Name: Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer muriner Retinal-Ganglion-Zellen durch Durchflusszytometrie. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für die Erforschung retinaler Degenerationskrankheiten.

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Die Autoren danken Herrn Tim Higgins, Senior Illustrator von der Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Biochemie, für technische Video-Unterstützung; Dr. Matthew W. Wilson für Gespräche und die Mitglieder der Laboratorien von Jablonski und Morales-Tirado für ihre hilfreichen Kommentare. Diese Arbeit wurde vom Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), der University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), dem National Eye Institute EY021200 (MMJ), dem Gerwin Fellowship (VMM-T), unterstützt. Das Gerwin Pre-Doctoral Fellowship (ZKG), das Department of Defense Army Medical Research und Materiel Command (VMM-T), und die uneingeschränkte Grant von der Forschung, um Blindheit zu verhindern.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

FACS ist die Technik der Wahl, um Zellpopulationen zu reinigen. Andere Isolationsverfahren umfassen Immunopanning, magnetische Perlen und Komplement-Fixationsverarmung. Der Vorteil von FACS gegenüber diesen anderen Methoden beruht auf der gleichzeitigen Identifizierung von Zelloberflächenmarkern mit unterschiedlichem Intensitätsgrad. Die Fluoreszenzintensität des Moleküls ist proportional zur Menge der Proteinexpression. Bisher basierte die Isolierung von RGCs ausschließlich auf Thy1 (CD90) Positivität und CD48 Negativi...

RGCs sind endständig differenzierte Neuronen, und daher sind Primärzellen zum Experimentieren erforderlich. Die Entwicklung eines Protokolls für die Isolierung und Anreicherung von primären murinen Netzhautganglienzellen (RGCs) ist von grundlegender Bedeutung für die Aufdeckung der Mechanismen der RGC-Gesundheit und Degeneration in vitro . Dies ist besonders wichtig für Studien, die versuchen, potenzielle Therapien zur Förderung der RGC-Funktion zu generieren und ihren Tod zu minimieren. Die Degeneration von RGCs ist mit retinalen degenerativen Erkrankungen wie Glaukom, diabetischer Retinopathie und normaler Alterung assoziiert. Obwohl die spezifischen zellulären Mechanismen, die dem RGC-Verlust zugrunde liegen, unklar sind, wurde eine Reihe von Risikofaktoren identifiziert. Der Mangel an Oxygenierung am Sehnervenkopf 1 , 2 , 3 verursacht den RGC-Tod 4 und wirkt als Störung der Homöostase zwischen der Aktivierung von Erreger und iNhibitorische Rezeptoren innerhalb einzelner RGCs 5 , 6 . Eine Reihe von Herausforderungen behindern den Fortschritt in Richtung der Verwendung dieser Zellen für eingehende Studien. Zuerst ist die Anzahl der RGCs, die in einer murinen Netzhaut vorhanden sind, klein. RGCs machen weniger als 1% der gesamten Netzhautzellen aus 7 , 8 , 9 . Zweitens sind die meisten RGC-spezifischen Marker intrazelluläre Proteine 10 , 11 , 12 . Die Selektion, die auf diesen Markern basiert, lässt die Zellen nicht lebensfähig, was nachgeschaltete Funktionsanalysen ausschließt. Schließlich sind derzeit verfügbare Protokolle langwierig und fehlen Standardisierung 13 , 14 . Die frühen RGC-Isolationsprotokolle basierten auf Immunpanning-Methoden. Barres et al. 15 Adaptiert das klassische immunopAnning-Technik und fügte einen zweiten Schritt, die Monozyten und Endothelzellen aus der Masse der Netzhautzellen vor der positiven Selektion auf der Grundlage der Immunopositivität gegen Anti-Thymozyten-Antigen (aka Thy1), eine Zell-Oberfläche-Marker ausgeschlossen. Jahre später haben Hong et al. Kombinierte magnetische Wulstisolationstechniken mit Zellsortierungsstrategien zur Isolierung von RGCs mit höherer Reinheit 16 . Die Verwendung von magnetischen Perlen wird noch in vielen wissenschaftlichen Anwendungen verwendet. Gemeinsam verbesserten magnetische Perlen und Durchflusszytometrie-Protokolle die Reinheit von isolierten Zellen. Diese Reinigungssysteme wurden jedoch noch nicht für die Isolierung von murinen RGCs aus dissoziierten Retinae standardisiert. Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke analytische Methode, die die optischen und Fluoreszenzeigenschaften von Zellsuspensionen misst. Die Zellen werden sowohl quantitativ als auch qualitativ mit einem hohen Maß an Empfindlichkeit analysiert und liefern eine mehrdimensionale Analyse der ZellpopulieAtion Die zelluläre Diskriminierung beruht auf zwei wesentlichen physikalischen Eigenschaften: Zellgröße oder Oberfläche und Granularität oder interner Komplexität 17 . Eine mehrdimensionale Analyse kann durch Kombination von Antikörpern durchgeführt werden, die mit Fluorochromen markiert sind, die ähnliche Anregungswellenlängen und unterschiedliche Emissionen aufweisen. Durchflusszytometrie ist schnell, reproduzierbar und empfindlich. Multitup-Laser erlauben noch mehr multidimensionale Analysen einzelner Zellen durch Durchflusszytometrie. So ist es eine attraktive Methodik für die Untersuchung von zytologischen Proben. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet die multidimensionalen phänotypischen Unterschiede, die durch die Durchflusszytometrie identifiziert wurden, um einzelne Zellen in verschiedene Subpopulationen zu sortieren. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Oberflächen- und intrazelluläre Proteine ​​als potentielle Biomarker für die Selektion von Zellen, einschließlich Neuronen, identifiziert. Erste Studien, die RGCs von Ratten zu isolieren suchten Thy1 als Ganglion celL marker Unglücklicherweise hat Thy1, aka CD90, mehrere Isoformen in anderen Nagetierarten 18 , 19 , 20 und wird durch mehrere retinale Zelltypen 19 , 20 exprimiert, was es zu einem unspezifischen Marker für RGCs macht. Ein weiterer Oberflächenmarker, CD48, findet sich bei monozytischen Populationen in der Netzhaut, einschließlich Makrophagen und Mikroglia. Unter Verwendung dieser beiden Oberflächenmarker wurde eine modifizierte RGC-Signatur-Thy1 + und CD48-Neg-Zellen entwickelt, 15 , 16 , 21 , 22 . Leider reichen diese beiden Auswahlkriterien nicht aus, um eine hochangereicherte RGC-Population auszuwählen. Um diesen unerfüllten Bedarf zu bewältigen, wurde ein Durchflusszytometrie-Protokoll entwickelt, das auf mehrschichtigen positiven und negativen Selektionskriterien usi basiertNg bekannte Zelloberflächenmarker zur Anreicherung und Reinigung von primären murinen RGCs.

