></li><li> Entfernen und entsorgen Sie das Medium aus den Brunnen B1 - 4 und C1 - 4. Fügen Sie das Medium mit Drogen hinzu und warten Sie 60 Minuten (Abbildung 1A). <ol><li> Füge 500 μl Medium mit 100 μM Natriumarsenit zu den Vertiefungen B1 und B2 hinzu. Füge 500 μl Medium mit 50 μM Natriumarsenit zu den Vertiefungen B3 und B4 hinzu. </li><li> Füge 500 μl Medium mit 150 μM Vinorelbin zu den Vertiefungen C1 und C2 hinzu. Füge 500 μl Medium mit 125 μM Vinorelbin zu den Vertiefungen C3 und C4 hinzu. </li></ol></li><li> 30 min vor der Fixierung die Vertiefungen in Spalte 2 mit 5 μl Cycloheximid (1 mg / mL Stamm) und den Vertiefungen in Spalte 4 mit 2 μl Puromycin (1,25 mg / mL Stamm) behandeln. Schlagen Sie die Platte vorsichtig vor, bevor Sie die Platte wieder in den 37 ° C-Inkubator stellen. </li></ol> 3. Zellfixierung und Immunfluoreszenz Nt &quot;&gt; HINWEIS: Vor dem Versuch sicherstellen, dass das Methanol auf -20 ° C abgekühlt wird. Puffer, einschließlich Phosphat-gepufferter Saline (PBS), 5% normales Pferdeserum (NHS) in PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA ) In PBS. <ol><li> Verwerfen Sie die Medien und waschen Sie die Wells mit Deckgläschen mit PBS. Abhängig von den verwendeten Medikamenten könnte es wichtig sein, die Medien, die Drogen enthalten, ordnungsgemäß zu verwerfen; Wenden Sie sich an die örtliche Umweltschutzstelle für spezifische Anweisungen. Um effizient zu waschen, füllen Sie eine Squeeze-Flasche mit PBS, schneiden Sie die Spitze, um einen sanften Fluss zu ermöglichen, anstatt einen engen Strom, und verwenden Sie diese, um PBS zu jedem Brunnen nach dem Ansaugen der ursprünglichen PBS hinzuzufügen. </li><li> Fixieren Sie die Zellen mit ~ 250 μl 4% PFA für 15 min bei RT unter leichtem Rühren. Den Deckel komplett mit PFA bedecken; 250 μl sollte ausreichend sein, aber wenn nicht, fügen Sie mehr hinzu. Vermeiden Sie immer Pipettieren direkt auf die Deckgläser, da einige Zellen (oder Stressbehandlungen von Zellen) die Befestigung verändern können und tEr Kraft aus Pipettieren kann die Zellen zu vertreiben. </li><li> PFA entfernen und ordnungsgemäß ablegen. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltschutzbüro, um Einzelheiten darüber zu erhalten, wie Sie Paraformaldehyd ordnungsgemäß verwerfen können. </li><li> Füge ~ 250 μl Methanol (-20 ° C) hinzu und inkubiere für 5 min bei RT unter leichtem Schütteln; Dies permeabilisiert und flacht die Zellen. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie das Methanol und blockieren Sie die Zellen durch Anwendung von ~ 250 μl 5% NHS für 1 h bei RT O / N bei 4 ° C. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltschutzbüro, um weitere Informationen darüber zu erhalten, wie Sie Methanol ordnungsgemäß entsorgen können. </li><li> Für primäre Antikörper verdünnen die Antikörper in 5% NHS. HINWEIS: Die Verwendung von mehreren SG-Markern ist der Schlüssel zur Bestätigung, ob die beobachteten Granulate bona fide SGs sind. Die Anzahl der SG-Marker, die verwendet werden können, hängt von den im Mikroskop verfügbaren Filtern ab. Wenn Standardgrün-, Rot- und Fernrot-Filter-Sets verfügbar sind, verwenden Sie G3BP1, eIF4G und eIF3b bei einer 1/250 Verdünnung. <ol><lI&gt; Für dieses Experiment (12 Deckgläser bei jeweils 250 μl - Gesamt: 3 ml 5% NHS), fügen Sie 12 μl von den folgenden: anti-G3BP1, anti-eIF3b und anti-eIF4G hinzu. Inkubieren der primären Antikörper unter leichtem Rühren für mindestens 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Wells 3x mit PBS und inkubieren Sie jede Wäsche für 5 min. </li><li> Für sekundäre Antikörper verdünnen Sie alle sekundären Antikörper (1/250 Verdünnung) und Hoechst Farbstoff (1 / 1.000 Verdünnung) in 5% NHS. <ol><li> Für dieses Experiment (12 Deckgläser bei jeweils 250 &amp; mgr; l - Gesamt: 3 ml 5% NHS) wurden 12 &amp; mgr; l von jeweils folgend zugegeben: Cy2-Maus, Cy3-Kaninchen und Cy5-Ziege (jeweils 1/250 Verdünnung) ) Und fügen Sie 3 μl Hoechst Farbstoff hinzu. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser mit den sekundären Antikörpern für 1 h bei RT. Während dieses und der folgenden Schritte, schützen Sie die Proben vor Licht, indem Sie die Platte mit einer Schachtel abdecken oder indem Sie Folie über die Oberseite der Gewebekulturschale legen. </li></ol></li><li> Waschen wir unsDreimal mit PBS für jeweils 5 min. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser auf beschrifteten Glasschienen mit Montagemedium. Das Montagemedium in einem 37 ° C Heizblock für 10 min erhitzen; Dadurch verringert sich die Viskosität und erleichtert die Pipettierung. Mit einer geschnittenen P200-Spitze, pipettieren Sie 25 μl Montagemedium pro Deckglas auf eine Glasrutsche; 4-8 Deckgläschen können auf eine Glasrutsche passen, vorausgesetzt, dass die Mikroskopstufe dies zulässt. Mit feinen Pinzetten, übertragen Sie das Deckglas vom Brunnen zum Schieber und achten Sie darauf, die Zellseite auf das Montagemedium zu legen. Mit einem sauberen P200-Tip drücken Sie das Deckglas nach unten. </li><li> Sobald alle Deckgläser montiert sind, verwenden Sie gefaltetes Laborgewebe, um das übermäßige Montagemedium aufzuräumen, indem Sie das Laborgewebe sehr fest auf die Folie drücken. Verwenden Sie eine Quetschflasche, die H 2 O enthält, um das überschüssige Füllmedium abzuspülen und wiederholen Sie das Blotting mit gefaltetem Laborgewebe, um das Wasser zu entfernen. </li></ol> 4. Fluoreszenz in situ &lt;/ Em&gt; Hybridisierung (FISH) <ol><li> Platte und behandeln die Zellen, mit den Schritten 1 und 2.1-4 als Leitfaden; Es ist nur notwendig, die Zellen in Spalte 1 zu plattieren, da im folgenden Experiment nur 3 Decklippen benötigt werden. </li><li> Sicherstellen, dass alle Puffer vorbereitet sind ( dh 4% PFA in PBS, 70% Ethanol in Wasser, 2x Salin-Natrium-Citrat (SSC) und 5% NHS), dass das Methanol auf -20 ° C abgekühlt wird, und das Der Hybridisierungsofen wird auf die entsprechende Temperatur erwärmt. