Name: Gehirn Membran Fraktionierung: An Ex Vivo Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Gehirn-Membranfraktionierung zur Isolierung synaptischer Proteine aus Mäusehirnen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinverteilung in prä-, post- und extrasynaptischen Kompartimenten.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von Ministerio de Economìa y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 und PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ) Und Agentschap voor Innovatie Tür Wetenschap en Technologie (SBO-140028) an FC Auch X. M, VF-D. Und FC gehören zur &quot;Neuropharmakologie und Schmerz&quot; akkreditierten Arbeitsgruppe (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Die Arbeit wurde auch von der &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; von CAPES (Brasilien) bis FC unterstützt

Alle tierversuchenden Verfahren wurden von der Universität von Barcelona Ausschuss für Tiernutzung und Pflege (CEEA) unter Einhaltung der Richtlinien, die im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 11 und nach der Europäischen Gemeinschaft, das Gesetz 86/609 / CCE, FELASA und ARRIVE Richtlinien. So sind Mäuse in Standardkäfigen untergebracht, mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser und werden unter kontrollierten Standardbedingungen (12 h dunkler / leichter Zyklus ab 7:30 Uhr, 22 ° C Temperatur und 66% Feuchtigkeit) gehalten. 1. Erhalten von Maus-Gehirn-Synaptosomen mit einem diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten Anmerkung: Diese Methode wurde zuvor gemeldet 10 . <ol><li> Bereiten Sie frischen Isolationspuffer (IB), pH 7.4; 2 M Saccharose; 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl 2 ; Und 0,1 mM CaCl &amp; sub2 ; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis. </li><li> SaFünf Mäuse durch zervikale Versetzung beenden Entkapseln und schnell das Gehirn eines jeden Tieres entfernen. Die Hirnregion von Interesse (dh den Hippocampus, 0,25-0,35 g frisches Gewebe) zerlegen und in eine 5 mL Potter-Elvehjem-Glasröhre auf Eis mit 1 mL IB geben. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einem Homogenisierungsrührer (10 Hübe bei 700-900 Umdrehungen pro Minute), vorzugsweise in einem Eisbad, um die Probenwärme auszuschließen. </li><li> Das homogenisierte Gewebe (1 ml) in ein 15 ml-Röhrchen geben, das 6 ml 2 M Saccharose und 2,5 ml 0,1 mM CaCl 2 bei 4 ° C enthält. Mischen Sie langsam durch Umkehren der Röhre. Anmerkung: Die Zugabe von Calcium ist wesentlich für die Aufrechterhaltung der adhäsiven Wechselwirkungen zwischen Organellen und damit zur Erhaltung der Struktur der verschiedenen &quot;Dichten&quot;. </li><li> Die Lösung wird in ein 12-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und langsam 2,5 ml 1 M Saccharose / 0,1 mM CaCl 2 auf die Oberseite jedes Röhrchens gegeben, um den Saccharosegradienten zu bilden. Hinweis: Beschriftung der Position oF die Gradientenschnittstelle auf dem Zentrifugenröhrchen mit einer permanenten Markierung. </li><li> Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 3 h bei 100.