Name: Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung und Stimulation neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays mit E17-Mausgewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Netzwerkdynamiken im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis.

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation finanziert CMMI-1300007 finanziert. Wir möchten frühere Labormitglieder anerkennen, die mit der Gestaltung dieser Protokolle und mit der Pflege der Kulturen seit über fünf Jahren an der George Mason University geholfen haben: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera und Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Schritte, die in diesem Protokoll skizziert werden, liefern genügend Details für den Anfänger, um seine eigenen neuronalen Kulturen auf MEAs zu tafeln und Netzwerkaktivitäten aufzuzeichnen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, dass die Kulturen richtig haften, eine Teppichschicht von Zellen über den Elektrodenarrays bilden und seit Monaten gesund und kontaminationsfrei bleiben. Obwohl es am besten ist, sich an alle Teile des Protokolls zu halten, gibt es während des gesamten Prozesses Schritte, die für das erfolgreiche Ergebnis entscheidend sind. Die Verwendung von aseptischen Technik während des gesamten Prozesses ist zwingend erforderlich, um zu verhindern, dass die Kulturen kontaminiert werden. Neue MEAs müssen hydrophil gemacht werden, wie im Protokoll beschrieben, oder es kommt zu einer schlechten Zelladhäsion. Durch die Vermeidung von harten Pipettieren und die Bildung von Luftblasen während der Dissoziation wird die Anzahl der beschädigten Zellen reduziert und führt zu einer höheren und gesünderen Ausbeute. Umschalten von DMEM 5/5 auf DMEM + nach dem erstenFütterung ist auch wichtig. DMEM 5/5 enthält Pferdeserum, das Gliazellen dazu veranlasst, die Kultur zu dominieren, wenn sie kontinuierlich verwendet wird und zu einer schlechten neuronalen Aktivität führen wird, obwohl die Kulturen gesund erscheinen werden 17 . Die Fütterung der Kulturen wie geplant und halten sie in ordnungsgemäße Inkubationsbedingungen ist auch entscheidend. Plating Zellkulturen auf MEAs beinhaltet viele Variablen, die zu weniger als optimalen Ergebnissen führen können. Obwohl das Ziel ein perfekter &quot;Teppich&quot; von Zellen ist, führt das Versagen, die oben erwähnten kritischen Schritte zu lösen, zu einer schlechten Zellreifung oder einer Kontamination. Eine schlechte Zelladhäsion, die sich von der schlechten Zellreifung unterscheidet, ist ebenfalls ein Anliegen. Dies kann durch mehrere Faktoren verursacht werden, einschließlich der schlechten MEA-Vorbereitung vor dem Plattieren oder der Verwendung von altem Medium. Wenn altes Medium eine stabilisierte Form von L-Glutamin und serumfreie Ergänzung für die neuronale Zellkultur enthält (siehe Materialtabelle) Verwendet wird, die Zellen anfangs haften, aber dann schweben nach etwa zwei Wochen. Wenn bakterielle Kontamination ein anhaltendes Problem ist, kann dem Medium ein Antibiotikum, wie Ampicillin oder Pen-Strep, zugesetzt werden. Es gibt auch Fungizide zur Behandlung von Pilzkontaminationen. Dies sind einige der häufigsten Variablen, die das Ergebnis der Kulturen beeinflussen können. Es gibt viele andere, die nur nach Zeit und Erfahrung begegnet werden. Im Vergleich zur Verwendung von Glasmikroelektroden eignet sich diese Technik hervorragend für das Studium der Netzdynamik und der pharmakologischen Reaktionen. Es ermöglicht die Verwendung von vielen verschiedenen räumlich-zeitlichen Stimulationsmuster und ermöglicht die Aufzeichnung von neuronalen Reaktionen aus mehreren Bereichen auf einmal. Vorherige Gruppen haben interessante Ergebnisse unter Verwendung von Protokollen gezeigt, die den hier beschriebenen ähnlich sind. Da die Kulturen für Wochen oder Monate dauern und die gleichen Kulturen wiederverwendet werden können, ist diese Technik auch einLlows für mehrere Experimente im Laufe der Zeit auf dem gleichen Netzwerk. Allerdings gibt es Einschränkungen für diese Technik. MEAs sind nicht invasiv. Daher können sie nur extrazelluläre Aktivität aufnehmen, im Gegensatz zu Patch-Clamping oder intrazelluläre Aufzeichnung mit Pipetten. Da außerdem jede Elektrode in einem Array von mehreren Zellen bedeckt ist, ist es nicht möglich, die Aktivität eines einzelnen Neurons zu lösen. Umgekehrt, weil diese in vitro Kulturen sind, können sie nicht vollständig reproduzieren die strukturellen Eigenschaften von Netzwerken im Gehirn. Auch kann die Aktivität nur für weniger als 30 min zu einem Zeitpunkt aufgezeichnet werden, ohne dass ein Mechanismus eine CO &amp; sub2 ; -Atmosphäre für die Zellen zur Aufrechterhaltung ihres pH-Gleichgewichts bereitstellt. Sobald diese Technik beherrscht wird, können pharmakologische Manipulationen mit oder ohne elektrische Stimulation erforscht werden. Neue Protokolle zum Lernen und Gedächtnisbildung in neuronalen Netzwerken können auch entworfen und getestet werden, zusammen mit pRotationen für Hippocampus- oder Rückenmarksnetze. Protokolle für die Stimulierung und Schulung von Netzwerken wurden zuvor veröffentlicht, und einige von diesen wurden zu in vivo- Protokollen weiterentwickelt, wie die von Eytan et al. Vorgeschlagene &quot;selektive Anpassung&quot; 19 Mehrere Protokolle wurden getestet. Doch nur Ergebnisse aus einer von Ruaro im Jahr 2005 vorgeschlagenen Änderung des Tetanus-Verfahrens sind hier 14 , 20 dargestellt.