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 aus, um die Zellen zu waschen und zu fixieren. </li><li> Permeabilisieren von Zellen durch Zugabe von -20 ° C Methanol für 10 min. </li><li> Das Methanol entfernen und die Deckgläser in 70% igem Ethanol inkubieren. Legen Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht. Die Platte mit Parafilm abdichten, um Verdunstung zu vermeiden. </li><li> Am nächsten Tag entfernen Sie das Ethanol und rehydrieren die Zellen durch Zugabe von 500 μl 2x SSC. Inkubieren Sie die Deckgläser für 5 min mit sanfter Bewegung bei RT. </li><li> Entfernen Sie die 2x SSC und fügen Sie 500 hinzuΜL von 2X SSC. 5 min unter leichtem Rühren inkubieren. </li><li> Legen Sie ein Stück Parafilm flach auf den Boden des Hybridisierungsofens. 25 μl Hybridisierungspuffer auf das Parafilm für jedes Deckglas pipettieren. Entfernen Sie das Deckglas aus der 24-Well-Schale (an dieser Stelle sind die Deckgläser zellseitig nach oben) und legen Sie die Deckglas-Zelle auf den Hybridisierungspuffer. Tun Sie dies bei 42 ° C oder wahlweise bei 65 ° C für 15 min. ANMERKUNG: Wenn Sie diesen Schritt bei 65 ° C abschließen, werden zelluläre RNAs denaturiert; Dies kann das Signal verbessern, wenn das PolyA durch Wechselwirkungen mit Proteinen maskiert wird. </li><li> Verdünnen Sie die Biotin-Oligo (dT) -Sonde (100 ng / μL) im Hybridisierungspuffer auf eine Konzentration von 2 ng / μL; 25 μl pro Deckglas ist ausreichend. </li><li> Für jedes Deckglas pipettieren Sie 25 μl Hybridisierungspuffer, der Biotin-Oligo (dT) enthält, auf das Parafilm. Heben Sie das Deckglas mit Pinzette auf und berühren Sie die Kante des Deckglases vorsichtig auf ein Laborgewebe, um überschüssiges zu entfernenHybridisierungspuffer Übertragen Sie das Deckglas in den Hybridisierungspuffer mit Biotin-Oligo (dT); Denken Sie daran, die Zelle Seite nach unten zu halten. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in eine Hybridisierungsbox, um die Verdunstung zu begrenzen. Inkubieren Sie die Deckgläser mit Biotin-Oligo (dT) in Hybridisierungspuffer für 60 min bei 42 ° C. </li><li> Legen Sie 2x SSC in den Hybridisierungsofen, damit er auf 42 ° C äquilibrieren kann. </li><li> Fügen Sie ~ 500 μl erwärmtes 2x SSC zu den Vertiefungen in der 24-Well-Schale hinzu und verwenden Sie Pinzette, um die Deckgläser in den Brunnen zu übertragen. 10 min inkubieren </li><li> Wiederholen Sie den obigen Waschschritt zweimal bei 42 ° C und dann zweimal bei RT. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.5-3.10 aus und stellen Sie sicher, dass Sie ein Streptavidin-Fluorochrom verwenden, um das Biotin-Oligo (dT) anstelle eines herkömmlichen Antikörpers zu detektieren. </li></ol> 5. Ribopuromycylierungsassay zur Beurteilung des Translationsstatus <ol><li> Platte U2OS Zellen auf Deckgläschen, wie in Schritt 1 angegeben, aber nur Platte ein Deckglas pro Zustand (in diesemFall, 3 Deckgläser: nicht kontaminiert, 100 μM Natriumarsenit und 150 μM Vinorelbin) (Abbildung 1 A). </li><li> Stress-Zellen mit dem Protokoll in Schritt 2, Abschluss der Schritte 2.1-2.4. </li><li> 5 min vor der Fixierung 2 &amp; mgr; l Puromycin (Bestand: 1,25 mg / ml, 2 &amp; mgr; l in 500 &amp; mgr; l verdünnen, um eine endgültige Puromycinkonzentration von 5 &amp; mgr; g / ml zu erhalten) und 2,9 &amp; mgr; l Emetin (Bestand: 20 &amp; mgr; g / ml; 2,9 &amp; mgr; l zu der gleichen Lösung, die bereits das Puromycin enthält) zu jeder Vertiefung, die 0,5 ml enthält. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.1-3.10 wie oben beschrieben, mit einem Anti-Puromycin-Antikörper (1/1000 Verdünnung), um Puromycin zu erkennen. Idealerweise verwenden Sie zwei weitere SG-Marker in den übrigen Kanälen. </li><li> Bei der Quantifizierung des Puromycin-Signals nehmen Sie alle Bilder mit der gleichen Belichtung. Wählen Sie diese Belichtung mit der hellsten (unbelasteten) Probe und nehmen Sie ein Bild so hell wie möglich ohne Sättigung. HINWEIS: Die Intensität des Anti-Puromycin-Fluoreszenzsignals repräsentiertDie laufende Übersetzung, da Puromycin eine Aminosäure substituiert, in das naszierende Protein einbringt und die vorzeitige Beendigung des Proteins erzwingt. </li></ol> 6. Bildaufnahme und -analyse <ol><li> Quantifizierung von Stressgranulaten <ol><li> Um SGs zu quantifizieren, erwerben Sie 3 - 5 Bilder mit&gt; 100 Zellen pro Probe mit einem 40X Ziel. Alternativ können Sie Bilder mit anderen Zielen erfassen, aber dafür sorgen, dass&gt; 100 Zellen pro Deckglas gezählt werden und dass die Vergrößerung groß genug ist, um die Granulate klar zu visualisieren. Tun Sie dies, indem Sie das Deckglas