Metabolische Glykan der Sialinsäure Säure mit N-Acyl-Mannosamines geändert

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Zellen oder zellabgeleitete Produkte mit modifizierter Sialinsäureexpression zu erzeugen. Daher werden die Zellen mit N-Acyl-modifizierten Mannosaminen behandelt, die zu den entsprechenden Sialinsäuren metabolisiert und anschließend auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Glykobiologie zu beantworten, wie z.B. den Einfluss von Glykokonjugaten auf Rezeptor-Liganden-Interaktionen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach anzuwenden und rein zytotoxisch ist. Um metabolisches Glykoengineering zu demonstrieren, werden wir N-Acetylmannosamin verwenden, das kommerziell verfügbar ist. Darüber hinaus werden wir die Synthese und Verwendung von N-Propionyl und N-Butanoylmannosamine demonstrieren.

Es werden die biologischen Auswirkungen des metabolischen Glykoengineerings auf die Expression von Polysialinsäure gezeigt. Lösen Sie zunächst 431,2 Milligramm Mannosaminhydrochlorid in 10 Millilitern drei Millimolar Natriummethoxidlösung in einer 15 Milliliter Glasflasche auf, die einen Rührstab enthält. Die Mischung auf Eis auf null Grad Celsius abkühlen lassen.

Unter Rühren langsam 210 Mikrometer Propionylchlorid tropfenweise in die Lösung geben. Dann die Rührmischung vier Stunden lang bei null Grad Celsius inkubieren. Füllen Sie anschließend die Lösung in ein 50-Milliliter-Plastikröhrchen um und stechen Sie mit einer dünnen Nadel vier bis 8 Löcher in den Deckel des Röhrchens.

Frieren Sie die Lösung schnell mit flüssigem Stickstoff ein. Anschließend wird die Probe lyophilisiert, bis sie vollständig getrocknet ist. Nach der Lyophilisierung lösen Sie das getrocknete Produkt in Ethylacetat, Methanol und Wasser auf.

Laden Sie die Lösung mit einer Pipette auf eine zuvor vorbereitete Kieselgelsäule. Nach dem Eluieren von 500 Millilitern Lösungsmittel werden vier Milliliterfraktionen gesammelt. Übertragen Sie die eluierten Fraktionen in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen und stechen Sie mit einer dünnen Nadel drei bis sechs Löcher in den Deckel des Röhrchens.

Nach dem Einfrieren der Lösung mit flüssigem Stickstoff wird die Probe lyophilisiert, bis sie vollständig getrocknet ist. Kultivieren Sie Kelly-Neuroblastomzellen in RPMI-Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Vor der Anwendung der Mannosamine lösen Sie die Kelly-Neuroblastomzellen ab, indem Sie sie 10 Minuten lang mit Trypsin und EDTA inkubieren.

Nach der Neutralisierung des Trypsins mit RPMI-Medium werden die Zellen mit einer Neubauer-Kammer gezählt. Um Sialinsäuremonosaccharide zu messen, setzen Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Medium in eine 48-Well-Gewebekulturplatte. Für die Analyse von Polysialinsäuren setzen Sie die Zellen in drei Millilitern Medium auf eine Zellkulturschale mit einem Durchmesser von sechs Zentimetern.

Geben Sie die jeweiligen Mannosaminderivate, gelöst in RPMI, in einer Endkonzentration von fünf Millimolar zu den frisch plattierten Zellen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium, das die N-Acyl-modifizierten Mannosamine enthält, alle 24 Stunden ausgetauscht wird. Nach der Behandlung das Medium dekantieren und die Zellen mit PBS waschen. Trennen Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang mit Trypsin und EDTA inkubieren.

Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie den abgelösten Zellen das gleiche Volumen an Zellkulturmedium hinzufügen. Anschließend werden die abgelösten Zellen in 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen überführt. Die Proben werden drei Minuten lang bei 500 mal G zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Zellen dreimal mit fünf Millilitern PBS gewaschen.

