Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Analyse der Proteinzusammensetzung der extrazellulären Matrix, einschließlich der Identifizierung von Glykosylierungsstellen und der Charakterisierung der Zusammensetzung von Glykanformen in kardiovaskulären Geweben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Prozess der Gewebefibrose zu beantworten, z. B. wie sich eine strukturelle Matrixglykosostlation auf die Gewebefibrose bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen auswirkt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Gegensatz zu früheren Protokollen, die Gesamtänderungen der Glykosylierung analysieren, die Charakterisierung der Glykosylierung an bestimmten Stellen eines Strukturmatrixproteins ermöglicht und damit ein Werkzeug für gezieltere mechanistische Folgestudien bietet.

Die Verfahren werden von Dr. Marika Fava und Frau Ferheen Baig aus unserem Labor vorgeführt. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle Extraktionspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes zerkleinerst du mit einem Skalpell 20 bis 50 Milligramm Taschentuch in drei oder vier kleinere Stücke von etwa zwei Millimetern Größe.

Geben Sie das gewürfelte Taschentuch in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 500 Mikroliter eiskaltes PBS hinzu. Waschen Sie das Taschentuch fünfmal mit 500 Mikrolitern PBS pro Waschgang, um die Blutkontamination zu minimieren. Füllen Sie die gewaschenen Proben in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Schraubverschluss und fügen Sie ein Volumen Natriumchloridpuffer hinzu, das das 10-fache des Gewebegewichts beträgt.

Eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei minimaler Geschwindigkeit vortexen. Übertragen Sie dann den Extrakt in neue Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 16.000 mal G bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die entstandenen Gewebepellets kurz mit frischem Natriumchloridpuffer.

Danach fügen Sie ein Volumen SDS-Puffer hinzu, das das 10-fache des Gewebegewichts beträgt, und wirbeln Sie 16 Stunden lang bei Raumtemperatur bei minimaler Geschwindigkeit vortexen. Übertragen Sie den Extrakt in neue Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 16.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die entstandenen Pellets mit doppelt destilliertem Wasser.

Fügen Sie ein Volumen Guanidinhydrochloridpuffer hinzu, das das Fünffache des Gewebegewichts beträgt, und wirbeln Sie 72 Stunden lang bei Raumtemperatur bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Den resultierenden Extrakt in neue Röhrchen umfüllen und 10 Minuten bei vier Grad Celsius bei 16.000 G zentrifugieren. Nach der Quantifizierung des Proteins aliquotieren Sie 10 Mikrogramm in ein neues Röhrchen für jede Probe zur Beurteilung der Belegung der Glykosylierungsstelle und 50 Mikrogramm in ein separates Röhrchen für die direkte Glykopeptidanalyse.

Fügen Sie jeweils das 10-fache Volumen Ethanol hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 20 Grad Celsius. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 Mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, das ausgefällte Pellet nicht zu stören.

Anschließend trocknen Sie die Pellets mit einem Vakuumkonzentrator 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie 10 Mikroliter vorbereiteten Deglykosylierungspuffer zu jeder Probe. Verpacken Sie die Probenröhrchen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius in einem 45-Grad-Winkel.

Erhöhen Sie danach die Temperatur auf 37 Grad Celsius und inkubieren Sie 36 Stunden lang unter leichtem Rühren. Nach dem Zentrifugieren bei 16.000 G für eine Minute verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator bei Raumtemperatur für 45 Minuten, um das Wasser zu verdampfen. Die getrockneten Proben werden mit 10 Mikrolitern O-18-markiertem Wasser resuspendiert, das 50 Einheiten pro Milliliter PNGase F enthält. 36 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter ständigem Rühren inkubieren, dann für alle Proben einen Trypsinaufschluss in Lösung durchführen und mit der C-18-Reinigung fortfahren.

Geben Sie zunächst 200 Mikroliter Methanol in jede Vertiefung der C-18-Spinplatte, um das Harz zu aktivieren. Eine Minute lang bei 1.000 mal G zentrifugieren. Geben Sie dann 200 Mikroliter 80 % ACN und 0,1 % TFA in Wasser in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1.000 mal G.

Geben Sie anschließend 200 Mikroliter einer Lösung, die 1 %ACN und 0,1 % TFA in Wasser enthält, in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1.000 mal G. Wiederholen Sie die Zugabe dieser Lösung und zentrifugieren Sie zweimal. Laden Sie danach die Proben in die Vertiefungen der Spin-Platte und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1500 mal G. Füllen Sie den Durchfluss wieder auf und wiederholen Sie die Zentrifugation.

Geben Sie dann 200 Mikroliter einer Lösung, die 1 % ACN und 0,1 % TFA in Wasser enthält, in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1500 mal G. Wiederholen Sie die Zugabe dieser Lösung und das Zentrifugieren zweimal. Geben Sie anschließend 170 Mikroliter einer Lösung, die 50 % ACN und 0,1 % TFA in Wasser enthält, in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1500 mal G.