in fünf ungefähr gleiche Bereiche teilen und zufällig ein Feld aus jeder Region auswählen (Abbildung 1B ); Bilder des gleichen Feldes sollten alle Kanäle enthalten, um die Kolokalisierung von Markern zu beurteilen. </li><li> Sobald alle Bilder erworben wurden, fusionieren Sie die Kanäle. Einige Kamera-Software wird dies automatisch tun, während andere manuelle Verschmelzung erfordern; Dies kann mit gemacht werdenImageJ, indem du alle Bilder öffnest und dann [Bild | Farbe | Zusammenführen von Kanälen]. </li><li> Manuell die Gesamtzahl der Zellen durch Zählen der Anzahl der Kerne, mit Hoechst als die Kerne Marker zählen. Manuell die Anzahl der Zellen zählen, die mehr als zwei SGs pro Zelle enthalten. HINWEIS: Wenn Sie beispielsweise ein zusammengeführtes Drei-Kanal-Bild mit G3BP1 (grün), eIF4G (rot) und Hoechst (blau) verwenden, zählen Sie die Kerne (oder Anzahl der Zellen) mit dem blauen Kanal. Dann zählen SG-positive Zellen als solche mit zwei oder mehr gelben Foci pro Zelle. Die Granulate erscheinen gelb, da grün aus G3BP1 und rot von eIF4G gelb erscheinen, wenn kolokalisiert. </li><li> Bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellen, die SG positiv sind, indem Sie die Daten aus den 3-5 unabhängigen Regionen kombinieren und dann berechnen: Anzahl der SG-positiven / Anzahl der Kerne) * 100 = Prozent der SG-positiven Zellen </li></ol></li><li> Assessing Colocalization durch Line Scan Analysis - Manuelle Methode <ol><li> ÖffnenBildJ. Laden Sie es kostenlos herunter () </li><li> Öffnen Sie den ROI-Manager: [Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager ...]. </li><li> Öffnen Sie das zusammengeführte Bild in ImageJ: [Datei | Öffnen]. </li><li> Verwenden Sie das Zeilentool, das sich in der ImageJ-Symbolleiste befindet, fügen Sie eine Zeile hinzu, die durch einen SG geht, und achten Sie darauf, vor und nach dem SG einzuschließen. Fügen Sie diese Zeile zum ROI-Manager hinzu, indem Sie im ROI-Manager-Fenster auf [Hinzufügen] klicken. </li><li> Split das verschmolzene Bild in separate Kanäle, um die Lokalisierung der einzelnen Marker auf das Granulat zu beurteilen: [Bild | Farbe | Split Channel]; Dies wird das verschmolzene Bild in drei Schwarz-Weiß-Bilder aufteilen. </li><li> Stellen Sie im Schwarz-Weiß-Bild sicher, dass die Zeile ausgewählt ist. Die Zeile wird ausgewählt, wenn sie im Bild erscheint. Wenn nicht, klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf die Zeile im Panel; Dies markiert die Linie in blau im ROI-Manager-Fenster und macht die Linie sichtbar auf dem Schwarz-Weiß-Bild. Wenn die Zeile immer noch nicht erscheint, ist sicher, dass &quot;alles anzeigen&quot; istEckte im ROI-Manager und klicke dann auf die Zeile im Bild. </li><li> Analysieren Sie die Intensität der Linie: [Analysieren | Plot-Profil]; Dies wird das &quot;Plot Profile&quot; -Fenster, das die Intensität des Signals über die Linie zeichnet zu bringen. </li><li> Klicken Sie im Fenster &quot;Plot Profile&quot; auf [Liste], in dem ein Fenster mit den Rohdaten aus der Grafik aufgeführt wird. Kopiere alle Daten in diesem Fenster und füge sie in eine Tabellenkalkulation ein. Um dies zu tun, wählen Sie alle Daten im Fenster: [Bearbeiten | Alles auswählen]. Kopiere das Datum: [Bearbeiten | Kopieren]. Öffnen Sie eine Tabellenkalkulation und fügen Sie die Daten ein: [Bearbeiten | Paste]. </li><li> Komplette Schritte 6.2.6 - 6.2.8 für jeden Kanal separat. Sei sicher, den Kanal zu beurteilen, der beurteilt wird. </li><li> In einer Kalkulationstabelle einen Liniengraphen der Ergebnisse erzeugen. Wählen Sie die Spalten aus, die Daten enthalten, indem Sie [Steuerung] drücken und auf den Buchstaben oben in jeder Spalte klicken. Dann wählen Sie Liniendiagramm: [Einfügen | Liniendiagramm]. </li><li> Wiederholen Sie diese Analyse für multIple Stressgranulat über mehrere unabhängige Experimente hinweg. </li></ol></li><li> Assessing Colocalization durch Line Scan Analyse - ImageJ Plugin <ol><li> Downloaden und installieren Sie das RGB-Profil-Tool von der ImageJ-Website (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Bei korrekter Installation sollte in der Symbolleiste ein rotes, grünes und blaues (RGB) -Symbol angezeigt werden. </li><li> Öffnen Sie das Bild ( zB Tiff, JPG) in ImageJ: [Datei | Öffnen]. </li><li> Klicken Sie auf das RGB-Symbol in der ImageJ-Symbolleiste. </li><li> Klicken Sie auf und ziehen Sie, um eine Zeile hinzuzufügen, die sich durch einen SG erstreckt. Ein Bild des Histogramms erscheint in einem Popup-Fenster. </li><li> Speichern Sie die Daten als Bild: [Datei | Speichern unter | Tiff]. Alternativ exportieren und grafisch die Daten in einem anderen Grafikprogramm mit Schritt 6.2.8 von oben. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wie durch immunhistologische Studien bei multiplen Krankheiten belegt, führt chronischer Stress zur Bildung verschiedener intrazellulärer Herde. Zum Beispiel sind die meisten neurodegenerativen Erkrankungen durch intrazelluläre Aggregate von unlöslichen Proteinen gekennzeichnet. Die Anwesenheit von SG-assoziierten Proteinen in solchen Aggregaten ist oft die Grundlage für den Schluss, dass solche Herde SGs sind. Eine ähnliche Schlussfolgerung wird auch gezogen, wenn SG-Marker-positive zytoplasmatische Herde in Zellen beo...

