Flash-and-Freeze-: eine neuartige Technik Membrandynamik mit Elektronenmikroskopie zu erfassen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Membrandynamik durch Elektronenmikroskopie nach Induktion der neuronalen Aktivität mittels Optogenetik zu erfassen und dann die Zellen zu definierten Zeitpunkten nach der Stimulation einzufrieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Neurowissenschaften und der Zellbiologie über die Mechanismen des synaptischen Vesikelrecyclings zu beantworten und möglicherweise auch auf einer sehr schnellen Zeitskala zu modellieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass morphologische Veränderungen innerhalb einer Zelle mit Hilfe der Elektronenmikroskopie auf einer Zeitskala von Millisekunden sichtbar gemacht werden können.

Das Verfahren wird von Shuo Li, einem Doktoranden, und Sumana Raychaudhuri, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin, demonstriert. Beide aus meinem Labor. Beschriften Sie vor der Zubereitung des Fixiermittels zwei Milliliter kryogene Dateien mit einem Bleistift entsprechend ihrer Probennummer.

Kombinieren Sie dann alle Fixierreagenzien und aliquotieren Sie einen Milliliter Volumen des Fixiermittels in jede Durchstechflasche. Tauchen Sie nach dem Verschließen der Röhrchen sofort Fixiermittel in flüssigen Stickstoff und lagern Sie die Fläschchen in einer geschlossenen Styroporbox. Befüllen Sie anschließend eine automatisierte freie Substitutionseinheit und einen Hochdruckgefrierschrank mit flüssigem Stickstoff.

Stellen Sie dann ein kleines Gefäß mit Aceton in die Probenkammer der freien Substitutionseinheit und warten Sie, bis die Temperatur der Substitutionseinheit minus 90 Grad Celsius erreicht. Um das Lichtstimulationsprotokoll zu programmieren, klicken Sie im Lichtstimulationsfenster des Touchscreen-Monitors auf Bearbeiten. Es öffnet sich ein weiteres Fenster.

Geben Sie 15 Sekunden für die Dunkelphase ein, 100 Millisekunden für die Periode, 10 Millisekunden für den Puls und eine für die Anzahl der Perioden für einen einzelnen 10-Millisekunden-Stimulus.

Vergewissern Sie sich auf dem Hauptbildschirm, dass das Kontrollkästchen für die Lichtstimulation aktiviert ist, und klicken Sie auf Probenspeicherung und dann auf Bearbeiten. Verwenden Sie im neuen Fenster die Plus- oder Minus-Taste, um zwei auszuwählen, um zwei Proben in jedem Kanal zu lagern, und bestätigen Sie, dass die Option Lagerung von flüssigem Stickstoff aktiviert ausgewählt ist. Platzieren Sie nun unter einem Stereomikroskop eine Saphirscheibe mit der Zellseite nach oben in der Vertiefung einer mittleren schwarzen Platte.

Gefolgt von einem 100 Mikron Spacer-Ring. Tauchen Sie eine Seite einer leeren Saphirscheibe in vorgewärmte Kochsalzlösung und legen Sie die Scheibe mit der Kochsalzlösung nach unten über den Abstandsring. Platzieren Sie einen weiteren 100 Mikron Abstandsring.

Und einen 400-Mikron-Abstandsring auf der letzten Saphirscheibe und verwenden Sie Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Achten Sie beim Halten der Proben darauf, dass Sie keine Luftblasen zwischen den Saphirscheiben einschließen. Platzieren Sie dann die gesamte Baugruppe zwischen den beiden transparenten Halbzylindern und schließen Sie die obere rote Abdeckung, um den Gefriervorgang einzuleiten.

Die rote Abdeckung blendet automatisch wieder ein, sobald der Gefriervorgang abgeschlossen ist. Wenn alle Proben eingefroren sind, öffnen Sie die Tür zum Lagerdewar und übertragen Sie den Dewar auf den Tisch. Übertragen Sie die Probenkammer aus dem Lagerdewar in eine spezielle Probenschale, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist.

Entriegeln Sie den Knopf, um den Probenbecher zu lösen. Verwenden Sie dann eine Pinzette mit flüssigstickstoffgekühlten Spitzen, um die transparenten Halbzylinder aus dem Probenbecher zu entfernen. Und geben Sie die mittleren schwarzen Teller vorsichtig in einen kleinen Becher mit flüssigem Stickstoff.

Achten Sie darauf, die gefrorenen Proben immer unter flüssigem Stickstoff aufzubewahren und die Proben immer mit einer vorgekühlten Pinzette zu behandeln. Kühlen Sie die Pinzette erneut vor und geben Sie die erste mittlere Platte schnell auf das vorgekühlte Aceton. Schütteln und klopfen Sie die Platte leicht, um die Saphirscheibe von der Platte zu trennen.