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge. Füllen Sie den Rotor vollständig mit allen Stahlträgern aus (ggf. leer). </li><li> Verwerfe die oste Schicht, die Myelin enthält. Mit einer Pasteurpipette den weißen Ring zwischen der 1,25-M- und 1-M-Saccharose-Interphase entsprechend der Synaptosomenfraktion sammeln. </li><li> Verdünnen Sie die Synaptosomen mit 9X ihr Volumen mit IB in einem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wiegen und Ausgleichen der Zentrifugenröhrchen mit IB-Lösung in ihren entsprechenden Stahlträgern und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Die Röhrchen für 30 min bei 15.000 x g und 4 ° C mit einer Schwenkschaufelrotorzentrifuge zentrifugieren. </li><li> Den Überstand verwerfen und thE-Pellet mit 1,1 ml IB-Lösung. 100 μl dieser synaptosomalen Lösung sammeln und 5 min bei 11.000 x g und 4 ºC zentrifugieren. </li><li> Das synaptosomale Pellet in 5% igem Natriumdodecylsulfat (SDS) resuspendieren und diese Probe bei -20 ºC aufbewahren. Anmerkung: Diese Probe entspricht der gesamten Synaptosomenfraktion für die weitere Western-Blot-Analyse. Die verbleibende synaptosomale Fraktion (~ 1 ml) kann entweder bei -20 ºC bis zur Verwendung oder zur nachfolgenden subynaptischen Fraktionierung eingefroren werden. Die Synaptosomen oder gereinigten Synapsen repräsentieren zwischen 1 und 2% des gesamten Hippocampusvolumens 12 . </li></ol> 2. Vor-, Post- und Extrasynaptische Isolation <ol><li> 2x frischen Solubilisierungspuffer, pH 6,0, vorbereiten; 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0; Solubilisierungspuffer, pH 8,0; Und 0,1 mM CaCl &amp; sub2 ; (siehe Tabelle 1 ). Chill die Lösungen auf Eis. Hinweis: Der pH-Wert dieser Lösungen sollte genau seinY angepasst, um eine gute subsynaptische Fraktionierung zu erreichen. </li><li> Die 1-ml-resuspendierte synaptosomale Fraktion (siehe Schritt 1.12) mit 5 ml 0,1 mM CaCl 2 langsam verdünnen. </li><li> Füge das gleiche Volumen (5 ml) eiskaltes 2x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, hinzu und inkubiere für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis. Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 6,0 alle Plasmamembranproteine ​​löst, bewahrt es Proteine ​​innerhalb der synaptischen Kontakte oder Übergänge ( dh vor- und postsynaptische Strukturen) 4 . </li><li> Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit äquivalenten Volumina von 0,1 mM CaCl 2 und 2x Solubilisierungspufferlösung, pH 6,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlträger und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge. Der entstehende Überstand stellt die extrasynaptische Fraktion dar,Und das Pellet entspricht den synaptischen Übergängen ( dh vor- und postsynaptischen Fraktionen). </li><li> Konzentrieren Sie den Überstand, der die extrasynaptische Fraktion enthält, auf ein endgültiges 200 &amp; mgr; l Volumen unter Verwendung eines 15 ml 10 k Filterrohrs, das bei 4000 × g und 4 ºC zentrifugiert wurde. </li><li> Die resultierende konzentrierte extrasynaptische Fraktion (200 ul) mit 5 Volumina (1 ml) vorgekühltem (-20ºC) Aceton über Nacht bei -20ºC abfließen. </li><li> Am nächsten Tag wird die extrasynaptische Fraktion für 30 min bei 18.000 x g und -15 ° C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation den Acetonüberstand verwerfen und das Pellet trocknen, um jegliche Spur von Aceton zu entfernen. </li><li> Schließlich wird das Pellet, das die extrasynaptischen Proteine ​​enthält, mit 200 &amp; mgr; l 5% SDS resuspendiert. Sonde das Pellet, falls erforderlich. </li><li> Ohne sie zu stören, das Pellet sorgfältig mit den vor- und postsynaptischen Fraktionen mit 2 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 6,0, abwaschen. Verwerfe den Puffer </li><li> ResuspendierenDas