Name: Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie die subpiale AAV9-Vektorlieferung zur Gentherapie im Rückenmark erwachsener Mäuse. Diese Methode ermöglicht potente Transgenexpression in grauer und weißer Substanz für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

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Diese Studie wurde von der Stiftung SANPORC und ALSA Foundation (Martin Marsala) unterstützt; Das Nationale Nachhaltigkeitsprogramm, Projektnummer LO1609 (tschechisches Ministerium für Bildung, Jugend und Sport); Und RVO: 67985904 (Stefan Juhas und Jana Juhasova).

Diese Studien wurden im Rahmen eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, San Diego, genehmigt wurde und in Übereinstimmung mit der Vereinigung für die Bewertung von Labortierpflegerichtlinien für Tiernutzung war. Alle Studien wurden so durchgeführt, dass Gruppengröße und Tierleiden minimiert wurden. 1. Allgemeine tierische und chirurgische Vorbereitung <ol><li> Vor Beginn des chirurgischen Eingriffs das Virus auftauen (AAV9-UBI-GFP; 5 μl Aliquote) 8 . Eine 5% Dextran (10.000 MW) Lösung durch Mischen von Dextranpulver in destilliertem Wasser vorbereiten. Mischen Sie die Viruslösung mit 5% Dextranlösung 1: 1 auf eine endgültige Dextrankonzentration von 2,5%. <ol><li> Die Viruslösung auf Eis (4 ° C) aufbewahren. </li></ol></li><li> Verwenden Sie erwachsene C57BL / 6J Mäuse (männlich und weiblich, 20-30 g). Die Mäuse mit 5% Isofluran (in O 2 , 1 L / min) betäubt und bei 2 aufbewahren-3% inhaliertes Isofluran (in O 2 , 1 L / min) durch Nasenkonus während der Operation, abhängig von der Atemfrequenz und der Tatzendruckreaktion. </li><li> Rasieren Sie die Rückseite der Tiere mit Rasierklammern und reinigen Sie die Haut mit 2% Chlorhexidin. </li><li> In chronischen Erholungsstudien folgen eine strenge sterile Technik. </li><li> Wenn lumbale subpiale Injektionen durchgeführt werden sollen, schneide die Haut über die Th8-L1 Wirbel mit einem Skalpell und löst den paravertebralen Muskel von Th10-12 Wirbelsäule mit Schere. <ol><li> Montieren Sie das Tier in einen Standard-Stereotax-Rahmen mit Maus-Wirbelsäulen-Klemmen. </li><li> Rasieren Sie die beiden Seiten der Lamellen der Th10-12 Wirbel mit einem Zahnbohrer (Bohrer: 0,9 mm, Geschwindigkeit: 20.000 U / min), bis Risse auftreten. </li><li> Entfernen Sie geknackte Knochenfragmente mit einer Pinzette und setzen Sie die dorsale Oberfläche des Lendenwirbels ab. </li><li> Die Dura ca. 1 cm mit einer 30 G Edelstahl Nadel und Pinzette aufschneiden. </li></ol></li><li><sTrong&gt; Wenn zervikale subpiale Injektionen durchgeführt werden sollen, die dorsale Halshaut 1,5-2 cm mit einer Schere einführen und die C1-C2-Segmente freilegen. <ol><li> Entfernen Sie die atlanto-occipital Membran der cisterna magna mit einer 23G Edelstahl Nadel und Pinzette. </li><li> Reinigen Sie die Inzisionsstelle von Gewebe- und Knochenschutt mit Wattestäbchen. </li><li> Die Dura ca. 2-3 mm mit einer 30 G Edelstahl Nadel und Pinzette aufschneiden. </li></ol></li></ol> 2. Eröffnung der Pial Membran und