Name: Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Lernen Sie die Präparation vitaler ventrikulärer Herzscheiben von Mäusen für elektrophysiologische Aufzeichnungen. Diese Methode ermöglicht Studien zur elektrischen Integration transplantierter Kardiomyozyten und Wirkungen kardioaktiver Substanzen.

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Wir erkennen die Unterstützung der Workshops und der Tierfazilität des Instituts für Neurophysiologie an. Diese Arbeit wurde von der Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune und der Deutschen Stiftung für Herzforschung unterstützt.

Die Tierhaltung muss den Richtlinien des örtlichen Tierschutzausschusses und der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments entsprechen. 1. Lösungen vorbereiten <ol><li> Die Lösung von Tyrode ohne Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, 2,3-Butandionmonoxim (BDM) 30. pH-Wert auf 7,4 einstellen Mit NaOH bei 4 ° C. </li><li> Die Lösung von Tyrode mit Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH bei 4 ° C einstellen. </li><li> 4% niedrigschmelzende Agarose vorbereiten: 0,6 g Schmelzklebstoff in 15 ml Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ geben . Die Mischung in einem Mikrowellenofen zweimal bei 750 W für 10-15 s erhitzen, bis die Agarose aufgelöst ist. Halten Sie die Lösung bei einer konstanten Temperatur von 37 &amp;# 176, C und rühren kontinuierlich. </li><li> Halten Sie Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Serum bei 37 ° C mit Carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ) geblasen. </li></ol> 2. Bereiten Sie das Mikrotom vor <ol><li> Schalte das Mikrotom ein. </li><li> Füllen Sie die äußere Mikrotomkammer mit Eis. </li><li> Füllen Sie die innere Mikrotomkammer mit eiskalter Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ und kontinuierlich die Lösung mit 100% O 2 an . </li><li> Legen Sie eine Stahlklinge in den Messerhalter des Mikrotoms. </li></ol> 3. Maus Herzisolation <ol><li> 2500 U Heparin subkutan injizieren Warte 15 min. </li><li> Das Tier durch zervikale Versetzung opfern </li><li> Öffne die truhe durch sternotomie. </li><li> Sorgfältig das Perikard mit einer kleinen Schere und einer Pinzette # 5 sezieren. </li><li> Setzen Sie eine Kanüle in die aufsteigende Aorta ein und benennen Sie die Koronararterien in situ mit eiskaltem TyrodeLösung ohne Ca 2+ bis das übrige Blut entfernt wird. </li><li> Vorspeisen Sie das Herz mit einer Pinzette und einer Schere und überträgt das Herz in eiskaltes Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ . </li><li> Trennen Sie die Vorhöfe von den Ventrikeln mit einem Skalpell oder einer Schere. </li></ol> 4. Einbettung der Ventrikel in 4% niedrigschmelzende Agarose <ol><li> Legen Sie die Ventrikel mit der Spitze nach oben in die Agarose-Form (Abbildung 1 ). Legen Sie den Stift in die Mitte der Form in die linke Kammerkammer. </li><li> Füllen Sie die Form mit 4% niedrigschmelzender Agarose bei 37 ° C, bis das Herz vollständig bedeckt ist. </li><li> Legen Sie die Form auf Eis für eine schnellere Aushärtung der Agarose, die das Schwimmen des Gewebes verhindert. </li><li> Entfernen Sie den Agaroseblock, der die Ventrikel enthält, aus der Form mit einem Skalpell. </li><li> Drehen Sie den Block umgedreht und füllen Sie die ventrikulären Kammern und die Lücke auf der Rückseite des Agarose-Blocks, die iS durch den Stift der Molte, mit 4% niedrigschmelzender Agarose unter Verwendung einer Spritze mit einer 20 G-Nadel. </li><li> Trimmen Sie den Agaroseblock mit einem Skalpell, um einen flachen Boden des Blocks und die aufrechte Position des Herzscheitels zu erreichen. </li></ol> 5. Das ventrikuläre Gewebe schneiden <ol><li> Fixieren Sie den Block auf