Mikroelektroden-Arrays (MEAs) können zur Untersuchung von Arzneimitteltoxizität, Designparadigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation und zur Untersuchung der Netzwerkdynamik in neuronalen Kulturen verwendet werden 1 . Im Gegensatz zu herkömmlicheren Methoden, wie z. B. Patch-Clamping, die nur die Aktivität aus einer einzigen Zelle oder Feldaufzeichnung mit einer Glaspipette aufzeichnen können, die extrazelluläre Reaktionen von den Neuronen aufnehmen kann, die die Elektrode an einer einzigen Stelle umgeben, können MEAs gleichzeitig gleichzeitig sein Aufzeichnung von mehreren Standorten in einer Zellkultur, ohne die schwierige Aufgabe, jede Elektrode einzeln zu platzieren. Dies ermöglicht das Studium der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Zellengruppen, die ein Netzwerk innerhalb dieser Kultur bilden. Darüber hinaus sind die Auswirkungen der elektrischen Stimulation auf die Netzwerkfeuerungsmuster 2 , 3 , 4 , 5 und die Netzwerksteuerung 6 &lt;/ Sup&gt; in neuronalen Kulturen wurden gut dokumentiert, und zahlreiche Konfigurationen von elektrischer Stimulation und Kontrollen können problemlos innerhalb des gleichen Versuchsaufbaus angewendet werden, so dass eine breite Palette von räumlich-zeitlichen Dynamiken erforscht werden kann. Eine der wichtigsten Dynamik von Interesse an diesen In-vitro- Studien war das Ausmaß, in dem kultivierte Netzwerke Eigenschaften zeigen, die das Lernen zeigen 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Das Peixoto-Labor untersuchte bisher die Effekte von hochfrequenten Trainingssignalen, wie in Ruaro et al. 14 , auf Netzwerken von Maus-Neuronen, die auf Mikroelektroden-Arrays plattiert sind. In diesen Experimenten zeigten die Netzwerke eine Zunahme der Antwort nachG Training durch elektrische Stimulation induziert. Die erhöhte Response wurde als eine Form des Lernens durch Stimuluserkennung betrachtet, wobei die Netzwerke in einer konsistenten Weise auf eine Veränderung des Reizes nach der Anwendung eines spezifischen Stimulations- ( dh Trainings-) Protokolls reagierten. Dieses Protokoll zeigt, wie man neuronale Zellen auf MEAs kultiviert, erfolgreich von über 95% der überzogenen Teller aufnehmen, ein Protokoll erstellen, um die Netzwerke zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren, einzelne Einheitsaktivitäten zu sortieren, Histogramme zu zeichnen und die Ergebnisse zu interpretieren Solche Experimente. Die Verwendung eines proprietären Systems (siehe Tabelle der Materialien ) für die Stimulation und Aufzeichnung von neuronalen Kulturen wird gezeigt, ebenso wie die Anwendung von Softwarepaketen (siehe Tabelle der Materialien ), um neuronale Einheiten zu sortieren . Eine kundenspezifische grafische Benutzeroberfläche (siehe Tabelle der Materialien ) dient zur Visualisierung von Post-sTimulus-Zeit-Histogramme, Inter-Burst-Intervalle und Burst-Dauer sowie die zelluläre Antwort auf Stimulation vor und nach einem Trainingsprotokoll zu vergleichen.