Einsetzen der Subpial Nadel für AAV9 Lieferung <ol><li> Montieren Sie die 34 G-Pia-penetrierende Nadel in den Z-Arm eines XYZ-Manipulators mit einem Glas-Kapillar-Halter ( Abbildung 1A und B ). HINWEIS: Zur Herstellung der Pia-penetrierenden Nadel wird die ursprüngliche, abgeschrägte Spitze der 34G-Nadel mit einem Glas-Kapillar-Beveller mit Diamant-Schleifteller - grob (5,0 μm bis 50 μm Spitzengrößen) und Schleifwinkel von geschärft15 - 20 °. Die Spitze der Nadel (1 mm Länge, gemessen von der Spitze) wird dann sanft auf etwa 90 ° gebogen ( Abbildung 1B , linker Einsatz). </li><li> Unter Verwendung eines chirurgischen Sektionsbereichs, der auf eine 8-10-fache Vergrößerung eingestellt ist, durchdringen die Pia mit der Pia-penetrierenden Nadel um etwa 1 mm ( Abbildung 1C ) mit dem X-Arm. <ol><li> Halten Sie den Winkel der durchdringenden Nadel auf die Gewebeoberfläche bei 5-10 °. </li></ol></li><li> Nach der Pia-Öffnung die Pia-Penetrationsnadel horizontal aus dem subpialen Raum ( Abbildung 1 D) mit dem X-Arm entfernen. HINWEIS: Denken Sie daran, die durchdringte Stelle durch ein Wahrzeichen, wie ein Blutgefäß. </li><li> Legen Sie eine stumpfe 36G Injektionsnadel mit AAV9-UBI-GFP-Virus mit einer 50-μL-Mikrospritze, die mit der Injektionsnadel mit PE-10 oder PE-20-Schlauch verbunden ist. </li><li> Montieren Sie die Nadel in den Z-Arm eines zweiten XYZ-Manipulators ( Abbildung 1A </stroNg&gt; und B ) unter Verwendung eines Glaskapillarenhalters ( Bild 1B , rechter Einsatz). HINWEIS: Zur Herstellung der subpialen AAV9-Injektionsnadel wird die stumpfe Spitze einer 36 G-Nadel mit einem Glas-Kapillar-Beveller mit Diamant-Schleifteller - grob (5,0 μm bis 50 μm Spitzengrößen) poliert, um die scharfen Kanten zu entfernen. Die Spitze der Nadel (2-3 mm Länge, gemessen von der Spitze) wird dann sanft auf etwa 90 ° gebogen. Die pia-penetrierenden und subpialen Injektionsnadeln werden in 1-2 cm lange 20G-Slave-Edelstahlrohre (10 mm vom Ende der Nadel) eingefügt und mit Epoxy verklebt. Für die sichere Befestigung am Glaskapillarenhalter ist die Verwendung von 20 G (0,91 mm Durchmesser) Rohr erforderlich. </li><li> Durch die Manipulation der X-, Y- und Z-Arme des zweiten Manipulators positionieren Sie die Spitze der AAV9-Injektionsnadel in die pia-durchdringte Stelle und führen sie dann etwa 2-3 mm in den subpialen Raum durch die vorherige Pialmembranöffnung mit dem X-arm( Abbildung 1E und F ). HINWEIS: 1) Das AAV9-UBI-GFP wird nach den zuvor gemeldeten Protokollen 9 , 10 hergestellt und die endgültigen Titer werden auf 1,2 x 10 13 Genomkopien pro ml (gc / ml) eingestellt. 2) Es besteht keine Notwendigkeit, die Stelle der Pialöffnung zu markieren, weil sie leicht identifizierbar ist ( Abbildung 1D ). </li><li> Injizieren Sie die AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 oder 5 μl) in den subpialen Raum mit einer 50 μl Mikrospritze (siehe Tabelle 1 für Versuchsgruppen). </li><li> Entfernen Sie die Injektionsnadel aus dem subpialen Raum, nachdem die AAV9-UBI-GFP-Injektion abgeschlossen ist. </li><li> Schließen Sie den Muskel