dem Probenhalter des Mikrotoms mit einem Tropfen Cyanacrylat-Leim. Gesicht der Herzschärfe nach oben. </li><li> Legen Sie den Probenhalter in die innere Probenkammer des Mikrotoms, die mit eiskaltem Tiroler ohne Ca 2+ gefüllt ist. Den Agaroseblock vollständig mit der Tyrode-Lösung abdecken. </li><li> Kleine Achsenscheiben in einer Dicke von 150-400 μm vorbereiten, abhängig von der weiteren Anwendung (bei scharfen Elektrodenaufnahmen 150-200 μm), die Vibrationsfrequenz der Klinge bei 60-70 Hz halten und die Klinge so langsam wie möglich nach vorne bewegen . </li><li> Verwenden Sie eine feine Bürste, um die verbleibende Agarose vorsichtig aus den Scheiben zu entfernen. </li><li> Sanft transfR Scheiben mit einer Pasteurpipette in die Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ belüftet mit 100% O 2 und lagern sie für mindestens 30 min auf Eis, um sich aus dem Schneidvorgang zu erholen. </li><li> Danach 30 Minuten in DMEM bei 37 ° C aufbewahren, mit Carbogen belüftet, BDM vor der weiteren Verwendung abwaschen. </li></ol> 6. Vorbereitung der Sharp Electrode Setup <ol><li> Zum Vorheizen alle elektrischen Geräte 30 min einschalten, bevor die Aufnahmen beginnen. </li><li> Setzen Sie eine 3 cm Zellkulturschale auf die Heizplatte, die auf dem invertierten Mikroskop platziert ist. </li><li> Legen Sie die maßgeschneiderte Ringelektrode (Abbildung 2 ) in die Schale und verbinden Sie die Erdungsdrähte des Vorverstärkers und der Stimulationselektrode. </li><li> Verbinden Sie die flexiblen Rohre des Perfusionssystems mit der Schale. </li><li> Füllen Sie das Reservoir des Perfusionssystems mit DMEM, belüftet mit Carbogen. </li><li> Schalte die Perfusionspumpe ein und setze die Perfusion raTe bis 2-3 mL / min. </li><li> Stellen Sie die Temperatur von DMEM in der Schale auf 37 ° C ein, indem Sie den Durchlauferhitzer und die Heizplatte regeln. </li></ol> 7. Aktion Potenzielle Aufnahmen <ol><li> Legen Sie eine ventrikuläre Scheibe in die DMEM gefüllte Schale. </li><li> Überprüfen Sie die strukturelle Integrität und Lebensfähigkeit (auf der Grundlage der kontraktilen Funktion) des Gewebes mit dem invertierten Mikroskop. </li><li> Füllen Sie eine Aufzeichnungsglaselektrode mit 3 M KCL. </li><li> Füllen Sie eine Stimulationselektrode mit DMEM. </li><li> Legen Sie die Aufzeichnungselektrode und die Stimulationselektrode auf die Elektrodenhalter. </li><li> Legen Sie die Stimulationselektrode sorgfältig auf die Scheibe und schalten Sie den elektrischen Stimulator ein. Beginnen Sie mit einer Stimulationsfrequenz von 1-2 Hz. </li><li> Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode mit dem Mikromanipulator über die vorgesehene Aufnahmeposition. </li><li> Langsam die Aufzeichnungselektrode absenken, bis die Spitze das Gewebe berührt. </li><li> Tragen Sie einen kurzen rechteckigen elektrischen Puls durch dieAufzeichnungselektrode, um die Zellmembran zu durchdringen. </li><li> Setzen Sie die Aufzeichnungselektrode sorgfältig ein, bis ein stabiles Signal gewährleistet ist. </li><li> Starten Sie die Aufnahme von Aktionspotentialen. </li></ol>

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<li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2%2C3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li>
<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Ventrikuläre Scheiben ermöglichen elektrophysiologische, pharmakologische und mechanische Untersuchungen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und einem direkten Zugang der Messtechnik zu allen Regionen des Herzens. Physiologische Wirkungspotentialeigenschaften wurden in embryonalen, neonatalen und erwachsenen Scheiben 9 , 10 , 11 nachgewiesen. Die Vitalität der Scheiben, mit Ausnahme der Oberflächens...

