Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, ein Protokoll für die Mikroinjektion des Gehirns mit einer personalisierten, wiederverwendbaren Quarznadel zu verfeinern, die keine nachweisbaren Gewebeschäden verursacht und eine zuverlässige Verabreichung auch in tiefen Regionen gewährleistet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Pathophysiologie neurodegenerativer und psychiatrischer Erkrankungen und die Auswirkungen der Gen- und Zelltherapie über virale Vektoren und Zelltransplantate. Der Hauptvorteil besteht darin, dass diese Nadeln keine nachweisbaren Gewebeschäden erzeugen, was eine zuverlässige Abgabe in tiefe Hirnregionen gewährleistet.

Sie sind kostengünstig, da sie gereinigt und wiederverwendet werden können. Um diesen Vorgang zu beginnen, reinigen und sterilisieren Sie die Quarzkapillaren, indem Sie sie fünf Minuten lang in destilliertes Wasser legen. Fünf Minuten in 99 % Ethanol, gefolgt von fünf Minuten in Diethylether.

Lassen Sie dann die Kapillaren mindestens eine Stunde lang vollständig unter der Haube trocknen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die langen und dünnen Nadeln mit einem Laserabzieher vor. Legen Sie dann die Nadeln in eine Petrischale, die zuvor mit 70 % Ethanol gereinigt wurde.

Decken Sie die Schale mit einer Paraffinfolie aus Kunststoff ab. Als nächstes schneiden Sie die Kapillaren am Mikrodissektor. Fixieren Sie die Nadel fest auf dem Mikroskoptisch und positionieren Sie ihre Spitze in der Mitte des Computerbildschirms.

Klicken Sie in der Menüleiste auf das Bleistiftsymbol und zeichnen Sie damit eine Markierung für die zu schneidende Nadel. Wählen Sie in der Seitenleiste die Flagge mit der Schaltfläche Schnitt starten, damit der Laser die zuvor markierte Stelle schneiden kann. Schneiden Sie bei Bedarf die seitlichen Löcher, indem Sie eine Markierung zeichnen und den Schnittvorgang wiederholen, ohne die Nadel neu zu positionieren.

Nachdem Sie die Nadel geschnitten haben, schließen Sie sie über einen Kunststoffschlauch an eine Hohlraumpumpe an. Schalten Sie anschließend die Pumpe ein und stellen Sie die Durchflussmenge manuell auf drei Mikroliter pro Minute ein. Saugen Sie dann das 99%ige Ethanol gefolgt von dem destillierten Wasser an, um Verunreinigungen durch das Schneiden zu entfernen.

Danach das 99%ige Ethanol erneut ansaugen, um die Trocknung zu erleichtern. Bewahren Sie die Nadeln anschließend bis zum Tag der Operation in einer gut abgedeckten Petrischale auf. Um die Nadeln wiederzuverwenden, reinigen Sie sie am Ende des Experiments mit den entsprechenden Reinigungsmitteln und 70%igem Ethanol, um die injizierte Lösung und mögliche Geweberückstände zu entfernen.

Bei Bedarf können diese Nadeln sogar in speziellen Gläsern gekocht werden, die mit destilliertem Wasser gefüllt sind. Wählen Sie in diesem Schritt das Einstellungsmenü, um die Pumpe entsprechend dem Durchmesser pro Volumen der Mikroinjektionsspritze zu kalibrieren. Und stellen Sie die Durchflussmenge auf 0,3 Mikroliter pro Minute ein.

Füllen Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze mit sterilem Wasser. Und verwenden Sie es, um die Mikroinjektionsspritze und den Injektionsbaugruppensatz für die manuelle Mikroninjektionspumpe zu füllen. Verbinden Sie danach die Nadel mit dem manuellen Mikroinjektionspumpen-Kit.

Trennen Sie die 10-Milliliter-Spritze von der Mikroinjektionsspritze, während Sie den Kolben langsam drücken, um einen Wassertropfen an der Oberseite der Mikroinjektionsspritze zu hinterlassen. Führen Sie dann den Kolben in die Mikroinjektionsspritze ein. Schließen Sie nun die Mikroinjektionsspritze an die Pumpe an und stellen Sie die Durchflussmenge auf 0,3 Mikroliter pro Minute ein.

Sie anschließend die Durchflussrate auf 0,1 Mikroliter pro Minute und beginnen Sie mit dem chirurgischen Eingriff. Um die Operation durchzuführen, rasieren Sie den Kopf des Tieres und reinigen Sie ihn mit einem Alkoholtupfer. Positionieren Sie als Nächstes die Ratte im stereotaktischen Rahmen.

Machen Sie mit einem sterilisierten Skalpell einen Längsschnitt über den Schädel. Seien Sie vorsichtig, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Öffnen Sie anschließend die Kopfhaut mit einem flachen Spatel und kleben Sie chirurgische Klammern auf die Hautlappen, um sie offen zu halten.