und die Haut mit 4,0 Monofilament Naht und chirurgischen Clips. HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, den offenen Wirbel zu versiegeln. </li><li> Lassen Sie die Tiere auf einem Heizkissen erholen. </li><li> Für Schmerzkontrolle injizieren Buprenorphin 0,05 mg / kg / sc alle 12 h für2-3 Tage nach der Operation. </li></ol> 3. Perfusionsfixierung, Tissue Cryoprotection und Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Zu einem vorgegebenen Zeitpunkt nach den subpialen AAV9-Injektionen werden die Mäuse mit einer Euthanasie-Lösung (siehe Tabelle der Materialien , 0,3 ml) tief betäubt und sie mit 20 ml heparinisiertem Salzlösung transkutiv perfundiert, gefolgt von 20 ml 4% Paraformaldehyd in PBS. </li><li> Die Wirbelsäule und das Gehirn mit einem Knochenrongeur zerkleinern und in 4% Formaldehyd in PBS über Nacht bei 4 ° C nachfüllen. </li><li> Kryoprotekt die Wirbelsäule und Gehirne mit 30% Saccharose in PBS für mindestens 5-7 Tage. </li><li> Schneiden Sie koronale, transversale oder longitudinale / horizontale gefrorene Abschnitte (30 μm dick) auf einem Kryostaten und speichern Sie sie in PBS bei 4 ° C. </li></ol> 4. Immunfluoreszenz-Färbung von Rückenmark und Gehirn-Sektionen (siehe Tabelle der Materialien) <ol><li> Inkubieren Sie frei schwebende Abschnitte in PrimarY-Antikörper über Nacht. </li><li> Nach der Inkubation mit primären Antikörpern, waschen Sie die Schnitte dreimal in PBS und inkubieren Sie mit fluoreszenzkonjugierten Esel-Anti-Kaninchen, Esel-Antihuhn und Esel-Anti-Ziegen-Sekundärantikörpern. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte auf Mikroskopie-Objektträgern, trocknen Sie sie bei Raumtemperatur und decken Sie sie mit einem Anti-Fade-Medium ab. </li><li> Erfassen von Bildern mit Epifluoreszenz-Fluoreszenzmikroskop (Ziele: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 und 63X, NA-1.4). </li></ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+differences+of+intravascular+AAV9+delivery+to+neurons+and+glia%3A+a+comparative+study+of+adult+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+SMA%3A+a+dose-response+study+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+fidelity+of+intrathecal+delivery+of+self-complementary+AAV9-survival+motor+neuron+1+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy.</a> Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).</li>
<li>Bell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+transduction+after+intracisternal+delivery+of+AAV9+in+a+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).</li>
<li>Miyanohara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+spinal+parenchymal+AAV9-mediated+gene+delivery+by+subpial+injection+in+adult+rats+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046(2016).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+knockdown+in+rat+dorsal+root+ganglia+mediated+by+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+5+following+intrathecal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 32581(2012).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
</ol>