Dünngewebescheiben wurden in der Grundwissenschaft häufig verwendet, da Yamamot und Mcllwain 1966 zeigten, dass die elektrische Aktivität von Hirnschnitten in vitro 1 aufrechterhalten wird . Seither wurden elektrophysiologische und pharmakologische Studien an Scheiben aus Gehirn 2 , Leber 3 , Lunge 4 und Myokardgewebe 5 , 6 , 7 durchgeführt. Erste Patch-Clamp-Aufnahmen in ventrikulären Scheiben aus neonatalen Rattenherzen wurden im Jahre 1990 beschrieben 8 , aber diese Technik fiel für einige Zeit in Vergessenheit. Mehr als ein Jahrzehnt später, unsere Gruppe eine neue Methode zur Vorbereitung murine embryonalen 9 , neonatale 10 und erwachsenen 11 Herz-Scheiben. Diese lebensfähigen Gewebeschnitte können für akute Experimente (erwachsene Scheibe) verwendet werdenS kann für mehrere Stunden kultiviert werden) oder kurzfristige Kulturversuche (embryonale und neonatale Scheiben können für einige Tage kultiviert werden). Die Scheiben zeigen in vivo wie elektrophysiologische Eigenschaften und eine homogene Anregungsspanne, wie sie durch scharfe Elektrodenwirkungspotentiale und Mikroelektrodenanordnungen aufgezeichnet wird 11 . Aufgrund ihrer &quot;zweidimensionalen&quot; Morphologie erlauben sie den direkten Zugang von Aufzeichnungselektroden zu allen Bereichen des Ventrikels, was sie zu einem interessanten Werkzeug für elektrophysiologische Untersuchungen macht und im Vergleich zu Langendorff-perfundierten Herzen ganz neue experimentelle Möglichkeiten aufwirft. Arzneimittelreaktion der Scheiben auf Ionenkanalblocker wie Verapamil (L-Typ Ca 2+ -Kanalblocker), Lidocain (Na + -Kanalblocker), 4-Aminopyridin (unselektivspannungsabhängiger K + -Kanalblocker) und Linopirdin (KCNQ K + -Kanal-Blocker) 9 , 11 </suP&gt; entsprach den bekannten Wirkungen auf dissoziierten Kardiomyozyten. Isometrische Kraftmessungen zeigten eine positive Kraftfrequenzbeziehung und drängten eine intakte kontraktile Funktion 10 . Diese Ergebnisse zeigten, dass murine ventrikuläre Scheiben als in vitro Gewebemodell für physiologische und pharmakologische Studien geeignet sind. Darüber hinaus haben sich die ventrikulären Scheiben der Empfängerherzen in Kombination mit scharfen Elektrodenaufnahmen als sehr hilfreiches Werkzeug erwiesen, um die elektrische und mechanische Integration sowie die Reifung der transplantierten fetalen 12 , 13 , 14 und der Stammzellen-abgeleiteten 15 Kardiomyozyten zu charakterisieren. Zusammenfassend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles und gut etabliertes multizellulares Gewebemodell und sollten als komplementär zu dissoziierten Kardiomyozyten und Langendorff-perfundierten Herzen betrachtet werdenIn der Herz-Kreislauf-Forschung mit dem großen Vorteil der Bereitstellung einer in vivoähnlichen Gewebestruktur (im Gegensatz zu dissoziierten Zellen) sowie direkten Zugang von Messtechniken wie scharfe Elektrodenaufnahmen zu allen Regionen des Herzens (im Gegensatz zu ganzen Herzpräparaten).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland</td><td></td><td>Mikrotom mit vibrierender Klinge.</td></tr><tr><td>Edelstahlklingen</td><td>Campden Instruments, Loughborough, England</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Feine Bürste, z.B. Größe 6 (4/32")</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Präparationstisch</td><td></td><td></td><td>selbstgemachte</td></tr><tr><td>Häutung zum Einbetten von Ventrikeln in Agarose</td><td></td><td></td><td>selbstgemachte</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4'' Nadeln</td><td>Braun, Melsungen, Deutschland</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2'' Nadeln</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine Schere</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette #5, 0,1 x 0,06 mm Spitze</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffgas (medizinische Qualität O2)</td><td>Linde, München, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbogen Gas (95 % O2, 5 % CO2)</td><td>Linde, München, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Kleber</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low-melt Agarose</td><td>Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-25000 I.E./5</td><td>mL Ratiopharm, Ulm, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Verstärker</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Deutschland</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator mit geringer Vergrößerung</td><td>Narashige, Tokio, Japan</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>Dreiachsiger Mikromanipulator mit hoher Vergrößerung</td><td>Narashige, Tokio, Japan</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionspumpe</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-Kanal Temperaturregler</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckpulsstimulator</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Deutschland</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