Pellet mit 10 ml 1x Solubilisierungspuffer, pH 8,0, unter Verwendung einer Glaspasteurpipette. Anmerkung: Während 1% Triton X-100 bei pH 8,0 die präsynaptische Spezialisierung löst, bewahrt es die unlösliche postsynaptische Dichte 4 . </li><li> Inkubieren Sie die Suspension für 50 min auf Eis unter hohem Rühren in einem Becher auf Eis. </li><li> Die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen geben. Wiegen und Äquilibrieren der Röhrchen mit 1x Solubilisierungspufferlösung, pH 8,0, innerhalb ihrer entsprechenden Stahlstützen und mit ihren Verschlussdeckeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 40.000 x g und 4 ° C mit einer schwenkbaren Eimer-Rotor-Zentrifuge; Der resultierende Überstand entspricht der präsynaptischen Fraktion und dem Pellet der postsynaptischen Fraktion. </li><li> Verarbeiten Sie den Überstand, der die präsynaptische Fraktion enthält, wie in den Schritten 2.6-2.9 beschrieben. </li><li> Resuspendieren des Pellets mit postsynaptischen Fraktion mit 200 μl 5% SDS. Sonde das Pellet, ichF erforderlich </li></ol> 3. Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot, um die Membranfraktionierung zu validieren <ol><li> Bestimmen Sie die Menge an Protein in jeder Fraktion ( dh die Gesamt-, Extra-, Pre- und Post-Synaptic-Fraktionen) unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Protein-Assays. </li><li> Nehmen Sie 20 μg Protein aus jeder Fraktion und verdünnen Sie es auf ein Endvolumen von 50 μl in SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenpuffer. 5 min bei 100 ºC kochen. </li><li> Trennen Sie die Proteine ​​durch SDS-PAGE-Elektrophorese 10%, mit einem 4% konzentrierenden Gel unter reduzierenden Bedingungen. Elektrophorese bei konstanter Spannung von 80 V, bis der Farbstoff in das untere Gel eintritt und dann die Spannung auf 120 V erhöht. </li><li> Übertragen Sie die Proteine ​​auf eine PVDF-Membran und blockieren Sie mit IB-Blockierlösung für 45 min bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Inkubieren der Membran über Nacht bei 4 ºC mit dem angegebenen primären Antikörper ( dh anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, Anti-Synaptophysin oder Anti-GPR37) verdünnt in IB-Blockierungslösung unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen primären Antikörper zu eliminieren. </li><li> Inkubieren mit dem angegebenen sekundären Antikörper für 90 min in dunklen Bedingungen bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 10 min) mit IB-Waschlösung, um ungebundenen sekundären Antikörper zu eliminieren. </li><li> Inkubieren Sie die Membran mit chemilumineszierendem Substrat (bereiten Sie die Mischung unter dunklen Bedingungen vor und folgen Sie dem 1: 1-Anteil der Lösung A und B, die vom Hersteller bereitgestellt wird). </li><li> Analysieren Sie die Membran in einer Chemilumineszenz-Detektionsvorrichtung. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das hier vorgestellte Protokoll stellt ein leistungsfähiges biochemisches Werkzeug für die Untersuchung der subsynaptischen Verteilung spezifischer Proteine in jeder Gehirnregion dar. Es gibt jedoch einige Nachteile, die der Technik inhärent sind und die es verdienen, hier hervorgehoben zu werden. Zum Beispiel ist eine der Haupteinschränkungen die relativ große Menge an Gewebe, die benötigt wird, um eine angemessene Menge an Protein zu reinigen, um die Immunoblot-Analyse aller subsynaptischen Fraktionen durchzuführen. Di...