<table><tbody><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>Make 4 mg/mL Aliquots</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Serumfreie Ergänzung für die neuronale Zellkultur. 1 mL Aliquots herstellen und einfrieren</td></tr><tr><td>Becher - Glas - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Becher - Glas - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Daumenzange mit stumpfer Spitze</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen - steril, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen - steril, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit Glutamax</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>Zellkulturmedien, die eine stabilisierte Form von L-Glutamin</td></tr><tr><td>enthalten DNase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>Daumenzange</td> <td>mit feiner SpitzeWorld Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipetten</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Eine stabilisierte Form von L-Glutamin, die als Ergänzung verwendet</td></tr><tr><td>wird Hämozytometer-Chip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB complete</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Umgebungs-CO2 Zellspeichermedien</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCS Filterverstärker</td><td>MultiChannel System</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS Kopftisch/Vorverstärker</td><td>MultiChannel System</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS Mikroelektrodenarray</td><td>MultiChannel System</td><td>60MEA200/ 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS Netzteil</td><td>MultiChannel System</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>MCS Signalteiler</td><td>MultiChannel System</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS Stimulusgenerator</td><td>MultiChannel System</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>MCS Temperaturregler</td><td>MultiChannel System</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Media Vorratsflasche - Glas 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen für Autoklaven - 0,4 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen für Autoklaven - 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>Mikrofipettenspitzen für Autoklaven</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen für Autoklaven - 1.000 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen für Autoklaven - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td> Mikropipette für <td>Autoklaven</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette - 1.000 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papain - 0,22 gefiltert</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen Streptomycin)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen -100 mm zum Einmalgebrauch</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen -100 mm Glas</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen -35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Reinigungssystem</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid (PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>konisches Polyethylen-Röhrchen (Zentrifuge) -15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>konisches Polypropylen-Röhrchen (Zentrifuge) -50</td><td>mL Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Behandlungsmasken</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>Schere - iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Schere - groß</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>Schere - klein chirurgisch</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette - steril, 1 ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette - steril, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette - steril, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette - steril, 50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>Wird zur Analyse von .mat-Dateien verwendet. Auf Anfrage kostenlos erhältlich. Wenden Sie sich an npeixoto@gmu.edu, um ein Exemplar anzufordern.</td></tr><tr><td>Software: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td>N/A</td><td>Wird für die Datenerfassung</td></tr><tr><td>verwendet Software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>Wird verwendet, um .nex-Dateien in .mat</td></tr><tr><td>zu konvertieren Software: Offline-Sortierer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Wird verwendet, um neuronale Spies zu sortieren und Datendateien in .plx und dann in .nex zu konvertieren</td></tr><tr><td>Softwarehandbuch: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>Softwarehandbuch: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf</td></tr><tr><td>Software-Handbuch: Offline-Sortierer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>Spatel - kleiner doppelseitiger Spachtel</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &Mikro; m Porenfilter - 250 mL</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette - große Bohrung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette - kleiner Durchgang&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>In 8 Tortenspalten schneiden und in einer Petrischale aus Glas autoklavieren</td></tr></tbody></table>

zeitabhängige erhöhung der netzwerkreaktion auf die stimulation von neuronalen zellkulturen auf mikroelektroden-arrays

