Vorhersage des Gen-Silens durch die räumlich-zeitliche Kontrolle der siRNA-Freisetzung von photoreaktiven polymeren Nanocarriern

Das übergeordnete Ziel dieser Methoden ist es, die Effizienz des Gen-Silencings durch kleine interferierende RNA nicht vorhersagen zu können und die Kontrolle über die resultierenden Proteinexpressionsniveaus auf räumlich-zeitliche Weise zu erleichtern. Mit dieser Methode können Struktur, Funktionsbeziehungen und Reize reaktionsschneller Lieferträger aufgeklärt werden. Eine bessere Kontrolle über Bindung und Freisetzung kann übersetzbare Plattformen und Wirkstoffforschung sowie Technologien der regenerativen Medizin erschließen.

Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass die Veränderungen in der Genexpression auf der Basis als einfache siRNA-Freisetzungsassays und kinetische Modellierung kontrolliert und vorhergesagt werden können. Obwohl diese Methoden neuartige photoresponsive Polymere verwenden, kann dieser Satz von Assays leicht angepasst werden, um die große Vielfalt anderer stimuliresponsiver Systeme zu testen. Bereiten Sie zunächst eine siRNA-Lösung mit 32 Mikrogramm pro Milliliter vor, indem Sie siRNA zu einer 20-mikromolaren HEPES-Lösung bei einem pH-Wert von sechs hinzufügen.

Bereiten Sie dann eine Polymerlösung vor, indem Sie gelöste mPEG-Block-PolyAPN-BMA-Polymere zu einer 20 Millimolaren HEPES-Lösung bei einem pH-Wert von sechs hinzufügen. Um eine Konzentration von 220 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, ergibt sich aus dieser Konzentration ein N-zu-P-Verhältnis von vier, was bedeutet, dass viermal so viele Amingruppen auf dem Polymer vorhanden sind wie Phosphatgruppen auf siRNA. Geben Sie als Nächstes die Polymerlösung tropfenweise zu einem gleichen Volumen der siRNA-Lösung, während Sie sie vorsichtig auf einer Wirbelmaschine mischen.

Fahren Sie mit dem Vortexen für 30 Sekunden nach der Zugabe des Polymers fort. Inkubieren Sie die Proben dann 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Geben Sie die STS-Lösung tropfenweise zu jeder Nanocarrier-Lösung, während Sie sie vorsichtig auf einer Vortex-Maschine mischen.

Fahren Sie mit dem Vortexen für 30 Sekunden nach der SDS-Ausgabe fort. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Sekunden lang bei 3.000 g und inkubieren Sie die Proben dann 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Kalibrieren und stellen Sie einen UV-Laser mit einem 365-Nanometer-Filter auf eine Intensität von 200 Watt pro Quadratmeter ein.

Schneiden Sie dann ein Loch in eine Gummidichtung und legen Sie die Gummidichtung auf einen gewaschenen und getrockneten Glasschieber. Pipettieren Sie die Nanocarrier-SDS-Lösung auf den Objektträger im Loch der Gummidichtung. Laden Sie einen Überschuss der Lösung auf den Objektträger und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit der Gummidichtung.

Setzen Sie den zweiten Objektträger auf die Gleitdichtung. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, platzieren Sie zuerst ein Ende der Rutsche nach unten und senken Sie dann das andere Ende langsam ab. Befestigen Sie Bindeklammern an jeder Seite der Glaskammer, um sie fest zu halten.

Bestrahlen Sie die Proben für die gewünschte Zeitdauer mit dem UV-Laser mit dem 365-Nanometer-Filter bei einer Intensität von 200 Watt pro Quadratmeter. Entfernen Sie die Bindeklammern und öffnen Sie die Kammer. Als nächstes pipettieren Sie 25 Mikroliter der bestrahlten Nanocarrier-SDS-Proben auf Mikrozentrifugenröhrchen.

Inkubieren Sie die Lösungen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Geben Sie fünf Mikroliter der Ladepufferlösung zu 25 Mikrolitern jeder Nanocarrier-SDS-Probe. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 Minuten.

Laden Sie dann 30 Mikroliter jeder Nanocarrier-SDS-Probe in ein 2%iges Agarosegel, das mit Ethidiumbromid vorgefärbt ist. Lassen Sie das Gel im Dunkeln bei 100 Volt 30 Minuten lang laufen. Bilden Sie das Gel mit einem Gel-Imaging-System mit Ethidiumbromid-Filtern ab.

Speichern Sie die Gelbilddateien und fahren Sie mit der Quantifizierung der Biegeintensität fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Entfernen Sie die Papierstücke von einem doppelseitigen Klebeabstandhalter, um die Klebefläche freizulegen. Befestigen Sie den Abstandshalter an einem Glasabdeckglas.

Pipettieren Sie die Nanocarrier-SDS-Lösung auf den Deckglas. Legen Sie dann einen vorgewaschenen Objektträger mit dem Loch des Klebeabstandshalters mittig um die Probe herum auf den Deckglas. Drücken Sie auf den Glasschieber, um sicherzustellen, dass der Glasschieber und der Deckglas gut befestigt sind und eine Abdichtung bilden.