Die synaptische Übertragung beruht auf der physischen Integrität der Synapse, ein Konzept, das schon 1897 von Foster und Sherrington 1 vorgesehen war. Daher ist das Verständnis der Verteilung der Schlüsselneurotransmission-Komponenten ( z. B. Ionenkanäle, Rezeptoren usw. ) unerlässlich, um die synaptische Funktion sowohl bei normalen als auch bei pathologischen Zuständen aufzuklären. Die Elektronenmikroskopie (EM) hat enorm zur aktuellen ultrastrukturellen Vorstellung von Prototypen des zentralen Nervensystems (ZNS) beigetragen. Auf diese Weise hat EM die Unterschiede zwischen prä- und postsynaptischen Dichten, die durch eine Spalte mit einem ziemlich gleichmäßigen Abstand (~ 25 nm) getrennt sind, fein festgelegt. Interessanterweise weist die postsynaptische Apparatur eine relativ kontinuierliche, elektronendichte Verdickung unterhalb ihrer Plasmamembran, die sogenannte postsynaptische Dichte oder PSD 2 auf . Umgekehrt, bei der präsynaptischen Apparatur, eine bemerkenswerteE diskontinuierliches Cytomatrix-Netzwerk ist gerade unterhalb der Plasmamembran angeordnet, was für die Ausrichtung und das Andocken von synaptischen Vesikeln auf die aktive Zone der Plasmamembran wesentlich ist. Daher stellt EM den goldenen experimentellen Ansatz dar, um die Verteilung von Proteinen innerhalb strukturell konservierter ZNS-Synapsen zu untersuchen. Jedoch ist die Information, die durch Elektronenmikrographien bereitgestellt wird, statisch. In der Tat zeigen akkumulierende Beweise, dass in vivo Synapsen extrem dynamisch sind und so dramatische strukturelle Veränderungen bei anhaltender synaptischer Übertragung erleben. Darüber hinaus können sich die Morphologie und Zusammensetzung der Synapsen in verschiedenen ZNS-Regionen und bei der Entwicklung, Reifung, Alterung und der Entwicklung neuropathologischer Zustände ändern. Insgesamt stellt ein Protokoll zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten in physiologischen Zuständen gehören, ein wertvolles Werkzeug für eine umfassendere Untersuchung der synaptischen Funktion dar. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier beschreiben wir diese Art von komplementärem experimentellen Ansatz, der die präparative biochemische Anreicherung der verschiedenen synaptischen Membranfächer ermöglicht - nämlich extra-, vor- und postsynaptische Membrandomänen. Dieses Membranfraktionierungsverfahren, das zuerst von Philips et al . (2001) 4 beruht auf einer pH-Verschiebung, die die in der prä- und postsynaptischen Apparatur auftretenden adhäsiven Wechselwirkungen schwächt. Zunächst ist es durch die Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei pH 6,0 möglich, den Adhäsionsübergang zu erkennen, der die prä- und postsynaptische Apparatur hält und der von der extrasynaptischen Membrandomäne gehalten wird, die solubilisiert ist und somit aus den synaptischen Kontakten extrahiert werden kann. Anschließend schwächt die Erhöhung des pH-Werts von 6,0 auf 8,0 in Gegenwart von milden Reinigungsmitteln die Festigkeit des adhärenten Übergangs, der die präsynaptische aktive Zone fest an die postsynaptische Dichte gebunden hält. Daher ist das präsynaptische Fach soLubilisiert und kann von der postsynaptischen Dichte getrennt werden, die meistens erhalten bleibt, weil die Konzentration des verwendeten Waschmittels ihre Solubilisierung nicht begünstigt 4 . Interessanterweise kann die Fraktionierungseffizienz, eventuell höher als 90%, durch verschiedene subsynaptische Marker bestätigt werden: i ) synaptosomal assoziiertes Protein 25 (SNAP-25) aus der präsynaptischen aktiven Zone; Ii ) Synaptophysin aus der extrasynaptischen Fraktion ( dh außerhalb der aktiven Zone und einschließlich Mikrosomen); Und iii ) postsynaptisches Dichteprotein 95 (PSD-95), aus der postsynaptischen Dichte. Bemerkenswert ist, dass diese Hirnmembranfraktionierungsmethode erfolgreich eingesetzt wurde. Dementsprechend war es möglich, die subsynaptische Lokalisierung verschiedener Rezeptoren, wie alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren 5 , Adenosin-A 1 -Rezeptor (A 1 R) 6 präzise zu bestimmen ,Adenosin-A 2A -Rezeptor (A 2A R) 7 , Adenosintriphosphat (ATP) P2-Rezeptoren 8 , Nikotinacetylcholinrezeptor-Untereinheiten 9 und Parkinson-assoziierter Rezeptor GPR37 10 . Eine Reihe von Beschränkungen kann jedoch eine angemessene Beurteilung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins behindern. So beschreiben wir in diesem Verfahren nicht nur das gesamte Protokoll vollständig, sondern auch einige kritische Punkte, wie die relativ große Menge an benötigtem Gewebe, die geringe Proteinausbeute und die zwingende Anforderung, die Effizienz zu validieren Jede Trennung vor der Durchführung des definierten Experiments.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>, Pankreas, Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spanien</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spanien</td><td>2.112.211.210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Pankreas Qu&iacute; glimmer SL, Barcelona, Spanien</td><td>1.313.961.210</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Deutschland</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pankreas-Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spanien</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Pankreas Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spanien</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Fettfreie Trockenmilch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pankreasmilch Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spanien</td><td>1.216.591.211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pankreas Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spanien</td><td>1.314.941.210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pankreas Qu&iacute; mica SL, Barcelona, Spanien</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spanien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Anpassungsfähiger Homogenisator</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraklare Röhrchen (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Röhrchen sollten bei der Verwendung fast vollständig gefüllt werden, um ein Zusammenfallen durch Ultrazentrifugation zu verhindern.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spanien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Glaspasteur-Pippeten 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktwaage EK-610</td><td>A& D, Tokio, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemilumineszierendes Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Präzisionswaage</td><td>A& D, Tokio, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Selbstgemachter Antikörper gegen GPR37, hergestellt und validiert im Francisco Ciruela Labor.</td><td></td><td>Primäre Antikörper, die in einer Endkonzentration von 0,250 μm verwendet werden; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, Anti-PSD-95, Anti-Synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, Vereinigtes Königreich</td><td></td><td>Primärantikörper verdünnt 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Sekundärer Antikörper verdünnt 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Sekundärer Antikörper verdünnt im Verhältnis 1:30.000</td></tr></tbody></table>

