Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neuronales E17-Gewebe von Mäusen zu isolieren und zu assoziieren, um neuronale Netzwerke auf Mikroelektrodenarrays zu kultivieren, aufzuzeichnen und zu stimulieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Erforschung der Netzwerkdynamik zu beantworten, da sie sich auf die grundlegenden Mechanismen des Lernens und des Gedächtnisses beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Mikroelektrodenarrays in der Lage sind, von mehreren Stellen gleichzeitig aufzuzeichnen und daher eine bessere räumliche, zeitliche Auflösung im Vergleich zu den traditionelleren Glaspipetten für die Aufzeichnung an einer einzigen Stelle bieten können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Netzwerkdynamik von Lernen und Gedächtnis geben kann, kann sie auch zur Untersuchung der Toxizität von Arzneimitteln oder zur Entwicklung von Paradigmen für die personalisierte Medizin der nächsten Generation verwendet werden. Die visuelle Demonstration dieses Prozesses ist von entscheidender Bedeutung, da die Manipulation des Gewebes während des Dissektions- und Dissoziationsprozesses allein durch das Lesen von Protokollen schwer zu erlernen ist. Um das Array vorzubereiten, geben Sie 40 bis 50 Mikroliter aufgetautes Laminin in die Mitte jedes MEA und 0,2 Milliliter Laminin in die Kontrollplatten mit sterilen Pipettenspitzen.

Decken Sie alle MEAs und die Kontrollschalen in der Biohaube ab und geben Sie sie für eine Stunde in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach einer Stunde vorsichtig das überschüssige Laminin aus der Mitte der MEAs durch Absaugen mit sterilen Pasteur-Pipetten und lassen Sie die Oberfläche vor dem Plattieren an der Luft trocknen. Gießen Sie dann L-15-Medium in vier 100-Millimeter-Petrischale, decken Sie sie ab und stellen Sie sie für etwa 40 bis 60 Minuten in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius, bis das Medium eine matschige Konsistenz hat, aber nicht fest gefroren ist.

Um sich auf die Sektion vorzubereiten, stellen Sie eine Petrischale aus Glas mit der Vorderseite nach unten in eine Schale voller Eis. Besprühen Sie nun den Unterbauch der Tiere mit 70%Ethanol. Machen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere einen V-förmigen Schnitt durch die Haut und das Unterhautfett des Unterbauchs, verlängern Sie den Schnitt bis zu den distalen Enden der Brusthöhle und legen Sie die Gebärmutter frei.

Heben Sie die Gebärmutter vorsichtig mit einer Pinzette zwischen den Embryonen an. Schneiden Sie das Bindegewebe mit einer Präparierschere ab, bis die gesamte Gebärmutter frei ist. Spülen Sie dann die Gebärmutter kurz mit 70%igem Ethanol aus, um jegliches Blut zu entfernen, und legen Sie sie in eine der vier Petrischale, die mit kaltem L-15 gefüllt sind.

Lösen Sie anschließend jeden Embryo aus der Gebärmutter und dem inneren Embryonalsack mit zwei Paaren einer Pinzette mit feiner Spitze. Legen Sie die befreiten Embryonen in die zweite Schale, die mit kaltem L-15 gefüllt ist, und übertragen Sie dann die Köpfe in die dritte Petrischalen und die Körper in die vierte. Legen Sie in der Biohaube einen Keil aus autoklaviertem Filterpapier auf die Petrischale aus gekühltem Glas und legen Sie einen Embryokopf auf das Filterpapier.

Platzieren Sie als Nächstes die Schneide der unteren Schere der Irisschere in der Schädelbasis, halten Sie die untere Schere gegen die innere Oberfläche des Schädels und vom Gehirn fern, schneiden Sie durch die Hinterhauptplatte und dann entlang der Mittellinie zwischen den Scheitelplatten. Fahren Sie mit dem rostralen Schnitt zwischen den knorpeligen vorderen Schädelplatten fort. Machen Sie dann, beginnend in der Mitte der Hinterhauptplatte, einen senkrechten Schnitt links und rechts des mittleren Schnitts.

Schieben Sie danach vorsichtig einen kleinen Spatel zwischen die Bauchoberfläche des Gehirns und die unteren Schädelplatten, bis er vollständig unter dem Gehirn ist. Heben Sie dann den Spatel an, um das Gehirn zu entfernen. Entfernen Sie mit einem sauberen Spatel zuerst den Riechkolben und präparieren Sie dann den Frontallappen in einem trapezförmigen Muster.

Übertragen Sie das Gewebe anschließend in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit dem Speichermedium. Verwenden Sie bei diesem Verfahren zwei sterile Skalpellklingen, um das Gewebe zu zerkleinern. Geben Sie dann 2,5 Milliliter der Dnase Papain-Mischung zum gehackten Gewebe in der Petrischale.

Schwenken Sie die Petrischale vorsichtig, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe frei in der Lösung ist und nicht am Boden der Schale haftet. Stellen Sie das Gericht anschließend für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Verwenden Sie in der Biohaube eine sterile Transferpipette mit breiter Bohrung, um alle Medien und das Gewebe in ein steriles Kryoröhrchen mit fünf Millilitern zu übertragen.