Verwenden Sie für FCS-Messungen ein konfokales Mikroskop mit einem 40-fach in Wasser eintauchenden, aperchromen Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,2. Verwenden Sie den entsprechenden Anregungslaserkanal, um mindestens 30 Messungen von jeweils 10 Sekunden pro Probe zu erfassen. Geben Sie dann die siRNA-Freisetzungsdaten von FCS in ein kinetisches Modell ein, um die Gen-Silencing-Reaktionen vorherzusagen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um die In-vitro-siRNA-Verabreichung vorzubereiten, geben Sie zunächst zwei Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang im Inkubator anhaften und sich erholen. Nachdem Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen haben, bereiten Sie sie für die Transvektion vor, indem Sie 1,5 Milliliter Serum und antibiotikafreies Transvektionsmedium hinzufügen.

Fügen Sie als Nächstes 25 Mikroliter Nanocarrier-Lösung hinzu, die 30 Pikosolen siRNA tp pro Vertiefung enthält. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig auf und ab, um es zu mischen. Legen Sie die Zellen für drei Stunden in den Inkubator.

Entfernen Sie das Transvektionsmedium und waschen Sie beide gut mit PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter supplementiertes Wachstumsmedium hinzu und legen Sie die Zellen in den Inkubator, um sich 30 Minuten lang zu erholen. Um die Zellen auf die Behandlung mit einem Photostimulus vorzubereiten, entfernen Sie das supplementierte Wachstumsmedium.

Geben Sie dann einen Milliliter Transvektionsmedium in jede Vertiefung. Nachdem Sie den UV-Laser wie im Textprotokoll beschrieben kalibriert haben, legen Sie die Zellen auf eine auf 37 Grad Celsius eingestellte Heizplatte. Entfernen Sie die Abdeckung von der Sechs-Well-Platte.

Bestrahlen Sie die Zellen für die gewünschte Zeit von oberhalb der Platte, indem Sie den UV-Laser mit einem 365-Nanometer-Filter mit einer Intensität von 200 Watt pro Quadratmeter verwenden. Entfernen Sie das Transvektionsmedium und fügen Sie zwei Milliliter ergänztes Wachstumsmedium hinzu. Legen Sie die Zellen bis zur weiteren Analyse in den Inkubator.

Um eine Fotomaske zu erstellen, die 365 Nanometer Licht vollständig blockiert und Reflexionen minimiert, schneiden, stanzen und/oder bearbeiten Sie zunächst die gewünschte Form in die Fotomaske. Kleben Sie die Fotomaske auf die Unterseite der Sechs-Well-Platte, wobei das Muster zentriert auf die Vertiefung mit den Zellen und die entspiegelte Seite zur Platte zeigt. Stellen Sie zwei Ringständer im Abstand von etwa 25 Metern auf und lösen Sie an jedem Ringständer eine Plattform, so dass die Plattformen gleich hoch sind.

Hängen Sie die Zellenplatte zwischen den beiden Ständern auf, indem Sie die Platte auf die Plattformen legen. Bestrahlen Sie die Zellen für die gewünschte Zeit von unterhalb der Probe mit einem UV-Laser mit einem 365-Nanometer-Filter mit einer Intensität von 200 Watt pro Quadratmeter. Entfernen Sie das Transvektionsmedium und fügen Sie zwei Milliliter ergänztes Wachstumsmedium hinzu.

Legen Sie dann die Zellen in den Inkubator, um sich mindestens 24 Stunden lang zu erholen. Bilden Sie die Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie ab, wie zuvor beschrieben. Hier sehen Sie ein Beispiel für eine einfache kinetische Modellierung der Dynamik des Gen-Silencing.

Das Modell wurde durchgeführt, um die Konzentrationen von mRNA, Protein und siRNA als Funktion der Zeit nach der photoinduzierten siRNA-Freisetzung vorherzusagen. Die relativen Mengen an siRNA, die nach unterschiedlichen Lichtdosierungen freigesetzt werden, wurden als anfängliche siRNA-Konzentration in das kinetische Modell eingegeben. Die daraus resultierenden Modellvorhersagen für die Proteinexpressionsniveaus stimmten mit den experimentell ermittelten Expressionsniveaus überein, die durch Western Blotting erhalten wurden.

Zur Visualisierung wurden GFP-exprimierende Zellen mit GFP-Targeting von siRNA behandelt und vor der Bestrahlung eine anuläre Photomaske auf die Platte gelegt, um ein kreisförmiges Muster zu erzeugen. Zellen, die vor dem Licht geschützt waren, wiesen eine Fluoreszenzintensität auf, die von Kontrollproben, die nicht mit siRNA und Licht behandelt wurden, nicht zu unterscheiden waren. Fast alle Zellen innerhalb des zirkulären Musters zeigten jedoch keine GFP-Expression, was auf eine effiziente siRNA-Freisetzung und einen effizienten Gen-Knockdown hinweist.

Darüber hinaus ist die Verwendung von Licht ein Trigger-fähiger Genexpression, der auf zellulären Längenskalen gesteuert werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode die schnelle Bestimmung von Bestrahlungsbedingungen ermöglicht, um die Freisetzung von siRNAs räumlich und zeitlich zu kontrollieren und das Gen-Silencing a priori vorherzusagen. Die Anwendung dieses Protokolls wird dazu beitragen, die Struktur-Funktions-Beziehungen aufzuklären, die die Stabilität und Wirksamkeit von Nanocarriern bestimmen.

Diese Technik könnte Anwendungen in der regenerativen Medizin ermöglichen, die eine räumliche und zeitliche Kontrolle der Genexpression erfordert. Diese Formulierungen eignen sich auch gut für die Behandlung von lokalisierten Erkrankungen wie Hautkrebs sowie dermatologischen Erkrankungen.