gehirn membran fraktionierung: an<em&gt; ex vivo</em&gt; ansatz zur bewertung der subsynaptischen protein-lokalisierung

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Die Beurteilung der synaptischen Proteinzusammensetzung und -funktion stellt eine wichtige Herausforderung in der Neurowissenschaft dar. Allerdings ist es nicht einfach, die Neurotransmission, die in Synapsen auftritt, zu bewerten, da sie durch dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen und Phosphorylierungsereignisse stark reguliert wird. Dementsprechend ist es, wenn eine Methode verwendet wird, um synaptische Transmission zu studieren, ein wichtiges Ziel, diese vorübergehenden physiologischen Modifikationen zu bewahren. Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt. Mit anderen Worten beschreibt das Protokoll eine biochemische Methodik zur Durchführung der Proteinanreicherung aus präsynaptischen, postsynaptischen und extrasynaptischen Kompartimenten. Zuerst werden Synaptosomen oder synaptische Terminals aus Neuronen gewonnen, die alle synaptischen Kompartimente mit einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten enthalten. Bemerkenswert ist die Qualität dieser ersten synaptischen Membranvorbereitung cRituell Anschließend wird die Isolierung der verschiedenen subsynaptischen Kompartimente mit leichter Solubilisierung unter Verwendung von milden Reinigungsmitteln bei unterschiedlichen pH-Bedingungen erreicht. Dies ermöglicht eine Trennung durch Gradienten- und Isopycnic-Zentrifugationen. Schließlich wird die Proteinanreicherung an den verschiedenen subsynaptischen Kompartimenten ( dh vor-, post- und extrasynaptischen Membranfraktionen) mittels Immunoblotanalyse mittels gut charakterisierter synaptischer Proteinmarker ( dh SNAP-25, PSD-95 und Synaptophysin, ), So dass eine direkte Bewertung der synaptischen Verteilung eines bestimmten neuronalen Proteins ermöglicht wird.

Die beschriebene Methodik wurde weitgehend für die subsynaptische Analyse von neuronalen Proteinen im Allgemeinen und für die Isolierung und biochemische Charakterisierung der synaptischen Rezeptoren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 insbesondere verwendet. Interessanterweise zeigt das hier dargestellte repräsentative Ergebnis die Nützlichkei...