Martin Marsala ist Mitbegründer von Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).

Die aktuelle Studie beschreibt eine Technik der subpialen Vektor (AAV9) Lieferung bei erwachsenen Mäusen. Wie in dem begleitenden Video gezeigt, kann dieser Ansatz und die Technik effektiv genutzt werden, vorausgesetzt, dass die benötigten Instrumente und die pia-penetrierende Nadel und die subpiale Injektionsnadel entsprechend den etablierten und getesteten Spezifikationen ordnungsgemäß hergestellt werden. Kritische technische Variablen bei der Durchführung einer konsistenten und si...

Die Verwendung von AAV-Vektoren zur Behandlung einer Vielzahl von Rückenmark und ZNS-neurodegenerativen Erkrankungen wird zu einer gut akzeptierten Plattform, um die Expression von Gen (en) von Interesse effektiv zu regulieren oder zu stillen. Eine der Schlüsselbeschränkungen für die effektivere Nutzung dieser Technologie zur Behandlung von ZNS- / Rückenmarksstörungen ist die begrenzte Fähigkeit, AAV-Vektoren an das tiefe Gehirn oder das Rückenmark-Parenchym bei erwachsenen Säugetieren zu liefern. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass die systemische Verabreichung von AAV9 bei adulten Nagetieren, Katzen oder nichtmenschlichen Primaten nur mäßig wirksam bei der Induktion der transgenen Expression in Neuronen im Gehirn und im Rückenmark 1 , 2 , 3 ist . Die effektivere intrathekale Verabreichung von AAV9-Vektoren hat sich auch gezeigt, dass sie nur zu einer begrenzten Transgenexpression in anatomisch definierten Pools von Neuronen führen. Genauer gesagt, es war DämonenDass die cisternal- oder lumbo-sakrale intrathekale AAV9-Abgabe in nichtmenschlichen Primaten, Schweinen oder Nagetieren zu einem hohen Grad an transgener Expression in spinalen α-Motoneuronen und segmentalen Dorsalwurzelganglionneuronen führt. Allerdings ist ein minimaler oder kein Ausdruck in spinalen Interneuronen oder aufsteigenden oder absteigenden Axonen in der weißen Substanz 4 , 5 , 6 , 7 zu sehen . Gemeinsam zeigen diese Daten, dass eine hochwirksame biologisch-anatomische Barriere existiert, die die Diffusion von intrathekal abgegebener AAV in tieferes Spinalparenchym verhindert. In einer früheren Studie mit erwachsenen Ratten und Schweinen wurde eine neuartige Subpial-Vektor-Delivery-Technik entwickelt 8 . Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde eine hochwirksame und multisegmentale Transgenexpression nach einer Ein-Bolus-Subpial-AAV9-Abgabe nachgewiesen. Intensive GFP-Expression wurde konsequent gesehenIn Neuronen, Gliazellen und absteigenden / aufsteigenden Axonen durch die injizierten Wirbelsäulensegmente. Diese Studie zeigte zum ersten Mal, dass die Pia mater die primäre Barriere darstellt, die die effektive AAV9-Diffusion in das Spinalparenchym aus dem intrathekalen Raum begrenzt. Während diese zuvor entwickelte Technik und die subpiale Injektionsvorrichtung bei großen Nagetieren (wie Ratten) oder erwachsenen Schweinen relativ einfach zu verwenden ist, ist das System nicht für den Einsatz bei kleinen Tieren, wie z. B. erwachsenen Mäusen, geeignet. Wegen der hohen Anzahl verfügbarer transgener Mausmodelle einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung einer wirksamen Spinal-Parenchym-Vektor-Verabreichungstechnik bei Mäusen. Die Verfügbarkeit einer solchen Technik würde die Untersuchung der Wirkung eines spezifischen Gen-Silens ( z. B. unter Verwendung von shRNA) oder einer Hochregulation unter Verwendung von zell-unspezifischen ( z. B. Cytomegalovirus-CMV oder Ubiquitin) oder zellspezifischen ( z. B. Synapsen oder Glia) ermöglichen Fibrillär sauerProtein (GFAP)) Promotoren während der frühen postnatalen Entwicklung oder unter kranken Bedingungen. Dementsprechend haben wir in der vorliegenden Studie ein Miniatur-Subpial-Vektor-Delivery-System entwickelt und validiert, das effektiv bei erwachsenen Mäusen verwendet werden kann. Ähnlich wie bei früheren Ratten- und Schweinestudien zeigt diese Arbeit eine starke Transgenexpression während des gesamten Wirbelsäulenparenchyms nach einer Ein-Bolus-Subpial-AAV9-Abgabe bei Mäusen. Die Einfachheit dieses Ansatzes, die sehr gute Verträglichkeit von injizierten Mäusen zur subpialen AAV9-Abgabe und die hohe Potenz der Transgenexpression im Spinalparenchym deuten darauf hin, dass diese Technik in jeder Laborumgebung effektiv umgesetzt und in Experimenten verwendet werden kann, die auf die Spinalgenexpression abzielen.