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Mikroelektroden-Arrays (MEAs) können verwendet werden, um die Toxizität von Medikamenten zu untersuchen, Designparadigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation zu entwickeln und die Netzwerkdynamik in neuronalen Kulturen zu untersuchen. Im Gegensatz zu herkömmlicheren Methoden wie Patch-Clamping, die nur die Aktivität von einer einzigen Zelle aufzeichnen können, können MEAs gleichzeitig von mehreren Standorten in einem Netzwerk aufzeichnen, ohne dass die schwierige Aufgabe besteht, jede Elektrode einzeln zu platzieren. Darüber hinaus können zahlreiche Kontroll- und Stimulationskonfigurationen problemlos innerhalb des gleichen Versuchsaufbaus angewendet werden, so dass ein breites Spektrum an Dynamik erforscht werden kann. Eine der Hauptdynamik von Interesse an diesen In-vitro- Studien war das Ausmaß, in dem kultivierte Netzwerke Eigenschaften zeigen, die das Lernen angeben. Maus-neuronale Zellen, die auf MEAs kultiviert werden, zeigen eine Erhöhung der Reaktion nach dem Training durch elektrische Stimulation induziert. Dieses Protokoll zeigt, wie man neuronale Zellen auf MEAs kultiviert; Erfolgreich reSchnur von über 95% der plattierten Schüsseln; Ein Protokoll erstellen, um die Netzwerke zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren; Und sortieren, plotten und interpretieren die Ergebnisse aus solchen Experimenten. Die Verwendung eines proprietären Systems zur Stimulierung und Aufzeichnung von neuronalen Kulturen wird gezeigt. Softwarepakete werden auch verwendet, um neuronale Einheiten zu sortieren. Eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche wird verwendet, um Post-Stimulus-Zeit-Histogramme, Inter-Burst-Intervalle und Burst-Dauer zu visualisieren sowie die zelluläre Antwort auf Stimulation vor und nach einem Trainingsprotokoll zu vergleichen. Schließlich werden repräsentative Ergebnisse und zukünftige Richtungen dieser Forschungsarbeit diskutiert.