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteine, die verschiedenen synaptischen Kompartimenten des Mausgehirns angehören, zu isolieren. Die Beschreibung der Verteilung kinetischer Übertragungskomponenten ist entscheidend, um die synaptische Funktion sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen zu verstehen. Immer mehr Belege zeigen, dass Synapsen in vivo äußerst dynamisch sind und dramatische strukturelle Veränderungen durchlaufen können, die die Aufrechterhaltung der synaptischen Transmission ermöglichen.Synapsen wurden klassischerweise mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Diese Membranfraktionierungsmethode basiert auf einer Kombination aus Laser-Ablation unter Verwendung milder Detergenzien bei unterschiedlichen pH-Bedingungen, gefolgt von einer schnellen Sekundenzentrifugation. Kurz gesagt, wird das Maushirn entnommen und der Hippocampus sorgfältig in einer gut gekühlten Schale auf zerstoßenem Eis präpariert.Die Hippocampi werden in ein Potter-Elvehjem-Glasröhrchen mit eiskaltem Isolationspuffer gegeben. Anschließend wird das gesammelte Gewebe mit einem Homogenisier-Stabmixer homogenisiert. Danach wird das homogenisierte Gewebe mit einer Saccharose-Calcium-Lösung vermischt.Anschließend wird der Gewebeextrakt mit einer konzentrierten Saccharose-Calcium-Lösung überschichtet. Die Proben werden dann zentrifugiert. Der Membrananteil, der Synaptosomen enthält, ist leicht als dichter Ring erkennbar, der an der Grenzfläche der Saccharoselösung schwimmt.Anschließend wird die Isolierung der verschiedenen subsynaptischen Kompartimente, nämlich der extrasynaptischen, prä- und postsynaptischen Fraktionen, durch eine Kombination aus leichter Lösung mit milden Detergenzien unter differenzierenden pH-Bedingungen erreicht. Abschließend wird die Proteinanreicherung in den verschiedenen Kompartimenten mittels Immunblot-Analyse überprüft. Bereiten Sie am Tag des Experiments frische Lösungen vor und kühlen Sie diese auf Eis.Legen Sie das Gehirn in eine auf zerkleinertem Eis liegende Petrischale mit 10 Milliliter eiskaltem Isolierungspuffer. Dissezieren Sie vorsichtig den Hippocampus mit Hilfe einer Pinzette. Überführen Sie die Hippocampi in ein fünf Milliliter fassendes Glasgefäß nach Potter-Elvehjem, das ein Milliliter eiskalten Isolierungspuffer enthält.Homogenisieren Sie anschließend mit einem Homogenisier-Stabmixer. Überführen Sie das homogenisierte Gewebe in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das die Saccharose- und Calciumlösung enthält, und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens. Geben Sie die Lösung in ein ultraklares Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie auf jedes Röhrchen 2,5 Milliliter Saccharose mit Calciumchlorid.Kalibrieren Sie die Röhrchen mit Isolationspufferlösung und zentrifugieren Sie drei Stunden bei 100.000 ×g und vier Grad in einer Ultrazentrifuge. Entfernen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Stahlhalterung der Zentrifuge und identifizieren Sie den dichten Ring an der Saccharose-Grenzfläche, der die Synaptosomen enthält. Entsorgen Sie die oberste Schicht mithilfe einer blauen Pipettenspitze.Mit einer Pasteurpipette das dichte Ringband, das die Synaptosomen-Fraktionen enth&auml;lt, sammeln und in ein ultraklares Zentrifugenr&ouml;hrchen &uuml;berf&uuml;hren; das R&ouml;hrchen auf zerkleinertem Eis lagern. Die Synaptosomen mit dem Neunfachen Volumen eiskaltem Isolationspuffer verd&uuml;nnen und 30 Minuten bei 15.000 &times; g und vier Grad zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das R&ouml;hrchen entfernen.Entfernen Sie den Überstand. Es sollte ein Pellet mit Synaptosomen sichtbar sein. Resuspendieren Sie das Pellet in 1,1 Milliliter Isolierungspuffer und bewahren Sie es für den nächsten Schritt auf zerkleinertem Eis auf.Stellen Sie frische Lösungen mit dem entsprechenden pH-Wert bei vier Grad her. Geben Sie langsam ein Milliliter des resuspendierten synaptosomalen Pellets in fünf Milliliter Calciumchlorid in einem Becher auf Eis unter kontinuierlicher Rührung. Anschließend fünf Milliliter konzentrierter Solubilisierungspuffer pH 6.Nach 50 Minuten auf Eis die Lösung in ein ultraklares Zentrifugenröhrchen überführen und 30 Minuten bei vier Grad mit 40.000 G zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Röhrchen entfernen. Ein Pellet, das die prä- und postsynaptische Fraktion enthält, sollte sichtbar sein.Das Überstand, der die extrasynaptische Fraktion enthält, wird in einem 15-Milliliter-Konzentrierrohr gesammelt. Vorsichtig das Pellet mit zwei Millilitern Solubilisierungspuffer, pH 6, waschen. Das Pellet dabei nicht stören und den Puffer verwerfen.Geben Sie 10 Milliliter Puffer mit pH 8 zum Pellet und lösen Sie ihn mit Hilfe einer Pasteurpipette auf. Inkubieren Sie ein Becherglas unter ständigem Rühren 50 Minuten lang auf Eis. Überführen Sie die Lösung in ein ultraklares Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 40.000 × g und 4 °C.Nach der Zentrifugation das Röhrchen entnehmen. Es sollte ein Pellet vorliegen, das die postsynaptische Fraktion enthält. Das Überstand, der die präsynaptische Fraktion enthält, wird in einem 15-Milliliter-Konzentrierrohr gesammelt.Das Pellet, das die postsynaptische Fraktion enthält, wird mit 200 µL STS-Lösung resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wird sonifiziert. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in jeder Fraktion mithilfe eines Proteinbestimmungsassays. Entnehmen Sie 20 Mikrogramm Protein aus jeder Fraktion und behandeln Sie es mit STS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Probenpuffer. Trennen Sie die Proteine mittels STS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und analysieren Sie sie durch Immunoblot. GPR37 ist ein weiterer anspruchsvoller Proteinglobalrezeptor, der hauptsächlich im Gehirn von Nagetieren vorkommt.Da seine Funktion bei verschiedenen Pathologien wie Morbus Parkinson oder schwerer Depression beeinträchtigt ist, bleibt seine Funktion abnorm. Die Untersuchung des Vorkommens dieses Rezeptors in Synapsen kann dazu beitragen, seine Rolle im zentralen Nervensystem aufzuklären. Synaptosomen aus Wildtyp- und GPR37-Knockout-Mäusen wurden isoliert und anschließend fraktioniert.Die Reinheit jeder subsynaptischen Kompartiment wurde durch die Anreicherung der jeweiligen synaptischen Marker gewährleistet. Der extrasynaptische vesikuläre Marker Synaptophysin war in diesem extrasynaptischen Fraktion angereichert. Das Protein BSD 95, ein klassischer Marker der postsynaptischen Dichte, war in der entsprechenden postsynaptischen Fraktion angereichert.Schließlich wurde die Reinheit der präsynaptischen Fraktion durch das Vorhandensein von SNAP-25, einem Marker der präsynaptischen aktiven Zone, bestätigt. Interessanterweise war die Immunreaktivität von GPR37 zwar in der extrasynaptischen Fraktion stärker ausgeprägt, zeigte aber dennoch eine signifikante Präferenz für die postsynaptische gegenüber der präsynaptischen Fraktion. Die Bestimmung der subsynaptischen Proteinzusammensetzung stellt eine wichtige Herausforderung in der Neurowissenschaft dar.Dies ist jedoch keine einfache Aufgabe, da sie stark durch Protein-Protein-Interaktionsbänder reguliert wird. Hier stellen wir ein Protokoll zur Gehirnmembran-Fraktionierung vor, das ein robustes Verfahren darstellt, um Proteine aus verschiedenen synaptischen Kompartimenten auszuwählen. Mit anderen Worten, es wird Ihre chemische Technologie beschrieben, um eine Anreicherung von Proteinen aus präsynaptischen, postsynaptischen und extrasynaptischen Kompartimenten durchzuführen.Lebewohl und viel Erfolg bei Ihren Fraktionierungsexperimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Lokalisation und Verteilung von Proteinen liefern wichtige Informationen für das Verständnis ihrer zellulären Funktionen. Die überlegene Ortsauflösung der Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung eines bestimmten Antigens nach Immunohistochemie bestimmen. Für Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), Erhaltung strukturelle Integrität während Antigenität war besonders schwierig im EM-Studien. Hier nehmen wir ein Verfahren, das verwendet wurde, um Strukturen und...

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Wir beschreiben Verfahren zur Verarbeitung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochauflösende Elektronenmikrogramme für die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals zu erhalten. Die mit diesen Methoden gewonnenen Mikrographen können auch verwendet werden, um die Morphologie einer Reihe anderer zellulärer Komponenten und deren dimensionale strukturelle Zusammenhänge zu untersuchen.

Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die CryoAPEX-Methode, bei der ein APEX2-markiertes Membranprotein durch Transmissionselektronenmikroskopie innerhalb optimal konservierter Zell-Ultrastruktur lokalisiert werden kann.

Die CryoAPEX-Methode zur Elektronenmikroskopie-Analyse der Membranproteinlokalisierung in ultrastrukturell konservierten Zellen

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Dieses Protokoll stellt eine robuste, detaillierte Methode dar, um hochreine Synaptosomen, synaptische Vesikel und andere synaptische Fraktionen aus dem Mausgehirn zu erhalten. Diese Methode ermöglicht die Bewertung synaptischer Prozesse, einschließlich der biochemischen Analyse der Proteinlokalisation und -funktion mit kompartimentärer Auflösung.

Subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung synaptischer Komponenten aus dem murinen Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

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Gehirn Membran Fraktionierung: An

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