Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, retrovirale Vektorintegrationsstellen im Wirtsgenom zu identifizieren und die relativen Häufigkeiten klonaler Zellpopulationen zu quantifizieren, die sich jeweils dieselbe Integrationsstelle teilen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der retroviralen Gentherapie zu beantworten, z. B. welcher Teil des Wirtsgenomvektors integriert wurde, wie sich eine gentechnisch veränderte Zelle nach der Transplantation wieder besiedelt und wie sie sich funktionell unterscheiden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sequenzen an Retrointegrationsstellen mit höherer Genauigkeit und Empfindlichkeit analysiert werden können, indem sowohl vorgeschaltete als auch nachgeschaltete Vektor-Wirts-DNA-Verbindungen gleichzeitig sequenziert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Sicherheit von Vektoren und gentechnisch veränderten Zellen in Gentherapiestudien geben kann, kann sie auch auf andere grundlegende biologische Studien angewendet werden, um das Verhalten einzelner Zellen in vivo zu untersuchen. Der erste Schritt in diesem Verfahren besteht darin, die DNA-Konzentration und das Verhältnis der Absorption bei 260 und 280 Nanometern der zu analysierenden genomischen DNA zu bestimmen. Danach verdünnen Sie ein bis zwei Mikrogramm der genomischen DNA der Probe auf ein Endvolumen von 170 Mikrolitern genomischer DNA-Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser.

Bereiten Sie eine PCR-Reaktion von 200 Mikrolitern vor, indem Sie Folgendes in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen: je 2,5 Mikroliter HIV-1-spezifische Biotin-Primer oder insgesamt 10 Mikroliter für vier Lentivirus-spezifische Primer, 20 Mikroliter 10-fach thermostabiler DNA-Polymerase-Puffer, vier Mikroliter 10-fach dNTPs, drei Mikroliter thermostabile DNA-Polymerase und 163 Mikroliter genomische DNA. Teilen Sie die Lösung gleichmäßig in vier PCR-Röhrchen auf und führen Sie einen einzelnen Verlängerungszyklus unter den folgenden Bedingungen durch.

94 Grad Celsius für 5 Minuten, 56 Grad Celsius für 3 Minuten, 72 Grad Celsius für 5 Minuten und 4 Grad Celsius für die Lagerung. Fassen Sie alle vier PCR-Reaktionen in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Befolgen Sie das vom Hersteller beschriebene Verfahren eines PCR-Aufreinigungskits und eluieren Sie mit 50 Mikrolitern Elutionspuffer.

Bereiten Sie sich auf einen 100-Mikroliter-Aufschluss vor, indem Sie Folgendes in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben: 50 Mikroliter DNA, 10 Mikroliter 10X Puffer A, zwei Mikroliter RSAI-Enzym und 38 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler inkubieren.

Als nächstes fügen Sie der Reaktion einen Mikroliter CviQI-Enzym hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Wenn der RSAI- und CviQI-Aufschluss abgeschlossen ist, fahren Sie sofort mit dem stumpfen Ende fort. Bereiten Sie eine 4,5-Mikroliter-Mischung vor, die 2,5 Mikroliter DNA-Polymerase I, großes Fragment und 2 Mikroliter 10 millimolare dNTPs enthält.

Übertragen Sie 1 Mikroliter der Mischung in die DNA-Probe. Das Gesamtvolumen wird 102 Mikroliter betragen. Durch Vortexen gut mischen und eine Stunde bei 25 Grad Celsius inkubieren.

Fahren Sie sofort mit der Streptavidin-Perlenbindung fort, wenn die Inkubation abgeschlossen ist. Bereiten Sie die Streptavidin-Kügelchen vor, indem Sie die Bead-Lösung kurz vortexen und 50 Mikroliter in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Entfernen Sie den Überstand mit einem Magnetständer und waschen Sie die Bohnen mit 200 Mikrolitern Bindelösung.

Suspendieren Sie die Kügelchen wieder in 100 Mikrolitern Bindelösung und platzieren Sie das Röhrchen abseits des Magnetständers. 100 Mikroliter der Proben-DNA auf die 100 Mikroliter der resuspendierten Bead-Lösung übertragen und durch Pipettieren vorsichtig mischen, um ein Schäumen der Lösung zu vermeiden. Inkubieren Sie das Röhrchen 3 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad.

Verwenden Sie den magnetischen Ständer, um die Kügelchen einzufangen und den Überstand zu entsorgen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal in 400 Mikrolitern Waschlösung und zweimal in 400 Mikrolitern 1X T4 DNA-Ligase-Puffer. Suspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern 1X T4 DNA-Ligase-Puffer und platzieren Sie sie abseits des Magnetständers.

Die Linkerligatur sollte unmittelbar nach der Bindung der Streptavidin-Kügelchen durchgeführt werden. Bereiten Sie eine 400-Mikroliter-Ligationsreaktionslösung vor, indem Sie Folgendes in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. 0,5 Mikroliter des DNA-Linkers, 10 Mikroliter 10X T4 DNA-Ligase-Puffer, 20 Mikroliter 5X T4 DNA-Ligase-Puffer, 5 Mikroliter T4 DNA-Ligase, 164,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser und 200 Mikroliter der resuspendierten Kügelchen.