Zellen verwenden viele Mechanismen, um auf Stress zu reagieren. Einige Antworten treten auf der posttranskriptionellen Ebene auf und beinhalten die Regulierung der mRNA-Translation und / oder der Stabilität 1 , 2 . Stressmodulierte mRNA-Translationsstillstand und -abbau sind mit der Bildung spezifischer nichtmembranöser zellulärer Herde verbunden, wobei die am stärksten charakterisierten Stressgranulate (SGs) 3 sind . SGs sind zytoplasmatische Herde, die die Nicht-Translations von mRNPs in translatorisch verhafteten Zellen, die auf Stress reagieren ( z. B. Oxidation, Hitzeschock, Nährstoffhunger und Virusinfektion), konzentrieren. Zusätzlich zur Nicht-Translation von mRNAs enthalten SGs Translationsinitiierungsfaktoren, RNA-bindende Proteine ​​und verschiedene Signalproteine 5 . SGs sind Biomarker der gehemmten Protein-Translation und veränderten RNA-Metabolismus und wurden mit Zellüberleben und Apoptose, Signalweg verbundenS und nukleare Prozesse 5 . SGs sind dynamische Entitäten, und ihre Bildung ist eng mit dem Status der zellulären Übersetzung verbunden 6 . Trotz ihrer scheinbar soliden Erscheinung, die meisten SG-Protein-Komponenten schnell ein- und ausschalten, mit einer verweilzeit von Sekunden. Während SGs für Minuten bis Stunden bestehen bleiben, sind die meisten ihrer Komponenten im raschen Fluss. Die Hemmung der Translationsinitiierung und die daraus folgende Demontage von translatierenden Polysomen fördern die Bildung von SGs; So sind die SGs im Gleichgewicht mit der Übersetzung von Polysomen. Dieses Polysom ​​/ SG-Gleichgewicht ist der Schlüssel zur Unterscheidung bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden 6 , 7 . Die Veranlassung der Translationsinitiierung beinhaltet die Umwandlung von translation-kompetenten Prä-Initiierungskomplexen, die mRNA, Translationsinitiationsfaktoren (eIF) und 40S ribosomale Untereinheiten enthalten (s<html> O-genannt 48S-Komplexe) in translatorisch blockierte Komplexe (sogenannte 48S * -Komplexe), die sich in SGs 4 , 6 koaleszieren können. SGs werden durch Translationsstillstand an zwei verschiedenen Schritten stromaufwärts von 48S-Komplexbildung gefördert: Interferenz mit den Funktionen des cap-bindenden eIF4F-Komplexes ( zB Targeting auf seine eIF4A-Untereinheit) oder Phosphorylierung der α-Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF2, vermittelt durch eins Oder mehr der vier eIF2-Kinasen. Die Anwesenheit von blockierten 48S-Komplexen ( dh 40S ribosomale Untereinheiten und ausgewählte Translationsinitiierungsfaktoren) ist ein Kennzeichen der SGs 8 , 9 . SGs wurden mit verschiedenen pathologischen Zuständen wie Virusinfektionen, Neurodegeneration, Autoimmunität und Krebs 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Mutierte Formen von mehreren SG-Komponenten sind mit neurodegenerativen Erkrankungen ( zB amyotropher Lateralsklerose) assoziiert, bei denen Neuronen intrazelluläre pathologische Einschlüsse zeigen, die im neuronalen Tod aktive Rollen spielen können. Einige Viren entführen SG-Komponenten, um die SG-Bildung zu hemmen und die Virusreplikation zu verbessern 14 . Jüngste Studien verknüpfen auch SGs an Krebs 15 und an Krebszellüberleben unter Chemo- und Strahlentherapie-Behandlungen 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Während solche Erkenntnisse ein großes Interesse an der SG-Biologie geweckt haben, fehlen viele der veröffentlichten Berichte über wichtige Kontrollen, um die Bildung von bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden zu unterscheiden. SGs wurden anfänglich als nichtmembranöse zytoplasmatische Foci beschrieben, die aus ausgewählten mRNA-bindenden Proteinen (RBPs) zusammengesetzt waren, einschließlich T-Zell-ntrazelluläres Antigen 1 (TIA-1) und Poly-A-bindendes Protein (PABP); Übersetzungsinitiierungsfaktoren; Polyadenylierten mRNA; Und kleine ribosomale Untereinheiten 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionell wurde ihre Zusammensetzung durch Techniken wie Immunfärbung und die ektopische Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen 23 , 24 bestimmt . Aufgrund ihrer hochdynamischen Natur bleibt die Immunolokalisierung von SG-Proteinen und / oder mRNAs die definierende Methode zur Detektion von SGs 23 , 24 . Bisher werden viele RBPs und andere Proteine ​​(über 120 verschiedene Proteine) als SG-Komponenten beschrieben 11 . So viele SG-lokalisierte Proteine ​​verändern ihre Lokalisation sowohl in einer stressabhängigen als auch in einer unabhängigen Weise und können sich an anderen intrazellulären Kompartimenten und Herden ansammeln. Es ist wichtig, korrekte SG-Marker zu wählen und funktionelle Kriterien zu verwenden, um SGs von anderen Arten von Stress-induzierten zu unterscheiden Foci Bona fide SGs enthalten mRNA, Translationsinitiationsfaktoren und kleine ribosomale Untereinheiten und befinden sich im dynamischen Gleichgewicht mit Translation. Dieser einfache Workflow ist darauf ausgelegt, festzustellen, ob Stress-induzierte Herde bona fide SGs sind. Dieser Workflow umfasst mehrere experimentelle Ansätze mit U2OS-Zellen, Zellen, die üblicherweise zur Untersuchung von SGs verwendet werden. Diese Zellen sind ideal, da sie ein großes Zytoplasma haben, sind relativ flach und haften stark an Glasdeckgläschen. Andere Zelltypen können verwendet werden, um SGs zu studieren, aber es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass Unterschiede in der Zeitmessung, der Arzneimittelkonzentration und der Fülle von SG-Nukleierungsproteinen die Kinetik und den Compo verändern könnenSition Zusätzlich reagieren einige Zellen auf die Paraformaldehyd-Fixierung, indem sie Zelloberflächen-Blasen bilden, was dann ein gerafftes Aussehen gibt, das die punktuelle Lokalisierung einiger SG-Marker verursacht; Ohne sorgfältige Analyse können diese als SGs falsch klassifiziert werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, alle Kriterien zu beurteilen, die erforderlich sind, um stressinduzierte Herde als bona fide SGs zu identifizieren. Vinorelbin (VRB), ein Krebs-Therapeutikum, das SGs 20 fördert, sowie Sodium Arsenite (SA), ein robuster und gut charakterisierter SG-Induktor, werden als Stress für die Experimente in diesem Protokoll verwendet. Kanonische SGs enthalten mehrere SG-Marker (sowohl Proteine ​​als auch mRNAs), die sich in zytoplasmatischen Herden kolokalisieren. Dieses Protokoll verwendet sowohl Immunfluoreszenz- als auch Fluoreszenz- in-situ- Hybridisierung (FISH), um die Lokalisierung von Proteinmarkern und polyadenylierten mRNA 22 zu detektieren. Kurz gesagt, indirekte Immunfluoreszenz verwendet Antikörper ( i.E. Primäre Antikörper), die für ein gegebenes Protein spezifisch sind, um es innerhalb der Zelle zu detektieren. Dann erkennen sekundäre Antikörper (meist speziespezifisch) an Fluorochrome den primären Antikörper und zeigen die Zielprotein-Lokalisation. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um das lokalisierte Signal innerhalb der Zelle zu detektieren. Die Verwendung von in verschiedenen Spezies produzierten Antikörpern und deren Nachweis mit unterschiedlich gefärbten sekundären Antikörpern ermöglicht den Nachweis der Kolokalisation mehrerer Antikörper, was darauf hinweist, dass ihre Proteinziele an der gleichen Stelle 23 gefunden werden . Es ist wichtig, Marker auszuwählen, die bei der Korruption bei bona fide SGs überprüft wurden. FISH verwendet eine markierte Sonde, die Basenpaare zu einer spezifischen RNA oder DNA-Sequenz 25 bildet . Um mRNA zu detektieren, verwendet dieses Protokoll eine biotinylierte Oligo (dT) 40- Sonde, die (oder Basenpaare) an den PolyA-Schwanz von mRNA hybridisiert ( dh PolyA FISCH). Die biotinylierte Sonde wird dann unter Verwendung von fluoreszenzkonjugiertem Streptavidin nachgewiesen, da Streptavidin eine hohe Affinität für Biotin aufweist. Bei der Beurteilung von SGs ist es wichtig, PolyA FISH mit Immunfluoreszenz zu koppeln, die einen SG-Marker detektiert, wie bei bona fide SGs, die beiden Signale sollten kolokalisieren. Mit diesem Protokoll wird die Kolokalisierung auf mehrere Arten beurteilt. In einem mehrkanaligen ( dh RGB: rot, grün und blau) Bild wird die Kolokalisierung die Farbe des überlappenden Signals verändern ( z. B. kolokalisiert rot und grün gelb) 23 . Zusätzlich wird die Kolokalisierung graphisch unter Verwendung einer Linienabtastanalyse quantifiziert, wobei die Intensität jeder der Farben über eine gegebene Linie 8 , 20 gemessen wird . Dieses Protokoll beschreibt zwei Zeilen-Scan-Analyse-Verfahren mit ImageJ 26 . Ein Verfahren ist manuell und geht durch den gesamten Prozess, whiDer andere verwendet ein Makro oder ein einfaches Programm, das die manuellen Schritte automatisiert. Es ist wichtig, durch das manuelle Programm zu gehen, um das Makroverfahren zu verstehen. SGs bilden sich in Zellen, wo die Translation unterdrückt wird; Daher sollten Zellen mit SGs verringerte Werte der globalen Translation im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigen. Experimentell wird Ribopuromycylierung verwendet. Puromycin und Emetin werden den Zellen für eine kurze Dauer vor der Fixierung zugesetzt, so dass das Puromycin in die aktive Bildung von Polypeptiden einbinden kann, was die Beendigung 27 , 28 verursacht. Eine Behandlung mit Emetin ist erforderlich, um eine Wiederinitiierung zu verhindern 29 . Puromycin kann dann mit Anti-Puromycin-Antikörper nachgewiesen werden, was eine Momentaufnahme der aktiven Translation ergibt. Diese Methode wird verwendet, weil es schnell ist, erfordert nicht vorhungern mit einem Medium fehlt eine bestimmte Aminosäure (und potenziell Vorspannung der Zellen), und zeigt dieSubzelluläre Lokalisation der Proteinübersetzung Andere Verfahren, insbesondere modifizierte Aminosäureanaloga, wie das Methionin-Analog-L-Azidohomoalain (AHA), gekoppelt mit der &quot;Klick-it&quot; -Aryge 30 , wurden verwendet, um zu zeigen, dass Zellen, die SGs enthalten, eine viel geringere Translation aufweisen als die benachbarten Zellen 31 . Diese Technik erfordert jedoch einen Methionin-Hunger, gefolgt von einer Puls-Markierung für 15-30 min. Der Methionin-Hunger stellt einen zusätzlichen Stress dar, während die lange Etikettierzeit ( dh 15-30 min) zur Messung der kumulativen und nicht fortlaufenden Translation führt und es den neu synthetisierten Proteinen ermöglicht, sich von ihrem Syntheseort zu ihrem endgültigen Ziel innerhalb der Zelle. Im Gegensatz dazu ist die Ribopuromycylierung viel schneller und kompatibel mit jedem Medium, wie dem glucosefreien Medium, das verwendet wird, um SGs durch Glucoseverhungern zu induzieren. Die kanonischen SGs befinden sich im dynamischen GleichgewichtMit aktiv übersetzenden Polysomen. Dies kann experimentell beurteilt werden, indem man Proben mit den Medikamenten behandelt, die Polysomen stabilisieren oder destabilisieren, wodurch das Gleichgewicht zwischen SGs und Polysomen gekippt wird 23 . Cycloheximid (oder Emetin, das sich ähnlich verhält) blockiert die Dehnung durch &quot;Einfrieren&quot; von Ribosomen auf mRNA, wodurch der Pool der verfügbaren nicht-polysomalen mRNPs, die SGs bilden können, verringert. Experimentell kann dies auf zwei Arten verwendet werden: durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin) vor Stress, um eine SG-Bildung zu verhindern, oder durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin), nachdem die SGs gebildet worden sind, auch ohne das Stressmittel zu entfernen, was eine SG-Demontage verursacht, wie es blockiert ist Präinitiierungskomplexe werden langsam in die Polysomfraktion eingelassen. Im Gegensatz dazu verursacht Puromycin eine vorzeitige Beendigung und fördert die Polysom-Demontage, wodurch der Pool von initiierenden mRNAs erhöht wird, die in der Lage sind, in SGs zusammenzusetzen. Experimentell erhöht die Puromycin-Behandlung die Anzahl der SGs oder senkt den SchwellenwertD, bei denen sie sich als Reaktion auf abgestuften Stress oder Arzneimitteldosierung bilden. Bei der Beurteilung der Wirkung von Puromycin ist es wichtig, ein submaximales Niveau des Medikaments von Interesse zu verwenden, da Puromycin erwartet wird, die Wirkung des Arzneimittels zu erhöhen und den Prozentsatz der Zellen, die SGs zeigen, zu erhöhen - dies kann nicht auftreten, wenn das Medikament / Stress verursacht SGs in 100% der Zellen anfangs. Dies steht im Gegensatz zu der Cycloheximid-Behandlung, die SGs zerlegt und am besten funktioniert, wenn ~ 95% der Zellen anfänglich SGs zeigen, so dass die größtmögliche Abnahme beobachtet und genau quantifiziert werden kann. Dieses Protokoll bietet einen Rahmen für die Untersuchung von SGs in Säugetierzellen. Zu den Methoden gehören: (1) Immunfluoreszenzfärbung und ImageJ-Analyse zur Beurteilung der Kolokalisierung der klassischen SG-assoziierten Marker eIF4G, eIF3b und Ras GTPase-aktivierenden Proteinbindungsprotein 1 (G3BP1) in putativen SGs; (2) Oligo (dT) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (PolyA FISH) zur Detektion polyadenylierter mRNA; (3) Cycloheximid- und Puromycin-Behandlung, um zu bestimmen, ob stressinduzierte Herde im dynamischen Gleichgewicht mit Polysomen sind; Und (4) Ribopuromycylierung zur Beurteilung des Translationsstatus von Zellen, die putative SGs enthalten. Zusammen können diese Assays bestimmen, ob Stress-induzierte Herde als bona fide SGs eingestuft werden können.