murine kurze axis ventrikuläre herzscheiben für elektrophysiologische studien

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Murine Kardiomyozyten wurden weitgehend für In-vitro- Studien der Herzphysiologie und neue therapeutische Strategien verwendet. Allerdings sind multizelluläre Präparate von dissoziierten Kardiomyozyten nicht repräsentativ für die komplexe in vivo- Struktur von Kardiomyozyten, Nicht-Myozyten und extrazellulärer Matrix, die sowohl mechanische als auch elektrophysiologische Eigenschaften des Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine Technik zur Vorbereitung lebensfähiger ventrikulärer Scheiben von erwachsenen Mausherzen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und zeigen ihre Eignung für elektrophysiologische Aufnahmen. Nach der Exzision des Herzens werden Ventrikel von den Vorhöfen abgetrennt, mit einer Ca 2+ -freien Lösung, die 2,3-Butandionmonoxim enthält, perfundiert und in einen 4% niederschmelzenden Agaroseblock eingebettet. Der Block wird auf ein Mikrotom mit einer Vibrationsklinge gelegt und Gewebeschnitte mit einer Dicke von 150-400 μm werden vorbereitet, wobei die Vibration frei bleibtQuency der Klinge bei 60-70 Hz und bewegt die Klinge so langsam wie möglich nach vorne. Die Dicke der Scheiben hängt von der weiteren Anwendung ab. Die Scheiben werden in eiskalter Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ und 2,3-Butandionmonoxim (BDM) für 30 min gelagert. Danach werden die Scheiben für 30 min auf 37 ° C DMEM übertragen, um das BDM zu waschen. Scheiben können für elektrophysiologische Untersuchungen mit scharfen Elektroden oder Mikroelektroden-Arrays verwendet werden, um Kraftmessungen zu analysieren, um die kontraktile Funktion zu analysieren oder die Wechselwirkung von transplantierten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten und Wirtsgewebe zu untersuchen. Für scharfe Elektrodenaufnahmen wird eine Scheibe in eine 3 cm Zellkulturschale auf der Heizplatte eines invertierten Mikroskops gegeben. Die Scheibe wird mit einer unipolaren Elektrode stimuliert und intrazelluläre Aktionspotentiale von Kardiomyozyten innerhalb der Scheibe werden mit einer scharfen Glaselektrode aufgezeichnet.

Myokardinfarkt führt zu einem nahezu irreversiblen Verlust von Kardiomyozyten. Zell-Ersatz-Therapie mit Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten für exogene Herzregeneration ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Die elektrische Integration und Reifung der transplantierten Zellen ist entscheidend für die Sicherheit und Effizienz der Zellersatztherapie. Zur Beurteilung der Integration und Reifung wurden die von induz...

Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht .

Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, lebensfähige ventrikuläre Herzpräparate zu gewinnen, die für elektrophysiologische Ableitungen geeignet sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der kardialen Elektrophysiologie auf Gewebeebene zu beantworten, beispielsweise zur elektrischen Integration transplantierte Kardiomyozyten oder Wirkungen kardioaktiver Arzneistoffe. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass lebensfähige ventrikuläre Gewebeschnitte eine erhaltene, in vivo-ähnliche Gewebestruktur aufweisen und direkte Messungen in allen Bereichen des Herzens ermöglichen.Obwohl diese Methode Einblicke in die elektrophysiologischen Vorgänge im murinen Herzen ermöglicht, kann sie auch auf andere Tiere wie Kaninchen oder Meerschweinchen angewendet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, wischen Sie zunächst die Haut des Tieres mit 70 % Ethanol ab. Nach Öffnung des Thorax wird das Perikard des Herzens vorsichtig mit kleinen Scheren und einer Pinzette dissekiert.Führen Sie eine Kanüle in den linken Ventrikel ein und perfundieren Sie das Herz in situ mit eiskalter Tyrode-Lösung ohne Calcium, bis das verbleibende Blut entfernt ist. Entfernen Sie dann das Herz vorsichtig und überführen Sie es in eiskalte Tyrode-Lösung ohne Calcium. Trennen Sie die Vorhöfe mit einem Skalpell oder einer Schere von den Ventrikeln.Als Nächstes platzieren Sie die Ventrikel mit der Spitze nach oben in die Agaroseform. Anschließend setzen Sie den Stift in die Mitte der Form und in die linke Ventrikularkammer. Füllen Sie die Form mit 4 % Low-Melt-Agarose bei 37 Grad Celsius, bis das Herz vollständig bedeckt ist.Danach das Formstück zur schnelleren Erstarrung des Agarosegels auf Eis legen, um zu verhindern, dass das Gewebe aufschwimmt. Nach einer Minute den Agaroseblock, der die Ventrikel enth&auml;lt, mit einem Skalpell aus der Form entfernen. Anschlie&szlig;end den Block umdrehen und die Ventrikelh&ouml;hlen sowie den Spalt auf der R&uuml;ckseite des Agaroseblocks mit 4&nbsp;% Low-Melt-Agarose mittels einer Spritze auff&uuml;llen.Danach die Agaroseprobe mit einem Skalpell so beschneiden, dass sie eine flache Unterseite aufweist und die Herzspitze senkrecht ausgerichtet ist. Befestigen Sie die Probe in diesem Schritt mit einem Tropfen Cyanoacrylat-Kleber am Probenträger des Mikrotoms, wobei die Herzspitze nach oben zeigen soll. Anschließend wird der Probenträger in die innere Probennkammer des Mikrotoms gebracht, die mit eiskaltem Tyrode-Lösung ohne Calcium gefüllt ist.Stellen Sie sicher, dass der Agaroseblock vollständig mit Tyrode-Lösung bedeckt ist. Bereiten Sie die Schnitte je nach weiterer Anwendung in einer Dicke von 150 bis 400 Mikrometern vor. Halten Sie die Schwingungsfrequenz der Klinge zwischen 60 und 70 Hertz und bewegen Sie die Klinge so langsam wie möglich vorwärts.Anschließend mit einem feinen Pinsel vorsichtig die verbleibende Agarose von den Schnitten entfernen. Danach die Schnitte vorsichtig mit einer Pasteurpipette in die Tyrode-Lösung mit 0,9 Millimolar Calcium überführen, die mit 100 % Sauerstoff belüftet ist. Mindestens 30 Minuten lang zur Erholung von der Schnittprozedur auf Eis lagern.Das Legen der Schnitte auf ein Netz hilft, sie flach zu halten. Anschließend verwenden Sie ein Filterpapier und ein zweites Netz, um die Schnitte in DMEM bei 37 Grad Celsius, das mit Carbogen durchblubbert wird, zu überführen, um BDM vor der weiteren Verwendung auszuwaschen. Zum Vorheizen schalten Sie alle elektrischen Geräte 30 Minuten vor den Aufnahmen ein.Stellen Sie eine Zellkulturschale mit einem Durchmesser von drei Zentimetern zusammen mit der Heizplatte auf das umgekehrte Mikroskop. Danach platzieren Sie die selbstgefertigte Ringelektrode in der Schale und schließen