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6J Mäuse</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Laborstandard-Stereotaxe für Mäuse</td><td>Harvard-Gerät</td><td>72-9568</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Wirbelsäulenadapter</td><td>Harvard-Gerät</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>XYZ-Manipulator</td><td>Stoelting</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>Manuelle Infusionspumpe</td><td>Stoelting</td><td>51218</td><td></td></tr><tr><td>34G abgeschrägte Nanofill-Nadel</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>36G stumpfe Nanofill-Nadel</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF-36BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso, Isofluran</td><td>MWI Veterinärbedarf</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidinlösung</td><td>MWI Veterinärbedarf</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>20G Edelstahlnadel</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>23G Edelstahl Nadel</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>30G Edelstahl Nadel</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Baumwolle mit Spitze Applikator</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>27426</td><td></td></tr><tr><td>Glas Kapillar Anfas&nbsp;</td><td>Narishige International</td><td>SM-25B</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgermikroskop Superfrost</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; L Mikrospritze&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-20 Schlauch</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-10 Schlauch</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>4-0 monofile</td><td>Naht VetOne</td><td>V1D397</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillaranfas&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>Pipette Mikroschleifer EG-40&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5 min Epoxy (Epoxy Clear)</td><td>Devcon</td><td>14310</td><td></td></tr><tr><td>Euthanasielösung</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>11168</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Inj 1.000 U/mL</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>54254</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Anti NeuN Antikörper</td><td>EMD-Millipore</td><td>ABN78</td><td>Primärer polyklonaler Kaninchen-Antikörper, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Cholin-Acetyltransferase (CHAT)-Antikörper</td><td>EMD-Millipore</td><td>AB144P</td><td>Primärer polyklonaler Antikörper aus der Ziege, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Primärer polyklonaler Antikörper gegen Hühnerfleisch, 1:1000</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21207</td><td>Sekundärer Antikörper, 1:1000</td></tr><tr><td>&nbsp; Esel Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper, Alexa Fluor 680</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10043</td><td>Sekundärantikörper, 1:1000</td></tr><tr><td>Esel Anti-Hühner IgY Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td><td>703-545-155</td><td>Sekundärer Antikörper, 1:1000</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen IgG H& L (Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150131</td><td>Sekundärer Antikörper, 1:1000</td></tr><tr><td>Objektträgermikroskop Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager M2</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Polysciences, Inc</td><td>19411</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-UBC-GFP</td><td>UCSD-Labor</td><td></td><td></td> für virale Vektoren</tr></tbody></table>