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; HTB-96&Handel;</td><td>Häufig geschrieben "U2OS" Kultur bei 37 &deg; C unter 5 % CO2 in 10 % FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Enthält 4,5 g/l Glukose, Pyruvat und Phenol red Ergänzt mit 10 % FBS, 10 mM HEPES und Penicillin/Steptomycin Vorwärmung der vorherigen Arzneimittelverdünnung</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Zur Ergänzung von</td></tr><tr><td>Medien HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Zur Ergänzung von</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Zur Ergänzung von Medien</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Laborgewebe (kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas für Wachstumsabdeckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Vor Gebrauch autoklaviert In der Gewebekulturhaube steril halten</td></tr><tr><td>Natrium(meta)arsenit &ge; 90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>In Wasser auf 1 M Konzentration auflösen, dann auf 100 & Mikro verdünnen; M als Arbeitsmaterial</td></tr><tr><td>Vinorelbin (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>In Wasser auf 10 mM auflösen</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Zur Bestimmung des Translationsniveaus (Ribopurmycylierung) -Zur Beurteilung der SG-Verbindung mit aktiver Translation In Wasser verdünnen auf 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Emetindihydrochloridhydrat</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Wird in Kombination mit Puromycin verwendet, um den allgemeinen Translationsgehalt zu bestimmen Wird verwendet, um die SG-Verbindung mit aktiver Translation zu beurteilen -In Wasser auf 10 mg/ml</td></tr><tr><td>verdünnen Cycloheximid (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Wird verwendet, um die SG-Verbindung mit aktiver Translation zu beurteilen Verdünnt in Wasser auf 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Waschpuffer für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Reagenzqualität, kristallin (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Stellen Sie eine 4%ige Lösung in heißem PBS im Abzug her und rühren Sie, bis sie aufgelöst ist Aliquots können bei -20 & deg gelagert werden; C für mehrere Monate Gefährlich, Lüftung verwenden Im Sondermüll entsorgen</td></tr><tr><td>Methanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Prechill auf -20 &deg; C vor Gebrauch Im Sondermüll entsorgen</td></tr><tr><td>Normales Pferdeserum (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td> In <td>PBS auf 5 % verdünnen Natriumazid zur Lagerung bei 4 μd; C Blockierungslösung für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Ethanol, rein, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Mit Wasser auf 70% verdünnen</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger Fisherbrand</td><td></td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti G3BP1 Antikörper (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Bei 4 & deg lagern; C 1/100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti eIF4G Antikörper (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Bei 4 > lagern; C 1/250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziege anti eIF3&eta; (N-20)-Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta; ist auch bekannt als eIF3b Bei 4 > lagern; C 1/250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus Anti-Puromycin 12D10 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C 1/1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Rekonstitution in Wasser pro Hersteller" s Anweisungen dann bei 4 Grad lagern; C 1/250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Rekonstituiert in Wasser gemäß Hersteller" s Anweisungen dann bei 4° lagern; C 1/2.500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Rekonstituiert in Wasser gemäß Hersteller" s Anweisungen dann bei 4° lagern; C 1/250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 Lösung</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Inkubieren mit Sekundärantikörpern Stammlösung 0,5 mg/ml in dH20, vor Licht schützen -Bei 4 μg lagern; C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Rekonstitution in Wasser pro Hersteller" s Anleitung, dann bei 4 Grad lagern; C 1/250 Verdünnungsoligo</td></tr><tr><td>-(dT)40xSonde biotinilierte</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>Rekonstitution in Wasser bis 100 ng/ml, aliquot und Lagerung bei -20 & deg; C Vor Gebrauch 1/50 in Hybridisierungspuffer verdünnen Hybridisierungsbox nach Kundenwunsch</td></tr> <tr><td></td><td>//</td><td></td> <td>Herstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer mit einer beliebigen Aufbewahrungsschubbox, indem Sie befeuchtetes Papier auf den Boden legen - heizen Sie die Box vor Gebrauch vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>vor 20x SSC-Puffer</td><td>Thermo Fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Verdünnen Sie auf 2x SSC mit RNase freiem Wasser (DEPC-behandelt) Bei RT lagern Waschpuffer für FISH</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus Hybridisierungspuffer</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>Block- und Sondeninkubationspuffer für</td></tr><tr><td>FISH-Objektträger-Montagemedien</td><td>selbstgemacht</td><td>/</td><td>Mix 5 g " kaltlöslich" Poly(vinylalkohol) in 20 mL PBS Durch Ultraschall mischen, gefolgt von Rühren O/N bei RT 5 mL Glycerin und 0,2 mL 20 % Natriumazid hinzufügen und 16 h bei RT rühren Zentrifugieren bei 20.000 g für 20 min, große Pellets Aliquot viskose Flüssigkeit verwerfen, Langzeitlagerung bei -20 & Grad; C, 1 Woche bei 4 Grad; C</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Reagenz zur Herstellung von Vinol</td></tr><tr><td>Glycerin Sigma</td><td></td><td>G5516-100ML</td><td>Reagenz zur Herstellung von</td></tr><tr><td>Vinol-Natriumazid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Konservierungsmittel zur Blockierung von Lösung und Vinol Eine 20%ige Verdünnung in Wasser vornehmen</td></tr></tbody></table>

methoden zur klassifizierung von zytoplasmatischen foci als säugetier-stressgranulat

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Zellen werden oft durch plötzliche Umweltveränderungen herausgefordert. Stressgranulate (SGs), zytoplasmatische Ribonukleoproteinkomplexe, die sich in Zellen bilden, die Stressbedingungen ausgesetzt sind, sind in verschiedenen Aspekten des Zellstoffwechsels und des Überlebens verwickelt. SGs modulieren zelluläre Signalwege, post-transkriptionale Genexpression und Stress-Response-Programme. Die Bildung dieser mRNA-haltigen Granulate ist direkt mit der zellulären Translation verbunden. SG-Assembly wird durch gehemmte Translationsinitiation ausgelöst, und die SG-Demontage wird durch Translationsaktivierung oder durch gehemmte Translationsdehnung gefördert. Diese Beziehung wird durch SG-Komposition weiter hervorgehoben. Core-SG-Komponenten sind gestoppte Translationsvorinitiierungskomplexe, mRNA und ausgewählte RNA-bindende Proteine ​​(RBPs). Der Zweck der SG-Versammlung besteht darin, zelluläre Energie durch Sequestrierung von translatorisch blockierten Housekeeping-mRNAs zu erhalten, was die verbesserte Translation von stressempfindlichen Proteinen ermöglicht. In additivAuf die Kernbestandteile, wie z. B. gestoppte Translationsvorbereitungskomplexe, enthalten SGs eine Fülle von anderen Proteinen und Signalmolekülen. Defekte in der SG-Bildung können die zelluläre Anpassung an Stress beeinträchtigen und so den Zelltod fördern. SGs und ähnliche RNA-haltige Granulate wurden mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten, einschließlich neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs, verbunden, was zu dem jüngsten Interesse an der Klassifizierung und Definition von RNA-Granulat-Subtypen führte. Dieses Protokoll beschreibt Assays zur Charakterisierung und Quantifizierung von Säugetier-SGs.