<table><tbody><tr><td>Anti-Maus CD15</td><td>PE BioLegend</td><td>125606</td><td>Klon MC-480</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Klon HM48-1</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Klon VC1.1</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Klon 30-H12</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>Klon Poly4053</td></tr><tr><td>gereinigt Anti-Maus CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III Block, Klon 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Unterscheidung von lebenden Zellen/toten Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Herkunft aus den USA</td></tr><tr><td>AbC Total Antibody Compensation Bead Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A10497</td><td>Multispezies Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Fügen Sie dem Medium vor der Kultur Serum hinzu.</td></tr><tr><td>Thermo</td> <td>Fisher</td><td>Scientific 10010049</td> Dissektionsmikroskop <td>für Kochsalzlösung</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZ-PT Modell</td><td>Stereomikroskop</td></tr><tr><td>Sorvall Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>Alle Zentrifugationen werden an der</td></tr><tr><td>RT-Grundplatte durchgeführt &ndash; Sezierpfanne</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>Eine Wachsplatte kann auch verwendet werden</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 & frac12; Zoll</td></tr><tr><td>Iris Schere, gerade</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 & frac12; Zoll</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konische Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>Scientific 352097</td><td>Polypropylen-Röhrchen</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Polypropylen-Röhrchen</td></tr><tr><td>BD FACS-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>Polypropylen-Röhrchen</td></tr><tr><td>40 mm Schalen</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Mit Gewebekulturen behandelt</td></tr><tr><td>70 μm; m Nylon-Sieb</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>steril</td></tr><tr><td>40 &mu; m Nylon-Sieb</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>steril</td></tr><tr><td>&nbsp; BD 10 mL Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>Einwegspritze ohne Nadel</td></tr><tr><td>Stößel</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>sterile</td></tr><tr><td>Wheaton Fläschchen</td><td>Fisher</td><td>Scientific 986734</td><td>No Liner</td></tr><tr><td>BD 30 G Nadel</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>1 Zoll</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line Zählkammer aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hämozytometer</td></tr><tr><td>Gibco Trypanblau 0,4 % Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Viability Dye</td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>EVOS Floid Cell Imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>Fluoreszenzbildgebung mit einem 20-fachen Objektiv</td></tr><tr><td>100 % Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>Wird zur Herstellung von 70 % Ethanol verwendet</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS Pipette</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS Pipette</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS Pipettenhalter</td></tr><tr><td>LTS 1000 mL &ndash; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Gestell Sterile Spitzen</td></tr><tr><td>Rack LTS 250 mL Blau &ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Grün Rack Sterile Spitzen</td></tr><tr><td>Rack LTS 20 mL &ndash; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Red Rack Sterile Spitzen</td></tr><tr><td>FACSAria II Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>LSR II Zytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Mm00462440_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrozyten</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amakrine, Horizontal</td></tr><tr><td>CD68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Retinal Pigment Epithel Cells</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Wissenschaftliche</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Mm01545399_m1</td><td>Haushaltsführung gen</td></tr><tr><td><e>Lhx1</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Mm00476550_m1</td><td>Photorezeptoren</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Mm01219406_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>Bipolare, Amacrin</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>retinale Ganglienzellen</td></tr><tr><td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrozyten</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolar</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amakrinen</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>retinale Ganglienzellen</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Photorezeptoren</td></tr><tr><td>Rpe65Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>retinale Pigmentepithelzellen</td></tr><tr><td><>emlc1a3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrozyten</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00433662_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>retinale Ganglienzellen</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>retinale Ganglienzellen</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml; </td></tr><tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 4440047</td><td>qPCR Reagenz</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>RNA Isolierung</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA Synthese Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master</td><td>Mix Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>Vorverstärkerschritt</td></tr><tr><td>BD Cytofix/ Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Fixierung/ Permeabilisierungspuffer</td></tr><tr><td>BD Perm/ Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Permeabilisierungslösung</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>intrazellulärer Antikörper</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>intrazellulärer Antikörper</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8429</td><td>intrazellulärer Antikörper</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>intrazellulärer Antikörper</td></tr></tbody></table>

