Quantifizierung der Bauchpigmentierung in Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die abdominale Pigmentierung bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster schnell zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Evolutionsbiologie zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung der genetischen Loci, die wiederum der vertrauensspezifischen Variationsmorphologie zugrunde liegen, und das Verständnis der Entwicklung und Evolution morphologischer Phänotypen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es dem Benutzer ermöglicht, verschiedene Aspekte der Bauchpigmentierung, einschließlich der Ausbreitung und Tiefe der Pigmentierung, zerstörungsfrei zu messen.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die abdominale Pigmentierung von Drosophila melanogaster geben kann, kann sie auch auf andere Drosophila-Arten angewendet und leicht angepasst werden, um Pigmentierungsmuster bei anderen Insekten und tierischen Taxa zu messen. Vor der Bildgebung können die Fliegen in 70%igem Ethanol gelagert werden, um ihre Pigmentierung zu erhalten. Für die Visualisierung ist ein Montagepad erforderlich.

Beladen Sie eine 60 Millimeter große Petrischale mit etwa 10 Millilitern 1,25%Agar in Wasser. Unter dem Mikroskop graben Sie mit einer feinen Pinzette einen 20 Millimeter langen, zwei Millimeter breiten und einen Millimeter tiefen Graben in das Gel. Es können mehrere Gräben in einem Gericht zubereitet werden.

Betten Sie dann die Fliegen in den Graben ein, wobei sich die zu analysierende Oberfläche direkt über der Geloberfläche befindet. In diesem Fall ist die dorsale Seite von Interesse. Füllen Sie nun die Schale mit 70% Ethanol, bis die Fliegen vollständig untergetaucht sind.

Dadurch werden Reflexionen von der Nagelhaut reduziert, die das Pigmentmuster verdecken können. Starten Sie nun die Bildgebungssoftware und die Digitalkamera, die mit dem Mikroskop verbunden sind. Für eine Lichtquelle ist kaltes Licht von einem Doppelschwanenhalsgerät ausreichend.

Stellen Sie in der Bildanalysesoftware den Bildtyp auf 8-Bit ein. Schalten Sie dann in der Bildaufnahmesoftware die Live-Einstellung um, um ein Ansichtsfenster der Kamera zu öffnen. Legen Sie den Bildtyp auf Graustufen fest.

Stellen Sie nun die Lichtquelle auf ihre maximale Intensität ein und positionieren Sie die Leuchten etwa 120 Millimeter vom Tisch entfernt. Stellen Sie das Mikroskop auf eine 60-fache Vergrößerung ein, sodass das Sichtfeld drei Millimeter breit ist. Platzieren Sie dann das zwei Millimeter große Tischmikrometer in das Sichtfeld und fokussieren Sie darauf.

Wenn Sie zur Software zurückkehren, stellen Sie die Belichtungszeit so ein, dass das Mikrometer mit dem Feld im Belichtungsfeld angezeigt wird. Stellen Sie dann den Maßstab ein. Öffnen Sie das Geradlinenwerkzeug und zeichnen Sie die Länge von zwei Millimetern entlang des Tischmikrometers.

Geben Sie dann diese Länge unter der Option "Maßstab festlegen" ein. Das Fenster sollte dann die Skala in Pixeln pro Mikrometer anzeigen. Notieren Sie sich die Skala und nehmen Sie die Einstellungen in Ordnung.

Kehren Sie nun zur Bildaufnahmesoftware zurück und verwenden Sie die Befehle Stopp und Einrasten, um ein Bild des Tischmikrometers aufzunehmen. Kehren Sie dann zur Bildanalysesoftware zurück und speichern Sie das Bild als Tiff-Datei. Konzentrieren Sie sich nun auf die dorsale Mittellinie einer montierten Fliege.

Die Mittellinie sollte gerade nach oben positioniert werden, um die besten Bildgebungsergebnisse zu erzielen. Schieben Sie die Flügel und alle anderen störenden Strukturen beiseite und stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass die Nagelhaut am besten beleuchtet wird. Stellen Sie als Nächstes die Belichtung in der Bildaufnahmesoftware ein, indem Sie das Pixelwert-Histogramm als Leitfaden verwenden, um den gesamten Pixelbereich des Bildes ohne Sättigung zu erfassen und so den Kontrast zu maximieren.

Behalten Sie diese Belichtung und Beleuchtung während des gesamten Experiments bei. Stellen Sie nun vor der Aufnahme eines Bildes sicher, dass die interessierenden Bauchsegmente zu sehen sind. Nehmen Sie dann ein Bild auf und speichern Sie das Bild mit der Beispiel-ID-Nummer im Dateinamen.

Verwenden Sie das Format, das im schriftlichen Protokoll beschrieben ist. Diese Analyse verwendet ein Makro, das von den Autoren zur Verfügung gestellt wurde. Die zu analysierenden Bildserien sollten sich alle im selben Dateiordner befinden.