Lösen Sie sehr vorsichtig das Periost, um das Bregma und den Bereich des Schädels, durch den die Nadel eingeführt wird, freizulegen. Montieren Sie anschließend den Arm auf den stereotaktischen Rahmen und bewegen Sie die Spitze der Nadel direkt über das Bregma, wobei Sie darauf achten, dass die Spitze nicht bricht. Annotieren Sie die anteroposterioren und medialen lateralen Koordinaten des Bregmas und bewegen Sie die Nadel auf die gewünschten Koordinaten.

Senken Sie dann die Nadel ab, bis ihre Spitze fast den Schädel berührt, und markieren Sie die Bohrstelle, nachdem Sie den stereotaktischen Arm ein wenig angehoben haben. Bohren Sie den Schädel an der markierten Stelle und achten Sie darauf, die Hirnhäute und das Gehirn nicht zu beschädigen. Schneiden Sie als nächstes ein kleines Stück Paraffinfolie aus Kunststoff ab und legen Sie es auf den Schädel.

Mit der 10-Mikroliter-Pipette einen Tropfen der Lösung auf den Paraffinfilm aus Kunststoff auftragen. Stoppen Sie die Pumpe, ziehen Sie den Drücker der Pumpe leicht zurück und erzeugen Sie eine kleine Luftblase in der Kapillare, indem Sie vorsichtig am Kolben der Mikroinjektionsspritze ziehen. Senke die Spitze der Nadel ab, bis sie den Tropfen erreicht.

Entnehmen Sie die Probe, indem Sie den Kolben der Mikroinjektionsspritze sehr langsam ziehen, um Blasenbildung zu vermeiden. Tauschen Sie den Pumpenschieber in Kontakt mit dem Kolben aus und schalten Sie die Pumpe mit einer Durchflussmenge von 0,3 Mikrolitern pro Minute ein. Warten Sie dann, bis sich ein Tropfen gebildet hat, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

Verringern Sie anschließend den Durchfluss auf 0,1 Mikroliter pro Minute. Kerben Sie die Dura mit einer Nadel aus Edelstahl mit abgeschrägter Spitze ein und senken Sie die Nadel langsam ab, um in das Hirngewebe einzudringen. Wenn die gewünschte Position erreicht ist, gehen Sie weitere 0,1 Millimeter nach unten und stoppen Sie dann die Pumpe.

Heben Sie den stereostatischen Arm um 0,1 Millimeter an und starten Sie die Pumpe wieder mit 0,3 Mikrolitern pro Minute. Starten Sie danach den Timer und die Injektion. Überwachen Sie die Bewegung der Blase während der Injektion.

Stoppen Sie am Ende die Pumpe und warten Sie fünf Minuten, bevor Sie die Nadel langsam herausholen. Wenn die Quarznadel vollständig herausgezogen ist, starten Sie die Pumpe erneut und prüfen Sie, ob sich an der Spitze der Nadel ein Tropfen gebildet hat. Versiegeln Sie anschließend die Öffnung in der Schädeloberfläche mit Knochenwachs.

Entfernen Sie die homöostatischen Klammern und nähen Sie die Kopfhaut. Bestreichen Sie den Bereich um die Wunde mit einer antibiotischen Creme und bringen Sie das Tier in den Heimkäfig zurück. Dies sind die acht Mikrometer großen koronalen Schnitte des Rattengehirns auf Striatum-Ebene.

Dieses Bild zeigt die Schäden, die durch die Injektion von zwei Mikrolitern ACSF mit einer 26-Gauge-Edelstahlnadel mit stumpfem Ende verursacht werden. Umgekehrt zeigte das Striatum, das mit einer Quarznadel injiziert wurde, keine nachweisbaren Schäden. Diese anderen Bilder zeigen die Schäden, die durch die beiden Nadeln auf Höhe des dorsalen Hippocampus verursacht wurden.

Die Quarznadel verursachte jedoch keine erkennbaren Schäden. Erfolgreiche Injektionen mit beiden Nadeln zeigte sich an der Verteilung von Trypanblau. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nach diesen Verfahren kann alles, was wichtig ist, wie z.B. zusätzliche Operationen, durchgeführt werden, um verschiedene Fragen wie die medikamenteninduzierte Wirkung zu beantworten. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um die Wirkung von Toxinen und Medikamenten und in jüngerer Zeit von Gen- und Zelltherapieprodukten in Tiermodellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Mikroinjektionen in tieferen Gehirnregionen ohne nachweisbare Läsionen mit personalisierten Quarznadeln durchführen können.

Vergessen Sie nicht, dass die Verwendung von laserdisparierten Reagenzien und/oder Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann. Und Vorsichtsmaßnahmen wie Laserschutzverfahren und persönliche Schutzausrüstung sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.