isolierung von primären murinen retinal-ganglion-zellen (rgcs) durch durchflusszytometrie

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative Erkrankungen haben oft einen verheerenden Einfluss auf die Betroffenen. Retinale Ganglienzelle (RGC) Verlust ist in einer Reihe von Krankheiten, einschließlich diabetischer Retinopathie und Glaukom, zusätzlich zu normalen Alterung verwickelt. Trotz ihrer Bedeutung waren RGCs bislang äußerst schwierig zu studieren, zum Teil aufgrund der Tatsache, dass sie nur einen kleinen Prozentsatz der Vielzahl von Zellen in der Netzhaut enthalten. Darüber hinaus verwenden aktuelle Isolationsmethoden intrazelluläre Marker, um RGCs zu identifizieren, die nicht lebensfähige Zellen produzieren. Diese Techniken beinhalten auch lange Isolationsprotokolle, so dass es an praktischen, standardisierten und zuverlässigen Methoden fehlt, um RGCs zu erhalten und zu isolieren. Diese Arbeit beschreibt eine effiziente, umfassende und zuverlässige Methode, um primäre RGCs von Mäusen retinae zu isolieren, wobei ein Protokoll auf der Grundlage sowohl positiver als auch negativer Selektionskriterien verwendet wird. Die vorgestellten Methoden erlauben die künftige Untersuchung von RGCs mit dem Ziel, das Gute besser zu verstehenAbnahme der Sehschärfe, die sich aus dem Verlust von funktionellen RGCs bei neurodegenerativen Erkrankungen ergibt.

<html> Die eingehende Untersuchung von RGCs wird durch viele Faktoren behindert, darunter ihre niedrige Häufigkeit und das Fehlen einer robusten und standardisierten Methodik für ihre Isolation. Abbildung 1 zeigt die Methode zur Retinae-Isolierung. Variationen im Enukleationsverfahren existieren auf der Grundlage der Art der Analyse, wie wenn die Enukleation Teil des In-vivo- Experiments ist 27 . Die Enukleation in diesem Prot...