Stress-induzierte Herde sind nicht unbedingt SGs. SGs werden als zytoplasmatische Foci klassifiziert, die mRNAs, Translationsinitiationsfaktoren und RNA-bindende Proteine ​​enthalten und im Gleichgewicht mit aktiver Translation stehen. Das obige Protokoll kann als Vorlage verwendet werden, um zu charakterisieren, ob eine gegebene Spannung bona fide SGs induziert. SGs kolokalisieren mit anderen bekannten SG-Markern, ei...

Stressgranulate (SGs) sind nichtmembranöse zytoplasmatische Strukturen, die sich in Zellen bilden, die einer Vielzahl von Spannungen ausgesetzt sind. SGs enthalten mRNAs, RNA-bindende Proteine, kleine ribosomale Untereinheiten, Translations-bezogene Faktoren und verschiedene Zell-Signal-Proteine. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der mehrere experimentelle Ansätze verwendet, um bona fide SGs zu erkennen, zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Arbeitsablaufs besteht darin zu bestimmen, ob im Cytoplasma identifizierte Foci echte Stress-Granula sind, also RNA-Granula, die wichtige Funktionen in der Zellphysiologie erfüllen. Der Hauptvorteil dieses Arbeitsablaufs liegt darin, dass er alle grundlegenden Eigenschaften von Stress-Granula überprüft. Obwohl dieser Arbeitsablauf für humane Osteosarkom-Zelllinien des Typs U-2 OS dargestellt wird, kann er ebenso auf andere Zelllinien und primäre Zellen angewendet werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da nicht alle stressinduzierten Foci Stressgranula sind. Unser Arbeitsablauf umfasst alle Experimente, die notwendig sind, um sie voneinander zu unterscheiden. Ich werde dieses Verfahren gemeinsam mit Anais Aulus demonstrieren.Wir sind Postdoktoranden in dem Labor von Paul Anderson und Pavel Ivanov. Zunächst werden Zellen auf Deckgläsern ausgesät, die in 24-Loch-Platten platziert sind, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach einer Übernacht-Inkubation wird das Kulturmedium aus den Vertiefungen B1 bis B4 und C1 bis C4 der 24-Loch-Platte abgesaugt.Geben Sie 500 Mikroliter des Mediums, das mit 100 Mikromolar Natriumarsenit ergänzt wurde, in die Vertiefungen B1 und B2, anschließend 500 Mikroliter des Mediums mit 50 Mikromolar Natriumarsenit in die Vertiefungen B3 und B4. Danach geben Sie 500 Mikroliter des Mediums, das 150 Mikromolar Vinorelbin enthält, in die Vertiefungen C1 und C2. Schließlich fügen Sie 500 Mikroliter des Mediums, das mit 125 Mikromolar Vinorelbin angereichert wurde, in die Vertiefungen C3 und C4 hinzu. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach 30-minütiger Inkubation geben Sie in die Zellen der Spalte zwei fünf Mikroliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter Cycloheximid und in die Zellen der Spalte vier zwei Mikroliter einer Lösung mit 1,25 Milligramm pro Milliliter Puromycin. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Lösungen zu vermischen, und stellen Sie die Platte für weitere 30 Minuten in den Inkubator. Um die Zellen zu fixieren, entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen mit etwa 250 Mikrolitern PBS. Geben Sie etwa 250 Mikroliter einer gepufferten 4 %igen Paraformaldehydlösung hinzu, um die Zellen zu fixieren, und stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Deckgläschens vollständig bedeckt ist. Anschließend lassen Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rüttler stehen.Entfernen Sie anschließend die Paraformaldehydlösung und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß. Geben Sie etwa 250 µL eiskaltes Methanol hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren und zu glätten. Inkubieren Sie die Platte weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.Nach Abschluss der Permeabilisierung das Methanol verwerfen und die Zellen durch Zugabe von etwa 250 Mikrolitern eines Blockpuffers für eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Anschließend die Primärantikörperlösung herstellen, indem 12 Mikroliter der Antikörper gegen G3BP1, eIF4G und eIF3B zu drei Millilitern Blockpuffer gegeben werden. Danach 250 Mikroliter der Antikörperlösung in jede Vertiefung der 24-Loch-Platte geben.Die Platte mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren. Nach einer Stunde Inkubation die Antikörperlösung entfernen und die Zellen mit etwa 250 Mikrolitern PBS fünf Minuten lang waschen. Anschließend 12 Mikroliter Anti-Maus-Cy2-, Anti-Kaninchen-Cy3- und Anti-Ziege-Cy5-Antikörper zusammen mit 3 Mikrolitern Hooks-Farbstoff zu 3 Millilitern Blockierpuffer geben, um die sekundäre Antikörperlösung herzustellen.Geben Sie 250 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung in jede Vertiefung und decken Sie die Platte ab, um die Proben vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Nach Beendigung der Inkubation entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen die Zellen fünf Minuten lang mit PBS.Das Einbettungsmedium 10 Minuten lang in einem Wärmeprobeblock bei 37 Grad Celsius erwärmen, um die Viskosität zu verringern. Anschließend mit einer vorgeschnittenen 200-Mikroliter-Pipettenspitze 25 Mikroliter des Einbettungsmediums auf einen beschrifteten Objektträger geben. Mit feinen Pinzetten die Deckglasabdeckung aus der Vertiefung auf den Objektträger übertragen, wobei die Oberseite umgedreht wird, sodass die Zellen dem Einbettungsmedium zugewandt sind.Verwenden Sie eine saubere P200-Pipettenspitze, um das Deckglas niederzudrücken. Sobald alle Deckgläser aufgebracht sind, entfernen Sie das überschüssige Einbettmedium, indem Sie fest mit einem Labor-Tissue gegen den Objektträger drücken. Spülen Sie danach den Objektträger mit Wasser ab.Und sofort danach erneut mit Laborpapier abtupfen. Die fixierten Zellen durch Inkubation mit 250 µL eiskaltem Methanol bei Raumtemperatur für 10 Minuten permeabilisieren. Danach etwa 250 µL 70 %igem Ethanol in die leeren Vertiefungen der Platte geben und die Platte mit Parafilm abdichten, um Verdunstung zu verhindern.Die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Übernacht-Inkubation das Ethanol entfernen und die Zellen durch Zugabe von 500 Mikroliter 2XSSC wiederbefeuchten. Die Deckgläser fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren.Entfernen Sie anschließend die Lösung und geben Sie erneut 500 Mikroliter SSC hinzu. Inkubieren Sie die Platte weitere fünf Minuten bei sanfter Schüttelbewegung. Danach legen Sie die Parafolie auf den Boden eines Hybridisierungsöfchens und pipettieren 25 Mikroliter Puffer für die Hybridisierung darauf.