die Erdungskabel des Vorverstärkers und der Stimulationselektrode an. Anschließend verbinden Sie die flexiblen Schläuche des Perfusionsystems mit der Schale. Füllen Sie das Reservoir des Perfusionsystems mit DMEM und belüften Sie es mit Carbogen. Schalten Sie dann die Perfusionspumpe ein und stellen Sie die Perfusionsrate auf zwei bis drei Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie die Temperatur des DMEM in der Schale auf 37 Grad Celsius ein, indem Sie den Durchflussheizer und die Heizplatte regulieren.Platzieren Sie nun eine ventrikuläre Schnittprobe in die mit DMEM gefüllte Schale. Überprüfen Sie mit dem umgekehrten Mikroskop die strukturelle Integrität und Lebensfähigkeit des Gewebes. Füllen Sie anschließend eine Aufzeichnungsglaselektrode mit dreimolarer Kaliumchloridlösung und eine Stimulations­elektrode mit DMEM.Als Nächstes platzieren Sie die Ableitelektrode in der Stimulations­elektrode auf den Elektrodenhaltern. Anschließend setzen Sie die Stimulations­elektrode vorsichtig auf das Schnittpräparat auf. Schalten Sie den elektrischen Stimulator ein und beginnen Sie mit einer Stimulations­frequenz von ein bis zwei Hertz.Verschieben Sie dann die Aufnahmeelektrode mit einem Mikromanipulator an die vorgesehene Aufnahmeposition. Senken Sie die Aufnahmeelektrode langsam ab, bis die Spitze das Gewebe berührt. Sobald die Aufnahme den Kontakt erfasst, geben Sie einen kurzen, rechteckförmigen elektrischen Impuls über die Aufnahmeelektrode ab, um die Zellmembran zu durchdringen.Als Nächstes positionieren Sie die Aufnahmeelektrode vorsichtig neu, bis ein stabiles Signal gewährleistet ist. Danach beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Aktionspotentialen. Um Integration und Reifung zu bewerten, wurden Kardiomyozyten, die von iPSCM stammten, die eGFP exprimieren, in die gesunden Herzen erwachsener Mäuse transplantiert.Hier ist ein ventrikulärer Herdschnitt dargestellt, der das transplantierte iPSCM enthält und mit einer monopolaren Elektrode, die im Wirtsgewebe platziert wurde, fokal stimuliert wurde. Intrazelluläre Aktionspotentiale wurden mit scharfen Glasmikroelektroden, die mit dreimolarigem Kaliumchlorid gefüllt waren, sowie mit eGFP-positiven transplantierten iPSCM und benachbarten Wirtsgewebe innerhalb der Schnitte aufgezeichnet. Dargestellt sind hier die Aufzeichnungen der Aktionspotentiale im gesunden Wirtsgewebe und in den transplantierten iPSCM.Die Schnitte wurden fokal mit einer Stimulations-Elektrode, die im Wirtsgewebe platziert war, bei etwa zwei Hertz und fünf Hertz stimuliert. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Vorschubgeschwindigkeit der Mikrotomklinge so langsam wie möglich zu halten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie beispielsweise erste Messungen angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Zelltherapie den Weg, elektrische Eigenschaften, Integration und Reifung transplantierten Kardiomyozyten in empfängerseitigen Herzen zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lebensfähige ventrikuläre Querschnitte mithilfe eines Mikrotoms mit vibrierender Klinge präpariert werden.Diese Schnitte eignen sich besonders gut für elektrophysiologische Ableitungen mit scharfen Glaselektroden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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Aufbereitung von menschlichem Myokardgewebe für die Langzeitkultivierung

Lernen Sie die Präparation vitaler ventrikulärer Herzscheiben von Mäusen für elektrophysiologische Aufzeichnungen. Diese Methode ermöglicht Studien zur elektrischen Integration transplantierter Kardiomyozyten und Wirkungen kardioaktiver Substanzen.

Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

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