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine angereicherte, homogene Population primärer muriner Ganglienzellen der Retina zu isolieren. Diese Methode kann dabei helfen, offene Fragen im Bereich der Ganglienzellen der Retina bezüglich der Mechanismen zu beantworten, die dem Rückgang der Sehschärfe in altersbedingten Populationen sowie bei Populationen mit degenerativen Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein schnelles, sichtbares, reproduzierbares und standardisiertes Protokoll für die Isolierung angereicherter primärer muriner Ganglienzellen der Retina bietet.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als Sumana Chintalapudi, damals Doktorandin in meinem Labor und Erstautorin dieser Studie, in unserem Journal Club 2013 eine Arbeit von Krishna Murtheadol vorstellte, in der deutlich gezeigt wurde, dass die Zelllinie RGC five, die ursprünglich als immortalisierte retinale Ganglienzelllinie der Ratte etabliert worden war, weder noch von ratinem Ursprung war noch das RGC-Phänotyp aufwies. Uns wurde klar, dass dieses Problem eine große Lücke in den Ressourcen für die Visionforschungsgemeinschaft – einschließlich unseres eigenen Labors – hinterlassen hatte. Sumana und ich wandten uns an Dr. Morales-Tirado, und gemeinsam entwickelten wir die drei eine neue Methode zur Isolierung lebender und hochangereicherter RGCs.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Ziel dieser Methode darin besteht, eine lebende und hochangereicherte Zellpopulation zu isolieren, die entweder als primäre Zellen kultiviert oder als Zelllinie immortalisiert werden kann. Deshalb muss man sehr vorsichtig sein, um die zu isolierenden Zellen nicht zu beschädigen. Außerdem müssen die Parameter der Zellsortierungsmethode an die spezifischen Zellen angepasst werden, die man isolieren möchte.Beide Methoden erfordern besondere Fachkenntnisse. Die Verfahren werden demonstriert von Dr. Xiang Di Wang, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Labor von Dr. Jablonski, und von Herrn Zach Goldsmith, Doktorand aus meinem Labor. Um das Auge zu enukleieren, führen Sie zuerst die Pinzette unter den Augapfel ein.Fassen Sie den Sehnerv an und ziehen Sie nach oben. Der Bulbus wird enukleiert, wobei der Sehnerv erhalten bleibt. Legen Sie das Auge in ein Gefäß mit PBS auf Eis und enukleieren Sie das andere Auge.Nachdem alle Augen gesammelt wurden, legen Sie ein Auge in eine Petrischale mit frischer PBS unter einem Dissektionsmikroskop und greifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette am Ansatz des Sehnervs den Augapfel. Mit einer scharfen Nadel der Stärke 30 punktieren Sie die Hornhaut, um das Kammerwasser abfließen zu lassen, wodurch das Halten des Auges mit der Pinzette erleichtert wird. Halten Sie die Hornhaut mit der Pinzette fest und machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt in das Hornhautgewebe. Entfernen Sie dann vorsichtig mit der Pinzette die Hornhaut und die Lederhaut.Wenn die Augenkugel zur Hälfte abgeschält ist, verwenden Sie die Pinzette, um die Netzhaut und die Linse herauszurollen. Legen Sie die Netzhaut in eine kleine Petrischale mit einem Durchmesser von 40 Millimetern, die PBS und 1 % FBS enthält, und waschen Sie die Netzhaut dreimal in frischem PBS mit FBS, jeweils mit einer neuen Waschlösung. Nachdem alle Augen gewaschen wurden, legen Sie bis zu 12 Netzhäute auf einen sterilen Nylonsieb mit einer Porengröße von 70 Mikrometern, der mit PBS und FBS angefeuchtet ist, und zerkleinern Sie die Netzhäute vorsichtig mit dem hinteren Ende eines 10-Milliliter-Spritzenstempels unter kreisförmigen Bewegungen.Wenn alle Zellen dissoziiert sind, stellen Sie das Sieb über ein Sammelröhrchen aus Polypropylen und verwenden eine P1000-Pipette, um die Zellen durch das Sieb in das Sammelröhrchen zu filtrieren. Spülen Sie das Sieb mit PBS und FBS aus und sammeln Sie die Waschflüssigkeit im Sammelröhrchen. Geben Sie so viel PBS mit FBS hinzu, dass das Endvolumen ein Milliliter Lösung pro Netzhaut beträgt, und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.Resuspendieren Sie das Pellet anschließend in PBS mit FBS, und zwar mit einem Milliliter Medium pro fünf Retinas, sofern sofort eine Immunfärbung durchgeführt werden soll. Alternativ inkubieren Sie die in neuronalem Zellmedium resuspendierten Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius in horizontaler Position. Um die Netzhautzellen immunzufärben, zentrifugieren Sie die Suspension der Netzhautzellen und resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikroliter frischem PBS mit FBS in einem FACS-Röhrchen.Stellen Sie fünfmal 10 hoch 6 Zellen für die unmarkierte negative Kontrolle beiseite. Blockieren Sie anschließend jede unspezifische FC-Rezeptorbindung in jedem Röhrchen mit einem Mikroliter Anti-Maus-CD-16-32-Antikörper pro 1×10⁶ Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Blockierungsinkubation fügen Sie vorsichtig pipettierend die Antikörper-Cocktails der Wahl zu den Zellen hinzu und inkubieren 30 Minuten lang auf Eis, vor Licht geschützt.Anschließend die Zellen zwei Mal in einem Endvolumen von einem Liter PBS und FBS waschen. Die Zellen mit einem geeigneten sekundären Antikörper für weitere 