Maus-neuronale Zellen, die auf Multi-Elektroden-Arrays kultiviert werden, zeigen eine Erhöhung der Reaktion nach elektrischer Stimulation. Dieses Protokoll demonstriert, wie man Neuronen kultiviert, wie man Aktivität aufnimmt und wie man ein Protokoll aufbaut, um die Netze zu trainieren, um auf Stimulationsmuster zu reagieren.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, E17-Maus-Neurongewebe zu isolieren und zu assoziieren, um neuronale Netzwerke auf Mikroelektrodenarrays zu kultivieren, abzuleiten und zu stimulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Untersuchung der Netzwerkdynamik im Zusammenhang mit den grundlegenden Mechanismen von Lernen und Gedächtnis zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Mikroelektrodenarrays gleichzeitig von mehreren Stellen aufzeichnen können und somit im Vergleich zur traditionelleren Einzelplatz-Ableitung mittels Glaspipette eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung ermöglichen.Obwohl diese Methode Einblicke in die Netzwerkdynamik von Lernen und Gedächtnis ermöglichen kann, eignet sie sich auch zur Untersuchung von Arzneimitteltoxizität oder zur Entwicklung von Paradigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation. Eine visuelle Darstellung dieses Vorgangs ist entscheidend, da die Handhabung des Gewebes während der Dissektion und Dissociation nur schwer allein durch das Lesen von Protokollen zu erlernen ist. Um das Array vorzubereiten, geben Sie 40 bis 50 Mikroliter aufgetauten Laminin in die Mitte jedes MEA und 0,2 Milliliter Laminin auf die Kontrollplatten, wobei sterile Pipettenspitzen verwendet werden.Decken Sie alle MEAs und die Kontrollgefäße im Biosicherheitswerkbank ab und überführen Sie sie für eine Stunde in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Laminin aus der Mitte der MEAs mittels Absaugung mit sterilen Pasteur-Pipetten und lassen die Oberfläche vor der Zellsemination austrocknen. Anschließend geben Sie L-15-Medium in vier 100 Millimeter Petrischalen, decken diese ab und stellen sie etwa 40 bis 60 Minuten lang in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius, bis das Medium eine schaumige Konsistenz aufweist, jedoch nicht vollständig durchgefroren ist.Um die Dissektion vorzubereiten, stellen Sie eine Glas-Petri-Schale mit der Öffnung nach unten in ein Tablett voller Eis. Sprühen Sie nun den unteren Bauchbereich des Tieres mit 70 % Ethanol ein. Verwenden Sie kleine chirurgische Scheren, um einen V-förmigen Schnitt durch die Haut und das subkutane Fett des unteren Bauches zu führen, ziehen Sie den Schnitt bis zu den distalen Enden der Brusthöhle und legen Sie die Gebärmutter frei. Heben Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Gebärmutter zwischen den Embryonen an. Schneiden Sie mit einer Präzisionsschere das Bindegewebe weg, bis die gesamte Gebärmutter frei ist. Spülen Sie die Gebärmutter anschließend kurz mit 70 % Ethanol ab, um Blutreste zu entfernen, und legen Sie sie in eine der vier Petrischalen, die mit kaltem L-15 gefüllt sind.Lösen Sie anschließend jedes Embryo aus dem Uterus und dem inneren embryonalen Sack mithilfe von zwei Paar feiner Pinzetten. Legen Sie die freigegebenen Embryonen in die zweite Schale, die mit kaltem L-15 gefüllt ist, überführen Sie dann die Köpfe in die dritte Petrischale und die Körper in die vierte. Stellen Sie im Biohaubenarbeitsplatz ein Stück autoclaviertes Filterpapier auf die gekühlte Glas-Petrischalen-Ablage und legen Sie einen Embryokopf auf das Filterpapier.Platzieren Sie anschließend die Schneidekante der unteren Schere der Iris-Schere in der Schädelbasis, wobei die untere Schere stets an der inneren Oberfläche des Schädels und vom Gehirn weggehalten wird. Durchtrennen Sie die Hinterhauptsplatte und schneiden Sie dann entlang der Mittellinie zwischen den Scheitelplatten. Setzen Sie den Schnitt weiter nach vorne (rostral) zwischen den knorpeligen Stirnbeinplatten fort. Anschließend führen Sie ausgehend vom Zentrum der Hinterhauptsplatte jeweils einen senkrechten Schnitt nach links und rechts neben dem Mittelschnitt durch.Danach vorsichtig einen kleinen Spatel zwischen die ventrale Fläche des Gehirns und die unteren Schädelplatten schieben, bis er vollständig unter dem Gehirn liegt. Anschließend den Spatel anheben, um das Gehirn zu entfernen. Mit einem sauberen Spatel zuerst die Riechwurzel entfernen, dann das Frontalhirn in einem trapezförmigen Muster präparieren.