subpial adeno-assoziiertes virus 9 (aav9) vektorlieferung in erwachsenen mäusen

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Die erfolgreiche Entwicklung eines subpialen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) Vektor-Delivery-Technik bei erwachsenen Ratten und Schweinen wurde bisher beschrieben. Unter Verwendung von subpial platzierten Polyethylenkathetern (PE-10 oder PE-5) für die AAV9-Abgabe wurde eine starke Transgenexpression durch das Spinalparenchym (weiße und graue Substanz) in sublimial injizierten Wirbelsäulensegmenten nachgewiesen. Wegen des breiten Spektrums der transgenen Mausmodelle von neurodegenerativen Erkrankungen besteht ein starker Wunsch nach der Entwicklung eines starken Nervensystems (ZNS), der in den erwachsenen Mäusen gezielt entwickelt wurde. Dementsprechend beschreibt die vorliegende Studie die Entwicklung einer spinalen Subpial-Vektor-Abgabevorrichtung und Technik, um eine sichere und wirksame Wirbelsäule-AAV9-Abgabe in erwachsenen C57BL / 6J-Mäusen zu ermöglichen. Bei spinell immobilisierten und anästhesierten Mäusen wurde die Pia mater (zervikale 1 und lumbale 1-2 Spinalsegmentstufe) mit einer scharfen 34 G-Nadel unter Verwendung eines XYZ-Manipulators eingeschnitten. Eine zweite XYZ maNipulator wurde dann verwendet, um eine stumpfe 36G-Nadel in den Lenden- und / oder Zervikal-subpialen Raum vorzurücken. Der AAV9-Vektor (3-5 &amp; mgr; l, 1,2 × 10 13 Genomkopien (gc)), der für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, wurde dann sublimiert. Nach Injektionen wurde die neurologische Funktion (motorisch und sensorisch) periodisch beurteilt und die Tiere wurden 14 Tage nach der AAV9-Abgabe mit 4% Paraformaldehyd perfusionsfest fixiert. Die Analyse von horizontalen oder transversalen Rückenmarksabschnitten zeigte eine transgene Expression während des gesamten Rückenmarks, sowohl in grauer als auch in weißer Substanz. Darüber hinaus wurde eine intensive retrogradvermittelte GFP-Expression in den absteigenden motorischen Axonen und Neuronen in der motorischen Kortex, Kernruber und formatio reticularis beobachtet. Bei jedem Tier wurde keine neurologische Dysfunktion festgestellt. Diese Daten zeigen, dass die Subpial-Vektor-Delivery-Technik erfolgreich bei erwachsenen Mäusen verwendet werden kann, ohne dass eine prozessbedingte Rückenmarksverletzung verursacht wird und mit hochwirksamen Transgenexpres assoziiert istWährend der spinalen Neuraxis.

<html> Potente Transgenexpression in subpialen AAV9-injizierten Segmenten: Die Analyse der Transgen- (GFP) -Expression in den Rückenmarksabschnitten an 14 Tagen nach der AAV9-Abgabe zeigte eine AAV9-dosisabhängige GFP-Expression während des Spinalparenchyms. Zuerst wurden zwei bilaterale 3 &amp; mgr; l Injektionen von AAV9-UBI-GFP, die in den oberen lumbalen subpialen Raum injiziert wurden, mit der nahezu vollständigen Infektion der weißen und grauen Substanz in de...

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Potenz und Sicherheit der spinalen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) -vermittelten Genabgabe zu entwickeln und zu validieren, indem eine neuartige subpiale Genabgabetechnik bei erwachsenen Mäusen verwendet wurde.

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Das übergeordnete Ziel dieser subpialen AAV9-Verabreichungstechnik besteht darin, eine starke transgene Expression im gesamten Rückenmarksparenchym über die gesamte Länge des Rückenmarks erwachsener Mäuse zu erreichen. Diese Methode kann Studien unterstützen, die darauf abzielen, die Genexpression im Rückenmark zu beeinflussen, und hilft, die Mechanismen mehrerer spinaler neurodegenerativer Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose, traumatischer Rückenmarksverletzungen oder chronischer Schmerzen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass eine sehr starke transgene Expression im grauen und weißen Rückenmarksmark mehrerer benachbarter Rückenmarkssegmente erzielt wird, die an das subpial mit AAV9 behandelte Segment angrenzen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Schritt zum Öffnen der Dura und das Platzieren der subpialen Nadel ohne visuelle Demonstration schwer zu erlernen sind. Die Durchführung der Prozedur wird von Takahiro Tadokoro, einem Postdoktoranden in unserem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, das Tier ordnungsgemäß für die Operation zu narkotisieren; hier wird Isofluran verwendet.Stellen Sie vor dem Fortfahren

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In diesem Video demonstrieren wir die rekombinante Adeno-assoziierte Virus-basierte Genabgabe im Maus-Welpen. Diese Methode hilft bei der Untersuchung der Genexpression in den Zielzellen.

