Ein integriertes System aus der Ferne intrazelluläre Signaltransduktion von Großbildschirmen Nanoparticle vermittelte Kinase Photoaktivierungen auslösen

Ziel dieses Experiments ist es, die Machbarkeit der Photoaktivierung von Enzymen mittels Nahinfrarotstrahlung zu demonstrieren. Die Caged-Proteinkinase A ist auf dieser Oberfläche von Upconversion-Nanopartikeln immobilisiert, die in Zellen mikroinjiziert werden, und eine Kinase-induzierte Reaktion in lebenden Zellen wird nach Nahinfrarotbestrahlung beobachtet. Traditionelle Photoaktivierung erfordert phototoxisches UV-Licht und induziert unweigerlich unerwünschte chemische Reaktionen und ähnliche Reaktionen, jedoch in unseren freundlichen Optionen, wie z. B. Nahinfrarotstrahlung, kann aufgrund ihrer geringen Energie keine Reaktion auslösen.

Das Aufwärtskonversions-Nanopartikel kann biofreundliche niederenergetische Photonen in der Nähe des IR effektiv in hochenergetische UV-Photonen umwandeln, um eine chemische Reaktion in der Nähe der Partikeloberfläche ohne direkte UV-Bestrahlung auszulösen. Kinase spielt eine Schlüsselrolle bei der Onkogenese, diese Technik kann uns helfen, mehr Signaltransduktionsinformationen mit viel geringerem Störrauschen durch UV-Phototoxizität und ihre Nebenreaktion zu untersuchen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu auf diesem Gebiet sind, Schwierigkeiten haben, Instrumente und optische Setups für Aufwärtskonvertierungsanwendungen zu modifizieren.

Zu Beginn wird eine 4-fach-Objektivlinse neben dem Küvettenhalter des Fluorostrometers installiert, so dass der Laser in der Mitte der Küvette fokussiert werden kann. Platzieren Sie eine abstimmbare 980-Nanometer-Laserdiode in einem Winkel von 90 Grad gegen die Objektivlinse. Installieren Sie einen Vollreflexionsspiegel und den Strahlengangschnittpunkt zwischen Objektivlinse und Laser.

Vergessen Sie nicht, eine eloxierte Metallplatte zu platzieren, um das Anregungsfenster des Spektrometers zu blockieren und die Innenteile zu schützen. Legen Sie dann eine Küvette mit siliziumdioxidbeschichteter Upconversion-Nanopartikellösung in den Halter. Ein heller Aufwärtskonversionsstrahl kann sichtbar gemacht werden, wenn sich der Laser einschaltet.

Schalten Sie die Spektroskopie in den Lumineszenzmodus mit der niedrigsten PMT-Spannung während der Ausrichtungen. Stellen Sie den Spiegel- und Lasertisch so ein, dass der Strahl durch die Mitte der Küvette verläuft, damit der PMT das stärkste Signal aufnimmt. Nach der Installation eines dichroitischen Spiegels und eines Anregungsfilters installieren Sie eine 980-Nanometer-Laserdiode im Strahlengang der unteren Ebene.

Fügen Sie einen Kollimator zwischen dem Laser und dem Spiegel hinzu, um den NIR-Strahlungsbereich in der Fokusebene zu diffundieren und zu vergrößern. Verwenden Sie dann eine Aufwärtskonversions-Nanopartikellösung, um den nahen Infrarotstrahl sichtbar zu machen. Passen Sie die Position des Lasertisches an, um den Nahinfrarotlichtstrahl zu zentrieren und die Ausrichtung abzuschließen.

Führen Sie eine caged-PKA-Synthese durch und demobilisieren Sie den caged-PKA/UCNP, um caged-PKA/UCNP zu erzeugen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Aktivität beider Konstrukte vor der UV-Photolyse zu messen, messen Sie die Abnahme der NADH-Absorptionsmittel in der Assay-Mischung im Laufe der Zeit nach der Zugabe von zwei Mikrolitern PKA-Lösung zur Assay-Mischung. Wiederholen Sie die Messung für PKA/UCNP.

Führen Sie anschließend eine UV-Photolyse mit 200 Milliwatt pro Quadratzentimeter von Caged-PKA und Caged-PKA/UCNP in einem Eiswasserbad durch, um sicherzustellen, dass PKA aktiviert werden kann. Die PKA-Aktivität wird durch einen Pyruvatkinase-Laktat-Dehydrogenase-Enzym-gekoppelten Assay bestimmt. Mit einer Abnahme der NADH-Absorptionsmittel wird im Laufe der Zeit nach der Zugabe von PKA-Lösung gemessen.

Inkubieren Sie die Zellen während der Mikroinjektionsphase in 10 % fötalem Rinderserum, das L15-Medium enthält, um eine stabile pH-Kontrolle außerhalb des Inkubators zu gewährleisten. Konfigurieren Sie den Nadelabzieher für eine kegelförmige Spitze mit einem Durchmesser von ca. 1,5 Mikrometern für das spätere Öffnen der Spitze. Um die Spitze zu öffnen, setzen Sie die Nadel auf den Mikroinjektor, bewegen Sie die Nadelspitze in Kontakt mit dem Rand eines Objektträgers und folgen Sie mit einem leichten Knopf auf dem Mikroskoptisch.