Legen Sie dann eine offene kryogene Datei mit dem Fixiermittel in eine Probenkammer in der Substitutionseinheit. Übertragen Sie die Saphirscheibe in das Fläschchen. Und verschließen Sie das Fläschchen sofort.

Wenn alle Proben übertragen wurden, stellen Sie die entsprechenden Parameter des freien Substitutionsprogramms ein und starten Sie das Programm. Am Ende des freien Substitutionsprogramms übertragen Sie die kryogenen Dateien mit Handschuhen aus der Probenkammer in eine chemische Haube und fügen Sie jedem Fläschchen mit einer Pipette Aceton bei Raumtemperatur hinzu. Ersetzen Sie die Waschmittel in jeder Durchstechflasche vier- bis sechsmal über einen Zeitraum von ein bis zwei Stunden durch frisches Aceton.

Geben Sie dann frisch zubereitetes 30%iges Epoxidharz in jedes Fläschchen für eine zwei- bis dreistündige Inkubation bei Raumtemperatur in einem Orbitalschüttler bei 120 U/min. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das 30%ige Epoxidharz durch 70%Epoxidharz für eine drei- bis vierstündige Inkubation auf dem Orbitalschüttler. Übertragen Sie dann mit einer Pinzette jede Scheibe mit der Zellseite nach oben auf die Kappe einer Einbettkapsel und fügen Sie 90 % Epoxidharz zu den Scheiben hinzu, um eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius

Übertragen Sie am nächsten Morgen jede Saphirscheibe auf die Kappe einer neuen Einbettkapsel und füllen Sie die Kappe mit frisch vorbereitetem 100%igem Epoxidharz. Nach der letzten Inkubation mit 100 % Epoxidharz polymerisieren Sie die Proben 48 Stunden lang in einem 60 Grad Celsius heißen Ofen. Wenn die Proben polymerisiert sind, legen Sie die erste Probe kopfüber auf das Stereomikroskop, so dass sich die Saphirscheibe oben auf dem Harzblock befindet, und entfernen Sie mit einer Rasierklinge eine dünne Schicht Harz von der Oberseite der Probe.

Schneide dann mit der Rasierklinge eine flache Linie entlang des Randes der Scheibe, um die Saphirscheibe vom Epoxidharz zu trennen. Tauchen Sie die Scheibe etwa 10 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff, um die Scheibe vom Rest des Harzes zu trennen. Übertragen Sie das Harz unter ein Präpariermikroskop und kleben Sie die Probe auf den Mikroskoptisch.

Suchen Sie mit einer vier- bis zehnfachen Vergrößerung einen Bereich mit Zellen und schneiden Sie mit einer zweischneidigen Rasierklinge einen zwei mal zwei Millimeter großen Bereich um den interessierenden Bereich herum. Montieren Sie dann die Zellen mit Sekundenkleber auf einen zylindrischen Dummy-Block aus Epoxidharz und inkubieren Sie den Block eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius. Nach dem Schneiden auf einem Ultramikrotom übertragen Sie die Proben in ein Transmissionselektronenmikroskop, um sie mit einer 930.000-fachen Vergrößerung abzubilden.

In diesem Bild ist die synaptische Vesikelfusion durch Exozytose zu sehen, die 15 Millisekunden nach Lichtbeginn in der aktiven Zone einer präsynaptischen Membran in einem Hippocampus-Neuron der Maus aufgezeichnet wurde. 100 Millisekunden nach Lichtbeginn ist eine endozytotische Grube in der Nähe der aktiven Zone zu sehen, was eine ultraschnelle Endozytose durch die Nervenzelle verdeutlicht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben mit Flash- und Freeze-Experimenten verarbeitet.

Denken Sie daran, dass die Arbeit mit Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid und flüssigem Stickstoff sehr gefährlich sein kann, und stellen Sie daher sicher, dass Sie Schutzkleidung tragen. Sobald Sie diese Prozeduren beherrschen, kann der Einfrierteil dieser Verfahren in ein paar Stunden für 12 Proben durchgeführt werden, aber der Rest der Verfahren, einschließlich Bildgebung und Bildanalyse, kann bis zu Tage, Wochen oder sogar Monate dauern, und so kann es sich um sehr lange Verfahren handeln. Wenn Sie Proteine lokalisieren oder ihre Dynamik visualisieren, können Sie auch verschiedene Protokolle verwenden, um die Antigenität oder Perlmutt von Perlglanzproteinen zu erhalten und ihre Dynamik mit diesen Techniken zu visualisieren.