Überführen Sie das Gewebe anschließend in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das das Lagermedium enthält. Verwenden Sie in diesem Verfahren zwei sterile Skalpelle, um das Gewebe zu zerkleinern. Geben Sie danach 2,5 Milliliter der DNase-Papain-Mischung zu dem zerkleinerten Gewebe in der Petrischale hinzu.Swirlen Sie die Petrischale vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich das gesamte Gewebe frei in der Lösung befindet und nicht am Boden der Schale haftet. Anschließend stellen Sie die Schale 15 Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie im Biosicherheitswerkbank eine sterile Pipette mit großem Durchmesser, um das gesamte Medium samt Gewebe in ein steriles kryogenes Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von fünf Milliliter zu überführen.Bringen Sie die Spitze derselben Transferpipette nahe am Boden des Röhrchens an und pipettieren Sie die Mischung vorsichtig 10 bis 15 Mal auf und ab. Geben Sie dann zwei Milliliter vorgewärmtes DMEM 5/5 zu der dissoziierten Zellmischung hinzu und verschließen Sie das Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie es vorsichtig durch Umstülpen und zentrifugieren Sie es bei 573 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Verwerfen Sie in der Biohaube das gesamte Überstandvolumen, ohne den Pellet zu beschädigen. Geben Sie anschließend einen Milliliter vorgewärmtes DMEM 5/5 zum Pellet im Röhrchen, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Lösen Sie den Pellet mit einer sterilen Pipette mit schmaler Spitze auf, indem Sie vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, bis die Mischung homogen ist.Überführen Sie anschließend 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Außerhalb des Biohoods geben Sie 10 Mikroliter Trypanblau zu den 10 Mikrolitern Zellsuspension im Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Laden Sie danach 10 Mikroliter der mit Trypanblau versetzten Zellsuspension auf einen Einweg-Blutzählkammer-Chip, um die Zellen zu zählen.Verwenden Sie in der Sterilwerkbank eine sterile Mikropipette, um 50 Mikroliter Zellsuspension auf das Zentrum jedes Arrays und jedes Kontroll-Petri-Glases zu übertragen. Danach stellen Sie die abgedeckten Petri-Schalen für drei bis vier Stunden in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Fügen Sie anschließend vorsichtig ein Milliliter vorgewärmtes DMEM 5/5 zu jedem MEA hinzu.Fügen Sie das Medium vorsichtig tropfenweise entlang der Innenseiten der MEA hinzu und vermeiden Sie es, die Zellen vom Array-Zentrum wegzuspülen. Danach setzen Sie einen Deckel, der eine gasdurchlässige FEP-Membran enthält, auf jede MEA, bevor Sie diese wieder in den Inkubator stellen. Nach zwei Tagen führen Sie einen kompletten Mediumwechsel mit vorgewärmtem DMEM+ durch, indem Sie das Medium aus der Petrischale abziehen.Platzieren Sie die Pipettenspitze vorsichtig an der Innenwand und geben Sie ein Milliliter vorgewärmtes DMEM+ zur anschließenden Versorgung ziehen Sie 500 Mikroliter Medium aus der Schale ab und geben 500 Mikroliter vorgewärmtes DMEM+ erneut hinzu. Untersuchen Sie in diesem Verfahren die Proben in der Schale im Abstand von jeweils einem Tag unter dem Mikroskop auf Zellbedeckung der Anordnung sowie auf Kontamination durch Bakterien oder Pilze. Stecken Sie vor dem Herausnehmen der Kulturen aus dem Inkubator den Temperaturregler ein und schalten Sie das System ein, damit die beheizte Basisplatte des Vorverstärkers 35 Grad Celsius erreicht.Stellen Sie dann die verschlossene Kultur in den Vorverstärker, sodass die schwarze Markierung in der MEA-Wanne mit der Referenzmasse ausgerichtet ist. Achten Sie darauf, dass die Stifte des Vorverstärkers korrekt eingeführt sind, sodass der obere Teil des Vorverstärkers sicher befestigt ist und die Kulturkappe weiterhin aufgesetzt ist. Drücken Sie anschließend im Software-Interface auf „Start“, um die Signale zu visualisieren.Wählen Sie im Hauptfenster Spikes, Detektion, automatisch, ändern Sie den Standardabweichungswert auf minus fünf und klicken Sie auf Aktualisieren, um die Schwelle zurückzusetzen. Nach der Visualisierung der Signale klicken Sie auf Stoppen, Aufzeichnen und Abspielen, um die Aktivität aufzuzeichnen. Embryonale Mausneuronen werden auf 60-Kanal-MEAs kultiviert, die die gleichzeitige Aufzeichnung der neuronalen Aktivität im Netzwerk von jeder Elektrode ermöglichen.Hier ist ein repräsentatives Rasterdiagramm der Aktivität von acht Elektroden als Reaktion auf eine Stimulation vor und nach dem Training. Die vertikale rote Linie zeigt den Zeitpunkt des Stimulus an, und die schwarzen Markierungen zeigen Aktionspotentiale an. Vor dem Training gibt es eine unmittelbare Reaktion auf den Stimulusimpuls über alle Kanäle hinweg.Nach dem Training zeigt das Netzwerk eine verlängerte Aktivitätsantwort sowie eine unmittelbare Reaktion auf die Stimulation. Dargestellt ist der Mittelwert von 12 trainierten und 10 Kontroll-Netzwerken; die trainierten Netzwerke weisen signifikant veränderte Spikfrequenzen auf. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie man neuronales Gewebe aus Embryonen von Mäusen isoliert und assoziiert, sowie in der Lage sein, neuronale Netzwerke aus Mikroelektrodenarrays zu kultivieren, abzuleiten und zu stimulieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs.

Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs)

Eine robuste Art und Weise die neuronale Lawinen, dh skaleninvarianten räumlich-zeitliche Aktivitätsmuster platzt, was auf kritischen Zustand Dynamik in Kortex zu untersuchen. Lawinen entstehen spontan bei der Entwicklung von oberflächlichen Schichten der kultivierten Cortex, die für die langfristige Messungen der Aktivität ermöglicht mit planaren integrierten Multi-Elektroden-Arrays (MEA) unter genau kontrollierten Bedingungen.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

Das Video zeigt, wie man ein Mikroelektrodenarray (MEA) verwendet, um die elektrophysiologische Aktivität von Neuronen aufzuzeichnen, die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) stammen. Die elektrophysiologische Aktivität eines Multiwell-MEA, das eine Neuron-Astrozyten-Co-Kultur enthält, wird aufgezeichnet, um Aktionspotentiale von mehreren Neuronen im Netzwerk zu detektieren und die erfolgreiche Differenzierung von hiPSCs in Neuronen zu bestätigen.

Messung der elektrophysiologischen Aktivität neuronaler Netzwerke mit Hilfe von Mikroelektrodenarrays

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verwendung des Multielektroden-Arrays (MEA) zur Messung der synaptischen Physiologie in 3D-Kokultur-Sphären. Diese Methode ermöglicht es, die Dynamik des neuronalen Netzwerks und die Burst-Aktivität des synaptischen Netzwerks in den 3D-Sphären zu verstehen.

Verwendung von Multielektroden-Arrays zur Messung der synaptischen Physiologie in 3D-Kokulturkugeln

In dieser Arbeit wird ein neuartiges experimentelles Modell, in dem 3D-Neuronenkulturen an planare Mikroelektrodenarrays (MEAs) gekoppelt sind, presented. 3D Netzwerke aufgebaut werden, indem Neuronen in ein Gerüst aus Glasmikrokügelchen eingepflanzt werden, auf dem Neuronen wachsen und miteinander verbundene 3D-Strukturen bilden.

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Wir präsentieren ein Protokoll zur Kultivierung primärer Maus-Spiralganglien-Neuronenexplantate auf Multi-Elektroden-Arrays, um neuronale Reaktionsprofile zu untersuchen und Stimulationsparameter zu optimieren. Solche Studien zielen darauf ab, die Neuron-Elektroden-Grenzfläche von Cochlea-Implantaten zu verbessern, um das Gehör der Patienten sowie den Energieverbrauch des Geräts zu verbessern.

Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

Belastung durch Umweltgifte kann akut entwickelnde Embryonen auswirken. Endokriner Chemikalien wie Bisphenole bekannt sind, um das Nervensystem beeinträchtigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem in-vitro- Wirbeltier (Chick Embryo) neuronale Netzwerkmodell, um die funktionellen Auswirkungen der Toxin-Belastung am frühen Embryo zu studieren.

Bewertung der Auswirkungen von endokriner Substanzen auf die Entwicklung der Wirbeltiere neuronales Netz-Funktion mit Multi-Elektroden

Dieses Protokoll soll zeigen, wie in-vitro- Mikroelektrode Arrays mit mikrofluidischen Geräten für das Studium Aktionspotential Übertragung in neuronalen Kulturen zu verbinden. Datenanalyse, nämlich die Erkennung und Charakterisierung von Aktionspotentiale, Vermehrung ist durchgeführt mit einem neuen, erweiterten, aber benutzerfreundlich und frei verfügbar, computational Tool.

Interfacing Mikrofluidik mit Mikroelektrode Arrays für das Studium neuronale Kommunikation und axonalen Signalausbreitung

Dieser Artikel enthält eine Reihe von Protokollen für die Entwicklung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CM) Netzwerken, die auf Multiwell-MEA-Platten kultiviert werden, um die Zellmembran für Aktionspotenzialmessungen reversibel zu elektroporatieren. Hochdurchsatzaufzeichnungen werden von denselben Zellstandorten wiederholt über Tage hinweg abgerufen.

Human iPSC-Derived Cardiomyozyte Networks auf Multiwell Micro-Elektroden-Arrays für recurrent Action Potential Recordings

Der 3D-Druck im Mikrometermaßstab ermöglicht das schnelle Prototyping von polymeren Bauelementen für neuronale Zellkulturen. Als Proof-of-Principle wurden strukturelle Verbindungen zwischen Neuronen durch die Schaffung von Barrieren und Kanälen eingeschränkt, die das Wachstum von Neuriten beeinflussen, während die funktionellen Konsequenzen einer solchen Manipulation durch extrazelluläre Elektrophysiologie beobachtet wurden.

Zwei-Photonen-Polymerisation 3D-Druck von neuronalen Zellkulturgeräten im Mikromaßstab

Dieses Protokoll zielt darauf ab, dorsal-ventral fusionierte Assembloide auf Mehrelektrodenarrays stabil zu plädieren, um die Epilepsie in vitro zu modellieren.

Eine Multi-Elektroden-Array-Plattform zur Modellierung von Epilepsie unter Verwendung von humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Gehirnassembloiden

Erfahren Sie die Kultivierung und Stimulation neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays mit E17-Mausgewebe. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Netzwerkdynamiken im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

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