Das Reaktionsgefäß wird 3 Stunden lang bei Raumtemperatur auf ein rotierendes Rad gestellt. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit der Waschlösung und zweimal mit 1X thermostabilem DNA-Polymerase-Puffer. Suspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern 1X thermostabilem DNA-Polymerase-PCR-Puffer und platzieren Sie ihn abseits des Magnetständers.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine 200-Mikroliter-PCR-Reaktion vor, indem Sie den resuspendierten Beads Folgendes hinzufügen: 10 Mikroliter eines 1L-Primers, 10 Mikroliter 1R-Primer, 20 Mikroliter Primer Link1, 10 Mikroliter 10X thermostabiler DNA-Polymerase-Puffer, vier Mikroliter 10 milimolare dNTPs, acht Mikroliter thermostabile DNA-Polymerase und 88 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Aliquotieren Sie das Reaktionsgemisch in vier PCR-Röhrchen und führen Sie die PCR unter der folgenden Bedingung durch.

94 Grad Celsius für 2 Minuten, 25 Zyklen von 94 Grad Celsius für 20 Sekunden, 56 Grad Celsius für 25 Sekunden und 72 Grad Celsius für zwei Minuten und eine abschließende Verlängerung bei 72 Grad Celsius für 5 Minuten. Fassen Sie alle vier PCR-Reaktionen in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Befolgen Sie das Verfahren des PCR-Aufreinigungskits und eluieren Sie mit 50 Mikrolitern Elutionspuffer.

Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und das Verhältnis der Absorption bei 260 und 280 Nanometern mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer. Die DNA kann nun bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, bis sie für den nächsten Schritt bereit ist. Da die Verfahren für die spezifischen Amplifikationen des linken und des rechten Übergangs mit Ausnahme der in der PCR verwendeten Primer identisch sind, wird nur die Amplifikation des linken Übergangs demonstriert.

Bereiten Sie eine 50-Mikroliter-PCR-Reaktion vor, indem Sie Folgendes in einem PCR-Röhrchen mischen. Fünf Mikroliter DNA, fünf Mikroliter 10 mikromolare 2L-Primer, fünf Mikroliter 10 mikromolare Primer Link2, 5 Mikroliter 10x thermostabiler DNA-Polymerase-Puffer, ein Mikroliter 10 milimolare dNTPs, zwei Mikroliter thermostabile DNA-Polymerase und 27 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Führen Sie die PCR unter der folgenden Bedingung durch.

94 Grad Celsius für 3 Minuten, 8 bis 15 Zyklen von 94 Grad Celsius für 20 Sekunden, 56 Grad Celsius für 25 Sekunden und 72 Grad Celsius für zwei Minuten und eine abschließende Verlängerung bei 72 Grad Celsius für 5 Minuten. Verwenden Sie das PCR-Aufreinigungskit, um die DNA aufzureinigen und mit 50 Mikrolitern Elutionspuffer zu eluieren. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und das Verhältnis der Absorption bei 260 und 280 Nanometern.

Der letzte Schritt bei der Generierung von Sequenzbibliotheken für den linken und rechten Übergang besteht darin, die Längenvariationen des PCR-Amplikons durch Durchführung einer Kapillarelektrophorese zu analysieren. Dieses repräsentative Ergebnis zeigt unterschiedliche Längen von PCR-Amplikons in lentiviralen Vektorintegrationsstellen sowohl für die Upstream- als auch für die Downstream-Vektor-Host-Verbindungen. Der DNA-Größenmarker befindet sich auf der Spur M.

Nach der Sequenzierung der PCR-Amplikons wird die Sequenzanalyse an der computergestützten Integrationsstelle mit einem hauseigenen Programmierskript durchgeführt. Der bidirektionale Assay an der Integrationsstelle erzeugt PCR-Amplikons unterschiedlicher Größe sowohl für die vor- als auch für die stromabwärts gelegenen Vektorwirtsübergänge, die durch Kapillarelektrophorese sichtbar gemacht werden. Ein Vergleich der prozentualen Integration in den Genen Alu- und L1-Wiederholungen von lentiviralen Vektoren in humanisierten Mauszellen, die Zellen innerhalb von silico-generierten zufälligen Integrationsereignissen wieder besiedeln, zeigte, dass Integrationsstellen signifikant in Genen angereichert sind.

Die relativen Detektionshäufigkeiten von Vektorintegromen wurden nur anhand der Sequenzzahlen von Integrationsstellenverbindungen berechnet, die kleinere als 500bp PCR-Amplikons erzeugen. Etwa 77% der Vektoren konnten mit dem bidirektionalen Ansatz quantitativ analysiert werden. In der Strategie zur klonalen Quantifizierung gehen wir davon aus, dass jeder einzelne Klon das gleiche Vektorintegrom teilt.

Die relativen Häufigkeiten des linken und rechten Übergangs werden kombiniert, um die relativen Mengen der klonalen Populationen oder QVI darzustellen. Dieses Farbschema zeigt die relativen Häufigkeiten von 44 QVI-Klonen in humanisierten Mauszellen, die wieder besiedeln. Basierend auf einer in silico 10.000 zufälligen Integrationsanalyse wird eine 1,25-fache Überschätzung der klonalen Frequenzen bei der Verwendung von GTAC-Motivenzymen und eine 2,56-fache Überschätzung bei Verwendung eines TCGA-Motivenzyms erwartet.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in Teile geteilt und in zwei Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass PCR-Schritte extrem empfindlich sind und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um eine Kontamination zu vermeiden. Diese Technik hat den Weg für die Untersuchung der Sicherheit therapeutischer retroviraler Vektoren und für die Erforschung langfristiger Repopulationsmuster von hemotopoetischen Stammzellklonen nach einer Transplantation bei Rhesusaffen geebnet.