Wiederholen Sie diese Zugabe und zentrifugieren Sie erneut. Verwenden Sie einen Vakuumkonzentrator, um die kombinierte Elue zwei Stunden lang bei Raumtemperatur zu trocknen. Lagern Sie die getrockneten Proben bis zur Verwendung bei 80 Grad Celsius.

Führen Sie danach eine flüssigkeitschromatographische Tandem-Massenspektrometrie-Analyse an den Proben durch, die für die Beurteilung der Glykositbelegung bestimmt sind. Bei Proben, die für die direkte Glykopeptidanalyse bestimmt sind, fahren Sie zunächst mit der standardmäßigen TMT-Nullmarkierung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Zu Beginn geben Sie zu je 10 Mikrolitern der nullmarkierten TMT-Probe 50 Mikroliter des bereitgestellten Bindungspuffers.

Dann aliquotieren Sie 50 Mikroliter homogener Glyko-Auffangharzsuspension in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 2500 mal G. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 60 Mikroliter der Probe und der Bindungspufferlösung in die Röhrchen mit den Harzpellets unter Verwendung einer Pipette zum Mischen. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und bei 1200 U/min rühren. Nach zweiminütiger Zentrifugation bei 2.000 mal G wird der Überstand in neue Röhrchen überführt.

Geben Sie danach 150 Mikroliter Waschpuffer in jedes Harzröhrchen und mischen Sie es mit der Pipette, um den Waschvorgang zu starten. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dabei bei 1200 U/min rühren. Nach dem Zentrifugieren bei 2500 mal G für zwei Minuten wird jeder Überstand in das entsprechende Überstandsvorratsröhrchen überführt, um die Wäsche abzuschließen.

Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zwei weitere Male. Als nächstes fügen Sie 75 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und mischen Sie mit einer Pipette. Fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren und dabei bei 1200 U/min rühren.

Zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 2500 μg und überführen Sie jeden Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 75 Mikroliter Elutionspuffer mit einer Pipette zum Mischen hinzu und wiederholen Sie dann die Inkubation und Zentrifugation der Proben. Übertragen Sie jede Elue in das entsprechende Röhrchen.

Nachdem Sie das kombinierte Eluat zwei Minuten lang bei 2500 G zentrifugiert haben, übertragen Sie jeden Überstand in ein neues Röhrchen, um eine vollständige Entfernung des Harzes sicherzustellen. Danach trocknen Sie die Elue mit einem Vakuumkonzentrator zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die getrockneten Glykopeptide in 15 Mikrolitern 2%ACN und 05%TFA in doppelt destilliertem Wasser.

Führen Sie dann eine massenspektrometrische Analyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie werden EZM-Proteine aus kardiovaskulärem Gewebe für die flüssigkeitschromatographische Tandem-Massenspektrometrie-Analyse der EZM-Zusammensetzung sowie für die indirekte und direkte Glykopeptidanalyse präpariert. Die Kernstrategie basiert auf sequentiellen Inkubationen mit Natriumchlorid, SDS und Guanadinhydrochlorid, gefolgt von einer indirekten oder direkten Glykopeptidanalyse.

Die Wirksamkeit der Extraktion wird an Bis-Tris-Acrylamid-Gelen mit Silberfärbung zur Visualisierung überwacht. Von den drei verwendeten Extrakten ist der Großteil der ECM-Glykoproteine in den Guanadinhydrochlorid-Aliquoten zu finden. ECM-Glykoproteine sind mit großen und repetitiven Glykosamin-Glykanketten sowie kurzen und vielfältigen N- und O-verknüpften Oligosacchariden dekoriert.

Die Wirksamkeit der Deglykosylierung zeigt sich bei der Zugabe von Enzymen, die glykosaminische Glykane verdauen, und von Enzymen, die auf kleinere N- und O-verknüpfte Oligosaccharide abzielen. Glykoproteine werden dann durch das Vorhandensein von deamidierten Asparaginen identifiziert, die mit Sauerstoff 18 in NXT- oder NXS-Folgesequenzen markiert sind. Hier ist ein repräsentatives HCD-Tandemmassenspektrum für ein Peptid von Decorin mit einem deamidierten Asparagin an Position zwei 11 dargestellt.

HCD-ETD-Fragmentierung wird dann verwendet, um den mit Glykoproteinen angereicherten ECM-Extrakt zu analysieren. Das ETD-Tandem-Massenspektrum ermöglicht die Charakterisierung der Glykanzusammensetzung. Sobald diese Technik gemeistert ist, sollte es etwa zwei bis drei Wochen dauern.

Diese Glykoproteomik ermöglicht es uns, die physiologische und pathologische Funktion der Fibrose nicht nur auf Veränderungen in der Proteomik, sondern auch auf die Zusammensetzung der Gedankenzucker zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proben für eine Studie zur Proteinglykosylierung durch Massenspektrometrie vorbereiten. Obwohl diese Methode Aufschluss über Herz-Kreislauf-Erkrankungen geben kann, kann sie auch auf andere Pathologien bei Volumenfibrose wie Atemwegserkrankungen oder Krebs angewendet werden.