Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine angereicherte homogene Population von primären murinen retinalen Ganglienzellen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der retinalen Ganglienzellen zu den Mechanismen zu beantworten, die der abnehmenden Sehschärfe in Alterspopulationen und in populationen mit degenerativen Erkrankungen der Netzhaut zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein schnelles, sichtbares, reproduzierbares und standardisiertes Protokoll für die Isolierung von angereicherten primären murinen retinalen Ganglienzellen bieten kann.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als Sumana Chintalapudi, die damals Doktorandin in meinem Labor und Erstautorin dieser Studie war, in unserem Journal Club eine Arbeit von Krishna Murtheadol aus dem Jahr 2013 vorstellte, und ihre Studie zeigte deutlich, dass die RGC-Fünf-Zelllinie, die ursprünglich als immortalisierte retinale Ganglienzelllinie der Ratte erzeugt wurde, stammte nicht mehr von der Ratte und besaß auch nicht mehr den RGC-Phänotyp. Uns wurde klar, dass dieses Problem eine große Lücke in den Ressourcen hinterließ, die der Sehforschungsgemeinschaft, einschließlich unseres eigenen Labors, zur Verfügung standen. Sumana und ich wandten uns an Dr. Morales-Tirado und gemeinsam entwickelten wir drei eine neue Methode zur Isolierung von lebenden und hochangereicherten RGCs.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da das Ziel dieser Methode darin besteht, eine lebende und hochangereicherte Zellpopulation zu isolieren, die entweder als Primärzellen kultiviert oder als Zelllinie immortalisiert werden kann. Aus diesem Grund muss man sehr vorsichtig sein, um die Zellen, die man zu isolieren versucht, nicht zu beschädigen. Darüber hinaus müssen die Parameter der Zellsortiermethode auf die spezifischen Zellen zugeschnitten werden, die man zu isolieren versucht.

Beide Methoden erfordern besondere Fähigkeiten. Die Verfahren werden von Dr. Xiang Di Wang, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus Dr. Jablonskis Labor, und Herrn Zach Goldsmith, einem Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt. Um das Auge zu enukleieren, führen Sie zuerst eine Pinzette unter den Augenball ein.

Fassen Sie den Sehnerv und ziehen Sie ihn hoch. Der Globus wird mit intaktem Sehnerv enukleiert. Legen Sie das Auge in ein Fläschchen PBS auf Eis und enukleieren Sie das andere Auge.

Wenn alle Augen entnommen wurden, legen Sie ein Auge in eine Petrischale mit frischem PBS unter ein Präpariermikroskop und greifen Sie mit einer Pinzette vorsichtig nach dem Globus an der Basis des Sehnervs. Durchstechen Sie die Hornhaut mit einer scharfen 30-Gauge-Nadel, damit das Kammerwasser abfließen kann, damit das Auge leichter mit der Pinzette gehalten werden kann. Halten Sie die Hornhaut mit der Pinzette fest, machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt in das Hornhautgewebe und ziehen Sie mit der Pinzette die Hornhaut und die Sklera vorsichtig ab.

Wenn der Globus halb geschält ist, rollen Sie mit der Pinzette die Netzhaut und die Linse aus. Legen Sie die Netzhaut in eine kleine 40-Millimeter-Petrischale, die PBS und 1 % FPS enthält, in eine Biosicherheitswerkbank und waschen Sie die Netzhaut bei jeder Wäsche dreimal in frischem PBS plus FBS. Wenn alle Augen gewaschen wurden, legen Sie bis zu 12 Netzhaut auf ein steriles 70-Mikron-Nylonsieb, das mit PBS und FBS angefeuchtet ist, und mazerieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit dem hinteren Ende eines 10-Milliliter-Spritzenkolbens in kreisenden Bewegungen.

Wenn alle Zellen dissoziiert wurden, setzen Sie das Sieb auf ein Polypropylen-Sammelröhrchen und filtrieren Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette durch das Sieb in das Sammelröhrchen. Spülen Sie das Sieb mit PBS und FBS und sammeln Sie die Wäsche im Auffangröhrchen. Fügen Sie genügend PBS plus FBS hinzu, um das endgültige Volumen auf einen Milliliter Lösung pro Netzhaut zu erhöhen, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in PBS plus FBS in einer Konzentration von einem Milliliter Medium pro fünf Retinae, wenn die Immunmarkierung sofort durchgeführt werden soll. Alternativ können Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius in horizontaler Position im Nervenzellmedium resuspendieren. Um die Netzhautzellen immunzu markieren, zentrifugieren Sie die Suspension der Netzhautzellen und resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern frischem PBS plus FBS in einem Faxschlauch.

Reservieren Sie fünfmal 10 bis zu den sechsten Zellen für die unbeschriftete Negativkontrolle. Als nächstes blockieren Sie jede unspezifische FC-Rezeptorbindung in jedem Röhrchen mit einem Mikroliter Anti-Maus-CD 16 32-Antikörper pro einmal 10 an die sechste Zelle für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Blockierungsinkubation geben Sie den gewünschten Antikörpercocktail durch sanftes Pipettieren in die Zellen für eine 30-minütige Inkubation auf lichtgeschütztem Eis.