Starten Sie nun das Makro und befolgen Sie die angeforderten Befehle. Identifizieren Sie zunächst den Speicherort der gespeicherten Dateien. Identifizieren Sie dann den Ort, an dem die Analysedaten gespeichert werden sollen.

Geben Sie anschließend die Anzahl der Zeichen ein, die in den Dateinamen verwendet wurden, damit die Software die Bildserie korrekt liest. Die nächste Eingabeaufforderung bezieht sich auf die Angabe der Breite des interessierenden Bereichs. Geben Sie hier die Anzahl der Pixel entlang des anterior-posterioren Streifens ein, die analysiert werden sollen.

Treffen Sie nun an der Eingabeaufforderung die Möglichkeit, das erste Bild der Serie zu analysieren. Die anderen Optionen sind, das nächste Bild in der Serie zu analysieren oder die Analyse zu beenden. Das Linienwerkzeug wird automatisch ausgewählt.

Verwenden Sie diese Option, um die Mittellinie auf dem Bild zu identifizieren, indem Sie eine Linie entlang der Mittellinie in anteriorer bis posteriorer Richtung zeichnen. Befolgen Sie als Nächstes die Makroanweisungen, um die hintere Kante von Tergite4 mit dem Linienwerkzeug zu identifizieren. Das Linienwerkzeug wird zur Verfügung gestellt, um die Linie von der hinteren Mittellinienkante zur rechten lateralen Kante zu ziehen, so dass die Mitte der Linie genau hinter der hinteren Kante des Pigmentbandes liegt.

Definieren Sie dann die vordere Kante von Tergite4 mit dem Linienwerkzeug. Ziehe eine Linie von der vorderen Mittellinienkante zur rechten Seitenkante. Die Mitte der Linie, die durch ein weißes Quadrat definiert wird, sollte am vorderen Rand der leicht pigmentierten Nagelhaut sitzen.

Mit diesen Informationen generiert das Makro nun ein Pigmentierungsprofil. Das Profil kann jedoch ungenau sein, wenn Borsten oder andere Schönheitsfehler den Streifen durchkreuzen, entlang dessen das Profil gemessen wird. Um dies zu korrigieren, wählen Sie die Live-Vorschau im Histogrammfenster aus und passen Sie die Linie so an, dass das Profil glatt ist.

Damit der Bildanalysestreifen die verschiedenen Aspekte der Pigmentierung genau erfassen kann, ist es wichtig, einen Analysebereich zu identifizieren, der nur minimales Rauschen aufweist, das durch Bild- oder Probenunregelmäßigkeiten verursacht wird. Fahren Sie nun mit der Analyse von Tergite3 im selben Bild fort und fahren Sie dann mit dem nächsten Bild fort. Mit dem beschriebenen Verfahren wurde eine bekannte Veränderung der Bauchpigmentierung durch die Aufzuchttemperatur untersucht.

Das dritte und vierte Tergite wurden mehrfach unter verschiedenen Licht- und Belichtungsverhältnissen untersucht. Dabei wurden verschiedene Aspekte der Pigmentierung untersucht. Konkret zeigte sich, dass die Pigmentbänder breiter waren, wenn Fliegen bei kühleren Temperaturen aufgezogen wurden.

Die berechneten Werte wurden dann mit allgemeinen subjektiven Messungen verglichen, die von fünf verschiedenen Beobachtern an denselben Fliegen durchgeführt wurden. Bei der Bewertung von 45 weiblichen Fliegen wurde die durchschnittlich beobachtete Rangfolge der Breite des vierten abdominalen Pigmentbandes eng mit der automatisierten Messung des Makros korreliert. Dieselbe Pigmentbande wurde auch manuell mit einer Bildgebungssoftware gemessen.

Diese Ergebnisse korrelierten auch stark mit Messungen, die mit dem Makro generiert wurden. Die Software wurde dann getestet, um die Pigmentierung in weiblichen Ebenholzmutanten zu messen, von denen bekannt ist, dass sie eine erhöhte Pigmentierung in der dritten und vierten Pigmentbande aufweisen. Die Methode wurde auch zur Messung des fünften und sechsten Abdominalbandes von Wildtyp-Weibchen verwendet.

Die automatisierte Technik lieferte immer nützliche Messungen der Pigmentdichte und der Bandengröße. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bauchpigmentierung bei Drosophila schnell und präzise quantifizieren können. Die Beherrschung der Technik erfordert meist den Tiefeneinsatz einer Pinzette.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann der bildgebende Teil dieser Technik mit einer Geschwindigkeit von 50 Proben pro Stunde durchgeführt werden. Die Extraktion der Pigmentierungsmaße aus diesen Bildern kann mit einer Geschwindigkeit von 70 Bildern pro Stunde erfolgen.