Diese Vibrationskraft reicht aus, um die Spitze leicht zu brechen und die Öffnung zu vergrößern. Untersuchen Sie die Nadelöffnung, um sicherzustellen, dass sie einen Außendurchmesser von 1,3 bis 1,5 Mikrometern hat, der durch Mikroskopbilder mit einer 40-fach-Objektivlinse bestätigt werden kann. Als nächstes wird der Injektionsdruck von 50 bis 75 Hektopascal mit einem Druckintervall von 200 bis 300 Millisekunden eingestellt und der konstante Ausgleichsdruck auf 15 bis 30 Hektopascal eingestellt, um einen Rückfluss des Mediums in die Nadel zu verhindern.

Laden Sie den Caged-PKA/UCNP-Komplex mit dem TAMRA-Farbstoff in die hintere Position der Nadel. Die geladene Nadel wird dann auf einem einachsigen hydraulischen Mikromanipulator mit einem Winkel von 30 Grad bis 45 Grad aufgestellt. Überprüfen Sie die Nadel mit dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass nach dem Laden der Probe keine Blase entsteht.

Wechseln Sie nach dem Eintauchen der Nadel in das Medium in den Fluoreszenzmodus, um eine deutliche Freisetzung des Farbstoffs bei Anwendung des Injektionsdrucks und eine langsame Freisetzung des Farbstoffs bei konstantem Ausgleichsdruck zu bestätigen. Wechseln Sie dann in den phasenkontrastierten Hellfeldmodus, um die Mikroinjektion der Zellen zu starten. Die Membranstoßwelle kann bei erfolgreichen Injektionen beobachtet werden.

Waschen Sie die Zellen zweimal und überprüfen Sie die injizierten Zellen auf co-injizierte TAMRA-Fluoreszenz, um die mikroinjizierten Zellen erfolgreich zu lokalisieren. Zellen mit UCNP-Zulassung, aber ohne co-injiziertes Farbstoffsignal, deuten darauf hin, dass die Zellmembran während der Injektion gerissen wurde und sollte von weiteren Experimenten ausgeschlossen werden. Bestrahlen Sie die Zellen 15 Minuten lang mit einer 980-Nanometer-Laserdiode im unteren Lichtgang, der von einer 10-fachen Objektivlinse fokussiert wird.

Lassen Sie nach jeweils fünf Minuten Bestrahlung ein fünfminütiges Dunkelintervall ein, um eine Erwärmung zu vermeiden. Wenn eine kürzere Aktivierungszeit benötigt wird, z. B. Sekunden oder sogar Subsekunden, wechseln Sie einfach zu einer 40-fach-Objektivlinse, um eine höhere Photonendichte zu erzielen. Nach der Photolyse und Zellwiederherstellung fixieren Sie die Zellen 20 Minuten lang in einem Milliliter oder 4% Paraformaldehyd in PBS, bevor weitere Alexa 594 innerhalb der Färbung folgten.

Visualisieren Sie schließlich den NIR-induzierten Zerfall der Stressfasern. Nach NIR-Bestrahlung zeigen Zellen, die mit Cage-PKA/UCNP mikroinjiziert wurden, wie durch weiße Pfeile angezeigt, eine Aufwärtskonversionsemission. Der Zerfall der Stressfasern, der durch eine erfolgreiche PKA-NIR-Photoaktivierung verursacht wird, legt mehr Aktin frei und führt folglich zu einer starken Grünfärbung in der Nähe von UCNP.

Eine Negativkontrolle, bei der die Zellen mikroinjiziert werden, aber im Dunkeln bleiben, zeigt keinen Zerfall der Stressfasern. Das Ausmaß der Factin-Exposition nach NIR-Photoaktivierung kann mit alexa 594 gefärbt werden, gefolgt von Bild J und quantifiziert durch Bild J. Die Intensitätskurven der Factinfärbung entlang des roten Pfeils wurden aufgetragen und liefern quantitative Informationen über den Desintegration von Stressfasern, die mit der NIR-induzierten PKA-Aktivität korreliert werden können. Sobald man sich mit der Mikroinjektion vertraut gemacht hat, kann diese Technik innerhalb eines Tages durchgeführt werden, einschließlich der Vorbereitung und der Qualitätskontrolle von Caged-PKA/UCNP.

Mit unseren Anweisungen für unsere Gerätemodifikationen und die Experimente kann die gewünschte Reaktion durch Nahinfrarot ausgelöst werden, in hoher räumlicher zeitlicher Auflösung, wie es bei herkömmlichen UV-Titrationsmethoden der Fall ist, aber ohne die Phototoxizität ist sie nicht ansteckend. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Enzym-Nanopartikel-Komplex durch Mikroinjektion in eine Zelle einbringt und das Enzym mit Glocken-kompatiblem Nah-IR-Licht photoaktiviert. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der chemischen Biologie, die Licht verwenden müssen, um die gewünschte enzymatische Reaktion in lebenden Zellen für eine räumliche zeitliche Auflösung auszulösen, wenn die Zelle keine UV-Phototoxizität tolerieren kann.

Nach diesem Verfahren können andere Bio-Affektoren mit Aufwärtskonversions-Nanopartikeln assoziiert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, die eine räumlich-zeitliche Photoaktivierung erfordern. Wenn der Bio-Affektor extrazellulär arbeitet, ist eine Mikroinjektion nicht einmal erforderlich. Die Nahinfrarot-Photoaktivierungsplattform kann auch für eine höhere Eindringtiefe in das Gewebe sorgen und kann daher bei Kleintieren eingesetzt werden, um gewünschte Reaktionen zum gegebenen Zeitpunkt und Ort auszulösen.