Waschen Sie dann die Zellen zweimal in einer Formel Liter Endvolumen von PBS und FBS. Markieren Sie die Zellen weitere 30 Minuten lang mit einem geeigneten Sekundärantikörper auf lichtgeschütztem Eis, gefolgt von zwei Waschungen in PBS plus FBS, wie gerade gezeigt. Resuspendieren Sie die Pellets in frischem PBS und FBS zum Zählen der Zellen.

Um den Ausgleich einzustellen, geben Sie drei Tropfen Polystyrol-Mikrokügelchen in einen sterilen Faxschlauch pro Florafor und ein Mikrogramm des jeweiligen Florafor in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Mikrosphären 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Waschen Sie dann die Mikrokügelchen in drei Millilitern PBS und FBS und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.

Suspendieren Sie die Mikrosphärenpellets in 250 Mikrolitern PBS und FBS und laden Sie das unmarkierte Probenröhrchen auf das Durchflusszytometer. Wählen Sie in der Durchflusszytometer-Software Experiment, Kompensationseinrichtung und Kompensationssteuerungen erstellen. Fügen Sie die florafor spezifischen Steuerelemente aus der angezeigten Liste hinzu und klicken Sie auf OK. Überprüfen Sie das vorwärts gestreute und seitlich gestreute Licht, und begrenzen Sie die anfängliche Population.

Setzen Sie dann das negative Kontrollröhrchen auf das Zytometer und klicken Sie auf Laden. Vergewissern Sie sich, dass die gewünschte Grundgesamtheit oder P1 angezeigt wird, und wählen Sie die Grundgesamtheit aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das P1-Gatter und wählen Sie Kompensation berechnen.

Klicken Sie dann auf Daten aufzeichnen. Wenn die Aufnahme beendet ist, klicken Sie auf Entladen, um die Röhre zu entfernen, und laden Sie die nächste Steuerröhre, um die Kompensationsregler anzupassen. Wenn alle Kontrollstichproben aufgezeichnet wurden, erstellen Sie ein Vorwärts- und ein Seiten-Streudiagramm für das erste Versuchsröhrchen, und gattern Sie die P1-Population.

Öffnen Sie als Nächstes ein Pseudofarbendiagramm für die Seitenstreuhöhe im Vergleich zur Seitenstreubreite und begrenzen Sie die einzelnen Zellen. Erstellen Sie mit den einzelnen Zellen ein Diagramm für die Vorwärts-Streuhöhe im Vergleich zur Vorwärts-Streubreite, und fügen Sie das Gate ein, um die Dublets auszuschließen. Generieren Sie dann ein CD48 versus CD90.2 Pseudo-Farbdiagramm und gattern Sie die CD90.2 positiven CD48 negativen Zellen, um die Monozyten zu eliminieren, gefolgt von einem CD57 versus CD15 Pseudo-Farbdiagramm, um alle Amakrinzellverunreinigungen zu eliminieren.

Definieren Sie nun die Populationen, die für die Stichprobe im Sortierlayoutblatt erfasst werden sollen, und sortieren Sie die Zellen. Am Ende der Sortierung wird ein Aliquot von 2,5 mal 10 bis zur vierten Zelle verwendet, um die Reinheit der isolierten Zellpopulation zu bestätigen. Nach dem Vernetzen der Netzhaut im Zellsieb können mehrere innere Netzhautzellen sichtbar gemacht werden, obwohl die retinalen Ganglienzellen aufgrund der Axotomie während des Zellisolationsverfahrens ihre charakteristische Morphologie verloren haben.

Der klassische Phänotyp mit einem positiven CD48-negativen Oberflächentyp ist nicht ausreichend, um die murinen retinalen Ganglienzellen zu identifizieren und zu isolieren, da diese Zellen Gene exprimieren, die mit amakrinen, mullerischen, bipolaren, horizontalen Photorezeptor- und retinalen Pigmentepithelzellen assoziiert sind. Die sortierten Zellen exprimieren auch retinale Ganglienzell-assoziierte intrazelluläre Marker wie Synuclein gamma, BRN3A, TUJ1 und RBPMS, wobei die intrazelluläre Lokalisation der Marker durch bildgebende Durchflusszytometrie weiter bestätigt wird. Einige der sortierten Zellen beginnen sogar, nach in vitro Zellkulturen eine retinale Ganglienzellmorphologie zu zeigen.

Darüber hinaus zeigt die quantitative PCR-Analyse der hochangereicherten sortierten Zellpopulation eine vielfache Zunahme der Gene, die für retinale Ganglien-spezifische intrazelluläre Marker kodieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Zellsuspension steril zu halten, die FC-Rezeptoren aus der Zellsuspension zu blockieren, eine unspezifische Bindung der Antikörper zu vermeiden und die Details oder Strategien zur Zellsortierung mit dem Bediener des Zellsortierers zu besprechen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie QPCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Erstellung von Genexpressionsprofilen zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Spezialgeräten, wie z. B. einem Zellsortierer, einen hochspezialisierten Bediener erfordert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Sehens, um die Überlebens- und Todesmechanismen in retinalen Ganglienzellen zu verstehen und neuartige Therapeutika zur Erhaltung des Sehvermögens zu entwickeln.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine angereicherte homogene Population primärer retinaler Ganglienzellen der Maus isolieren können.