Nach der Zentrifugation werden die gesammelten Zellpellets in 500 Mikrolitern eiskaltem HPLC-Lysepuffer resuspendiert. Ultraschall der Proben mit einer Ultraschall-Prozessornadel dreimal für einen Zeitraum von 30 Sekunden bei mittlerer bis hoher Amplitude und Abkühlen der Proben auf Eis für mindestens eine Minute zwischen den Zyklen. Nach dem Zentrifugieren der lysierten Zellproben trennen Sie den Überstand von den Membranfraktionen in 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Für die Säurehydrolyse geben Sie 150 Mikroliter einer molaren TFA-Lösung zu den getrennten Membranfraktionen. Inkubieren Sie die Proben vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 bis 600 U/min. Anschließend werden die Proben in 0,5 Milliliter große Filterröhrchen mit drei Kilodalton-Ausschlussmembranen transportiert.

Die Proben werden etwa 30 Minuten lang bei 20.000 G und 21 Grad Celsius zentrifugiert, bis das Volumen der oberen Phase weniger als 20 Mikroliter beträgt. Anschließend entsorgen Sie die Einsätze und stechen mit einer dünnen Nadel zwei bis vier Löcher in die Kappen der Röhrchen, die das Ultrafiltrat enthalten. Nach dem Einfrieren der Proben mit flüssigem Stickstoff wird sie über Nacht lyophilisiert.

Die getrockneten Proben werden in 10 Mikrolitern 120 millimolare TFA-Lösung resuspendiert und 50 Mikroliter DMB-Lösung hinzugefügt. Füllen Sie die Proben in dunkle 1,5-Milliliter-Röhrchen um, um sie vor ultraviolettem Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Zellmembranproben und -standards 1,5 Stunden lang bei 56 Grad Celsius.

Nach der Inkubation fügen Sie jeder Probe vier Mikroliter 400 Millimolare Natriumhydroxidlösung hinzu, um die Markierungsreaktion zu stoppen. Stellen Sie für die HPLC-Analyse die Temperatur der Säule auf 40 Grad Celsius ein und konfigurieren Sie den Fluoreszenzdetektor auf 373 Nanometer für die Anregung bzw. 448 Nanometer für die Auslassung. Injizieren Sie 10 Mikroliter Probenvolumen und trennen Sie die Sonden 15 Minuten lang bei einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute mit Methanol, Acetonitril und Wasser als Eluant.

Für die massenspektrometrische Analyse injizieren Sie 20 Mikroliter jeder gesammelten HPLC-Probe in ein massenselektives LC-Detektorsystem. Wählen Sie in der Auswertesoftware des massenselektiven LC-Detektorsystems den interessierenden Peak im Gesamtionenchromatogramm aus. Zeigen Sie das Massenspektrum des aufgelösten Peaks an und zeigen Sie das positive Masse-Ladungs-Verhältnis zwischen 300 und 700 an.

Fügen Sie einen Milliliter Western-Blot-Lysepuffer zu den zuvor vorbereiteten Pellets der glykotechnologisch hergestellten Zellen hinzu und wirbeln Sie ihn auf. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie sie alle fünf Minuten vortexen. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben 1,5 Stunden lang bei 20.000 G und vier Grad Celsius.

Sammeln Sie dann den Überstand mit den Proteinen aus den lysierten Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Bereiten Sie die Proben für die SDS-Seite vor, indem Sie 10 Mikroliter Laemmli-Probenpuffer zu 90 Mikrolitern jeder Proteinfraktion hinzufügen. Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang.

Nachdem Sie die Proben auf ein 8%iges SDS-Acrylamid-Gel geladen haben, lassen Sie das Gel zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei 25 Milliampere laufen. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie vorsichtig die Glasabdeckung vom Gel und schneiden Sie den oberen Teil des Gels aus, in dem sich die Ladetaschen befinden. Als nächstes geben Sie das Gel auf eine 0,2-Mikro-Nitrozellulose-Membran, die zuvor in Western-Blot-Puffer eingeweicht wurde.