30 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren, gefolgt von zwei Waschschritten in PBS mit FBS, wie zuvor gezeigt. Die Pellets in frischem PBS und FBS resuspendieren, um die Zellen zu zählen.Um die Kompensation einzustellen, geben Sie drei Tropfen Polystyrol-Mikrokugeln in jedes sterile FACS-Röhrchen pro Florafor sowie ein Mikrogramm des jeweiligen Florafor pro Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Mikrokugeln 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Waschen Sie danach die Mikrokugeln mit drei Milliliter PBS und FBS und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.Suspendieren Sie die Mikrosphären-Pellets in 250 Mikrolitern PBS und FBS und laden Sie das nicht markierte Probenröhrchen in den Durchflusszytometer. Wählen Sie in der Software des Durchflusszytometers Experiment, Kompensationseinstellung und erstellen Sie Kompensationskontrollen. Fügen Sie die spezifischen Florafor-Kontrollen aus der angezeigten Liste hinzu und klicken Sie auf OK. Überprüfen Sie das vorwärts gestreute und das seitwärts gestreute Licht und setzen Sie das Tor für die anfängliche Population.Danach die Negativkontrollr&ouml;hre am Durchflusszytometer befestigen und auf „Laden“ klicken. &Uuml;berpr&uuml;fen, ob die Population von Interesse oder P1 angezeigt wird, und die Population ausw&auml;hlen. Mit der rechten Maustaste auf das P1-Tor klicken und „Kompensation berechnen“ ausw&auml;hlen.Dann klicken Sie auf „Daten aufzeichnen“. Wenn die Aufzeichnung abgeschlossen ist, klicken Sie auf „Entladen“, um die Probe zu entfernen, und laden Sie die nächste Kontrollprobe, um die Kompensationssteuerungen anzupassen. Nachdem alle Kontrollproben aufgezeichnet wurden, erstellen Sie ein Vorwärts- gegen Seitwärtsstreuungsdiagramm für die erste experimentelle Probe und umgrenzen Sie die P1-Population.Öffnen Sie als Nächstes ein Pseudofärbungsdiagramm von Seitenstreuungshöhe gegen Seitenstreuungsbreite und markieren Sie die Einzelzellen. Erstellen Sie unter Verwendung der Einzelzellen ein Diagramm der Vorwärtsstreuungshöhe gegen Vorwärtsstreuungsbreite und markieren Sie die Dubletts zur Ausschließung. Generieren Sie anschließend ein Pseudofärbungsdiagramm von CD48 gegen CD90.2 und markieren Sie die CD90.2-positiven, CD48-negativen Zellen, um Monozyten auszuschließen, gefolgt von einem Pseudofärbungsdiagramm von CD57 gegen CD15, um eventuelle Amakrinzell-Kontaminationen zu entfernen.Definieren Sie nun die zu sammelnden Populationen für die Probe im Sortierlayout-Blatt und sortieren Sie die Zellen. Verwenden Sie am Ende der Sortierung ein Aliquot von 2,5 × 10⁴ Zellen, um die Reinheit der isolierten Zellpopulation zu bestätigen. Nach dem Zerreiben der Netzhäute im Zellsieb können mehrere innere Netzhautzellen visualisiert werden, obwohl die Ganglienzellen aufgrund der Axotomie während des Isolierverfahrens ihre charakteristische Morphologie verloren haben.Das klassische Farbstoff-eins-positive-CD48-negative Oberflächenphänotyp ist nicht ausreichend zur Identifizierung und Isolierung muriner retinaler Ganglienzellen, da diese Zellen Gene exprimieren, die mit Amacrin-, Müller-, Bipolar-, Horizontal-, Photorezeptor- und retinalen Pigmentepithelzellen assoziiert sind. Die sortierten Zellen exprimieren außerdem intrazelluläre Marker, die mit retinalen Ganglienzellen assoziiert sind, wie Synuclein Gamma, BRN3A, TUJ1 und RBPMS, wobei die intrazelluläre Lokalisation der Marker durch bildgebende Durchflusszytometrie weiter bestätigt wurde. Einige der sortierten Zellen beginnen bereits nach der Zellkultur in vitro, eine Morphologie retinaler Ganglienzellen aufzuweisen.Weiterhin zeigt die quantitative PCR-Analyse der stark angereicherten sortierten Zellpopulation eine vielfache Zunahme der Gene, die für retinale Ganglienzellen-spezifische intrazelluläre Marker kodieren. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in weniger als sechs Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellsuspension steril zu halten, die FC-Rezeptoren in der Zellsuspension zu blockieren, unspezifische Bindung der Antikörper zu vermeiden und die Details oder Strategie der Zellsortierung mit dem Bediener des Zellsortierers zu besprechen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die QPCR angewendet werden, um zusätzliche Fragen zur Genexpressionsanalyse zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit spezialisierten Geräten wie einem Zellsortierer einen hochspezialisierten Bediener erfordert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der Sehforschung den Weg, um Überlebens- und Sterbemechanismen in retinalen Ganglienzellen besser zu verstehen und neuartige Therapeutika zum Erhalt des Sehvermögens zu entwickeln.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine angereicherte, homogene Population primärer muriner retinaler Ganglienzellen isoliert.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Isolierung von primären retinalen Ganglienzellen (RGCs) von Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die zukünftige Untersuchung von RGCs mit dem Ziel, den starken Rückgang der Sehschärfe besser zu verstehen, der aus dem Verlust funktioneller RGCs bei neurodegenerativen Erkrankungen resultiert.