Rekombinante Adeno-assoziierte virusbasierte Genverabgabung: Eine Technik für die transgene Verabreichung und kardiospezifische Expression im Nagetiermodell

Quelle: Tadokoro, T., et al. Subpiale Adeno-assoziierte Virus 9 (AAV9) Vektorverabreichung bei erwachsenen Mäusen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt eine subpiale Injektionstechnik für die Genabgabe an das Rückenmark bei Mäusen. Das Verfahren umfasst die Freilegung der Dura mater, die Punktion der Pia mater und die Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV), das ein fluoreszierendes Protein-exprimierendes Gen trägt, in den subpialen Raum. Nach der Injektion und Genesung...

Subpiale Genverabreichung im Rückenmark der Maus zur Bewertung der Genexpression

Quelle: Li, D., et al. Direkte intrathekale Injektion von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren in erwachsene Mäuse. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur intrathekalen Injektion von Adeno-assoziierten Viren (AAV) in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) einer wachen Maus, einschließlich der Spritzenvorbereitung, der Ausrichtung der Wirbelsäule und des präzisen Einführens der Nadel. Diese Methode validiert die gezielte Verabreichung von Genen und unterstützt ihr Potenzial für...

Intrathekale Verabreichung von Viren in einem Mausmodell zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems

Quelle:Pourshafie, N., et al. Systemische Verabreichung von microRNA unter Verwendung des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018).In diesem Video wird eine von spinaler und bulbärer Muskelatrophie oder SBMA betroffene Maus einer Schwanzveneninjektion von rekombinanten AAV-Vektoren (Adeno-assoziierten Vektoren) unterzogen, die ein Plasmid tragen, das für therapeutische microRNA kodiert. Der Vektor produziert...

Injektion rekombinanter adeno-assoziierter Vektoren in einem Mausmodell für spinale und bulbäre Muskelatrophie

Hier beschreiben wir die Lieferung von MicroRNA verwenden ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 in einem Mausmodell der neuromuskulären Erkrankungen. Eine einzelne periphere Verabreichung bei Mäusen führte zu nachhaltigen MiRNA Überexpression in Muskel und motorischen Neuronen, bietet eine Möglichkeit, MiRNA Lernfunktion und therapeutische Potenzial in Vivo.

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Hier präsentieren wir Ihnen eine direkte intrathekale Injektionstechnik mit 1 % Lidocain Hydrochlorid in eine virale Lösung gewährleisten effizienten Adeno-assoziierten Viren Lieferung an Kleintieren und etablieren ein scoring-System zur Vorhersage der Transduktion Effizienz im zentralen Nervensystem nach dem Grad der vorübergehende Schwäche durch Lidocain induziert.

Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Es wird ein chirurgischer Eingriff beschrieben, bei dem Injektionen in die Lendenwirbelkammer der juvenilen Ratte durchgeführt werden. Dieser Ansatz wurde für die intrathekale Verabreichung von Gentherapie-Vektoren verwendet, aber es wird erwartet, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von Therapeutika, einschließlich Zellen und Medikamenten, verwendet werden kann.

Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

Im Folgenden stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Injektion von seitlichen Schwanzvenen aus der Maus zur systemischen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) bei adulten Mäusen vor. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle von häufig verwendeten Assays zur Beurteilung der AAV-Transduktion.

Konsistente Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus durch laterale Schwanzveneninjektion bei erwachsenen Mäusen

Dieser Bericht beschreibt die lokalisierte Injektionsmethode von AAV-Vektoren über das Nierenbecken für einen effektiven und sicheren Gentransfer in die Mausniere.

Effektive und sichere Genabgabe an die Mausniere durch langsame retrograde Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren in das Nierenbecken

Erfahren Sie die subpiale AAV9-Vektorlieferung zur Gentherapie im Rückenmark erwachsener Mäuse. Diese Methode ermöglicht potente Transgenexpression in grauer und weißer Substanz für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen.

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

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