Übertragen Sie die Proteine gemäß der Empfehlung des Systems auf die Nitrocellulose. Nachdem Sie die Nitrozellulosemembran aus dem Blotting-System entfernt haben, färben Sie den Blot mit Ponceau rot, um die Proteine sichtbar zu machen und dadurch die Qualität des Transfers zu kontrollieren. Übertragen Sie dann die Nitrozellulosemembran in eine Kunststoffkammer und fügen Sie 10 Milliliter Blocklösung hinzu.

Nach dem Inkubieren der Nitrozellulosemembran wird die Blockierungslösung dekantiert und der monoklonale Antipolysialinsäure-735-Antikörper in PBS hinzugefügt. Waschen Sie die Membran nach der Inkubation mindestens dreimal für fünf Minuten mit PBS. Fügen Sie nun der Nitrozellulosemembran einen polyklonalen Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper hinzu, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist.

Nach dem Inkubieren und Waschen der Membran wird sie auf eine Platte eines geeigneten Imagers übertragen. Erfassen Sie dann das Signal gemäß den Anweisungen des Herstellers. DMB-markierte N-Glykolyl-Neuraminsäure, eluiert zwischen sieben und neun Minuten.

Und DMB-markierte N-Acetyl-Neuraminsäure eluiert zwischen 10 und 12 Minuten. Mehrere kleinere Peaks, die im Chromatogramm beobachtet wurden, stellen nicht umgesetzte DMB und Reaktionszwischenprodukte dar. Die HPLC-Chromatogramme der Zelllysate zeigen mehrere undefinierte Peaks, die interne Verunreinigungen und DMB-Nebenprodukte aus der Reaktion mit anderen Alpha-Ketosäuren darstellen, die in den Zelllysaten vorhanden sind.

Die Behandlung mit N-Acetylmannosamin führt häufig zu einer Erschöpfung der N-Glykolylneuraminsäure auf der Zelloberfläche. In Chromatogrammen von lysierten Zellen, die mit N-Propionylneuraminsäure oder N-Butanoylneuraminsäure behandelt wurden, werden Peaks beobachtet, die auf das Auftreten der entsprechenden nicht-natürlichen Sialinsäuren hinweisen. Die Reaktion von DMB mit Sialinsäurespezies führt zu einer Zunahme der Molekülmasse um 116,2 Dalton im Vergleich zu den Sialinsäurespezies, die nicht mit diesem Farbstoff markiert sind.

Neben den potenzierten Ionenspezies werden auch die Natriumaddukte beobachtet. DMB-Neu5Gc eluiert kurz nach den nicht oder nur teilweise umgesetzten DMB-Spezies, was das Auftreten von undefinierten Peaks im Massenspektrum von DMB-Neu5Gc erklärt. Die Behandlung von Kelly-Neuroblastomzellen mit N-Propionylmannosamin oder N-Butanoylmannosamin führt zu einer verminderten Expression von Polysiatsäure auf der Zelloberfläche.

Behandlung mit N-Acetylmannosamin führt hingegen zu einer erhöhten Expression der Polysiatsäure. Durch die Anwendung dieser Technik können Zellen mit vollständiger Sialylierung innerhalb weniger Tage erzeugt werden. Solche glykotechnologisch hergestellten Zellen können in weiteren Experimenten verwendet werden.

Zum Beispiel, um Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu untersuchen oder, wie hier gezeigt, um die Expression von Polysiatsäure zu hemmen. Das hier vorgestellte Verfahren des Metabolic Engineering ist für Sialinsäure-Experimente optimiert. Das gleiche Verfahren kann aber auch im Tierversuch angewendet werden.

Wir hoffen, dass unser vorgestelltes Protokoll und diese Videoproduktion eine Hilfe für die Autoren ist, um metabolisches Glykoengineering in die Labore zu bringen, um die Funktion und auch die biologische Rolle von Sialinsäure und Sialinsäurerezeptoren in biologischen Systemen zu analysieren. Organische Chemiker könnten N-Acyl-modifizierte Mannosamine mit komplexeren Strukturen synthetisieren und diese wie in unserem Protokoll vorgeschlagen verwenden. Gemäß unserem Protokoll sollten alle Proben unmittelbar nach der Fluoreszenzmarkierung analysiert werden.

Folglich sollte es keine Verzögerung zwischen HPLC- und ACMS-Analysatoren geben.