Isolierung von murinen retinalen Ganglienzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung

Source: Laboissonniere, et. al. Einzelzell-RNA-Seq definierter Untergruppen von retinalen Ganglienzellen. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video zeigt eine Fluoreszenzverfolgungstechnik zur Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen (RGC) in einer transgenen Mausnetzhaut. Der Prozess umfasst die Sicherung der isolierten Netzhaut in einer Aufnahmekammer, die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit durch sauerstoffhaltige Perfusion und das Targeting fluoreszenzmarkierter RGCs mit...

Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen der Maus durch Fluoreszenzverfolgung

Mikroglia Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und unzureichende phagozytischen Funktion hat in der Pathologie in Verbindung gebracht. Allerdings ist die Bewertung Mikroglia - Funktion in vivo technisch anspruchsvoll . Wir haben eine einfache, aber robuste Technik für die präzise Überwachung entwickelt und die phagozytische Potenzial von Mikroglia in einer physiologischen Umgebung zu quantifizieren.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Isolierung der Netzhaut der gesamten Maus und zur Durchführung einer Immunfärbung zur Markierung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs). Dem Prozess folgt die Bildgebung und automatische Zählung von RGCs mit KI-basierter Software, die eine einfache, schnelle und genaue Methode zur Quantifizierung von RGCs in der gesamten Netzhaut der Maus bietet.

Immunfärbung und automatische Zählung von retinalen Ganglienzellen der Maus

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung primärer retinaler Müller-Zellen aus neonatalen Sprague-Dawley (SD) Ratten vorgestellt. Das Verfahren umfasst die Enukleation der Augäpfel, die Dissektion von Netzhautgewebe, die Extraktion und Identifizierung von Zellen sowie wichtige Überlegungen für die anschließende Zellkultur.

Isolierung und Kultivierung von primären retinalen Müller-Zellen aus Sprague-Dawley (SD) Ratten

Lernen Sie die Isolierung primärer muriner Retinal-Ganglion-Zellen durch Durchflusszytometrie. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für die Erforschung retinaler Degenerationskrankheiten.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

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