Platzieren Sie die Spitze derselben Transferpipette nahe am Boden des Röhrchens und schütteln Sie die Mischung vorsichtig 10 bis 15 Mal. Geben Sie dann zwei Milliliter erwärmtes DMEM 5/5 in die dissoziierte Zellmischung und verschließen Sie das Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie es vorsichtig durch Inversion und zentrifugieren Sie es bei 573 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Entsorgen Sie in der Biohaube den gesamten Überstand, ohne die Palette zu zerbrechen. Geben Sie anschließend einen Milliliter erwärmtes DMEM 5/5 in die Palette im Röhrchen, um die Zellen wieder zu resuspendieren. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette mit kleinem Durchmesser, um die Palette aufzubrechen, indem Sie sie vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Mischung homogen ist.

Übertragen Sie dann 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Außerhalb der Biohaube fügen Sie 10 Mikroliter Trypanblau zu den 10 Mikrolitern Zellsuspension im Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Laden Sie dann 10 Mikroliter der Trypanblau-Zellsuspension auf einen Entsorgungs-Hämozytometer-Chip, um die Zellen zu zählen.

Verwenden Sie in der Biohaube eine sterile Mikropipette, um 50 Mikroliter Zellsuspension in die Mitte jedes Arrays und jeder Kontroll-Petrischale zu übertragen. Stellen Sie dann die abgedeckten Petrischalen für drei bis vier Stunden in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator. Geben Sie anschließend vorsichtig einen Milliliter erwärmtes DMEM 5/5 zu jedem MEA.

Geben Sie das Medium vorsichtig tropfenweise an den Innenrändern des MEA hinzu und vermeiden Sie es, die Zellen von der Array-Mitte wegzuspülen. Setzen Sie anschließend eine Kappe mit einer gasdurchlässigen FEP-Membran auf jedes MEA, bevor Sie es wieder in den Inkubator einsetzen. Führen Sie nach zwei Tagen einen vollständigen Mediumwechsel mit erwärmtem DMEM+ durch, indem Sie das Medium aus der Schale ziehen.

Legen Sie die Spitze der Pipette vorsichtig auf die Innenwand und geben Sie einen Milliliter erwärmtes DMEM+ abFür die nachfolgenden Fütterungen ziehen Sie 500 Mikroliter Medium aus der Schale und geben Sie erneut 500 Mikroliter erwärmtes DMEM+ ab. Bei diesem Verfahren werden die Schalenproben alle zwei Tage unter einem Mikroskop untersucht, um nach einer Zellbedeckung über dem Array und einer Kontamination durch Bakterien oder Pilze zu suchen. Bevor Sie die Kulturen aus dem Inkubator nehmen, schließen Sie den Temperaturregler an und schalten Sie das System ein, sodass die beheizte Grundplatte des Vorverstärkers 35 Grad Celsius erreicht.

Platzieren Sie dann die verdeckelte Kultur in den Vorverstärker, so dass die schwarze Linie in der MEA-Vertiefung mit der Referenzmasse ausgerichtet ist. Stellen Sie sicher, dass die Pins des Vorverstärkers so ausgerichtet sind, dass die Oberseite des Vorverstärkers befestigt ist und die Kulturkappe noch aufgesetzt ist. Drücken Sie anschließend in der Softwareumgebung auf Start, um mit der Visualisierung der Signale zu beginnen.

Wählen Sie im Hauptfenster Spitzen, Erkennung, Automatisch aus, ändern Sie den Standardabweichungswert in minus fünf und klicken Sie auf Aktualisieren, um den Schwellenwert zurückzusetzen. Nachdem Sie die Signale visualisiert haben, klicken Sie auf Stopp, Aufnahme und Wiedergabe, um mit der Aufzeichnung der Aktivität zu beginnen. Embryonale Mausneuronen werden auf 60-Kanal-MEAs plattiert, die die gleichzeitige Aufzeichnung der neuronalen Aktivität über das Netzwerk von jeder Elektrode aus ermöglichen.

Hier ist ein repräsentatives Rasterdiagramm der Aktivität von acht Elektroden als Reaktion auf die Stimulation vor und nach dem Training. Die vertikale rote Linie zeigt den Zeitpunkt des Stimulus an, und die schwarzen Häkchen zeigen Aktionspotentiale an. Im Vortraining kommt es zu einer unmittelbaren Reaktion auf den Reizimpuls über alle Kanäle.

Nach dem Training zeigt das Netzwerk eine länger anhaltende Aktivitätsreaktion sowie die unmittelbare Reaktion auf die Stimulation. Hier ist der Durchschnitt von 12 trainierten und 10 Kontrollnetzwerken dargestellt, wobei die trainierten Netzwerke signifikant veränderte Spike-Frequenzen anzeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neuronales Gewebe von embryonalen Mäusen isoliert und assoziiert und in der Lage ist, neuronale Netzwerke aus Mikroelektrodenarrays zu kultivieren, aufzuzeichnen und zu stimulieren.