Überführen Sie die Deckglas von der 24-Loch-Platte, wobei die Oberseite umgedreht wird, sodass die Zellen der Hybridisierungspufferlösung zugewandt sind. Inkubieren Sie die Deckgläser bei 42 Grad Celsius für 15 Minuten. Geben Sie mit der Pipette 25 Mikroliter einer Biotin-Oligo-dT-Lösung auf das Parafilm im Hybridisierungs-Ofen.Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Deckglas aufzuheben, und tupfen Sie dessen Rand vorsichtig mit einem Laborpapier ab, um überschüssiges Hybridisierungspuffer zu entfernen. Überführen Sie das Deckglas in die Biotin-Oligo-dT-Lösung, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen nach unten zeigen, und inkubieren Sie es 60 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, geben Sie etwa 500 Mikroliter vorgewärmtes 2XSSC in die Vertiefungen der 24-Loch-Platte.Überführen Sie dann mithilfe einer Pinzette den Deckglaser auf die Vertiefung und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Nach weiterer Färbung der Zellen mit Antikörperlösung betrachten Sie die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop. Dargestellt sind hier Bilder der unbehandelten U-2 OS-Zellen, die keine Granula oder Foci enthalten, die mit den Stress-Granula-Markern G3BP1, eIF4G und eIF3B gefärbt wurden.In U-2-OS-Zellen, die mit Natriumarsenit oder Vinorelbin behandelt wurden, bildeten sich zytoplasmatische Foci, die G3BP1, eIF4G und eIF3B enthielten. Die Ko-Lokalisation dieser Marker wurde mittels Linienscan-Analyse für jeden Kanal bei erhöhter Vergrößerung bestätigt, gefolgt von der Überlagerung der erhaltenen Graphen. Zusätzlich enthielten die in den behandelten Zellen identifizierten zytoplasmatischen Foci mRNA, wie durch Poly-A-FISH gezeigt wurde.Das Oligo-dT-Signal colokalisierte mit dem G3BP1-Signal, was die Identität der Stressgranula bestätigt. Wenn man den Workflow einmal beherrscht, kann dieser innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden, sofern er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Immunfluoreszenz und eine fluoreszierende Hybridisierung durchführt.Schritte, die für die korrekte Charakterisierung und Identifizierung von Stress-Granula entscheidend sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von PSA und eine ausreichende Belüftung sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Vonaesch, P. et al., Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulatbildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Infektion von Epithelzellen mit dem pathogenen Bakterium Shigella flexneri und die daraus resultierende zelluläre Reaktion des Wirts. Bakterielle Effektorproteine stören die Wirtstranslation und lösen die Bildung membranloser Organellen aus, sogenannte Stressgranulate, die die adaptive Reaktion der Zelle auf...

Stressgranulatbildung während der Shigella-Infektion von krebsartigen Epithelzellen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren, die aus mRNAs, RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und verschiedenen anderen Proteinen bestehen.

Ein Immunfluoreszenz-Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung von Stressgranula bei Säugetieren

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Stress-Granulat (DMS) sind zytoplasmatische RNA Granulat installiert Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) und in der zellulären Antwort auf verschiedene Belastungen wichtig enthalten. Dynamik der SGs können in lebenden Zellen durch die Visualisierung der Lokalisation einer markierten Komponente von SGs in transfizierten primären Zellen nach Stress verfolgt werden.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie.

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde kürzlich als System zur Untersuchung von Proteinfehlfaltung und Proteostase etabliert. Hier beschreiben wir eine neue bildgebende Methodik, um die temperaturinduzierte Proteinaggregation und die zelluläre Stressantwort in D. discoideum zu untersuchen.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

Wir beschreiben eine Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse der Stressgranulatbildung in Säugetierzellen, nachdem die Zellen mit Bakterien und einer Anzahl unterschiedlicher Belastungen herausgefordert wurden. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die zelluläre Stressgranulat-Antwort in einem breiten Bereich von Wirts-bakteriellen Wechselwirkungen zu untersuchen.

Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulat-Bildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca2 + Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Wir präsentieren einen frei verfügbaren Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in bestimmten Zellkompartimenten in Fluoreszenzmikroskopiebildern. Dieser benutzerfreundliche Workflow wurde auf der Open-Source-Software Icy entwickelt und verwendet auch ImageJ-Funktionalitäten. Die Pipeline ist ohne Kenntnisse in der Bildanalyse erschwinglich.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung globaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Hirnmikroglia. Die Arbeit enthält auch das Mikroglia-Isolationsprotokoll, das für die Datenerhebung verwendet wurde.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Erfahren Sie eine validierte Methode zur Identifizierung echter Stressgranula in Säugetierzellen mittels Immunfluoreszenz und FISH. Dieses Protokoll ermöglicht die Unterscheidung von zytoplasmatischen Foci und deren Charakterisierung.

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

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