Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Das übergeordnete Ziel dieser Isolierungs- und Differenzierungsprotokolle besteht darin, Adipozyten-Vorläuferzellen aus perivaskulären Fettgeweben zu gewinnen und ihre Differenzierung zu reifen Adipozyten zu induzieren. Diese Methode ermöglicht die Analyse spezifischer und definierter Adipozyten-Vorläuferzellpopulationen aus perivaskulärem Fettgewebe mit minimalen Auswirkungen auf deren Morphologie, Lebensfähigkeit und Potenzial zur Proliferation und Differenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung eine erhöhte Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen pro Gramm Fettgewebe ermöglicht.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, machen Sie einen vertikalen Mittellinienschnitt entlang des Brustbeins zum Dammbereich der Ratte, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten. Legen Sie die Arteria mesenterica superior, die kleinen mesenterialen Widerstandsgefäße und die thorakale Aorta frei und durchtrennen Sie alle Verbindungen zum Mesenterium und zur Aorta. Sammeln Sie das gonadale Fettgewebe und übertragen Sie die isolierten Fettpolster in einen neuen Behälter mit Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer oder KRBB-Lösung, ergänzt mit 10 Millimolaren Haufen.

Übertragen Sie die Gefäße in eine Petrischale, die KRBB-Lösung enthält, und legen Sie die Schale unter ein Präpariermikroskop. Entfernen Sie perivaskuläres Fettgewebe aus den kleinen mesenterialen Widerstandsgefäßen und der Aorta. Übertragen Sie in einer Biosicherheitshaube etwa 50 Milligramm Gewebe in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen mit 1 Milliliter Kollagenase-Typ-I-Lösung und zerkleinern Sie das Gewebe in 1 bis 3 Millimeter große Stücke.

Es ist wichtig, das Fettgewebe ausreichend zu zerkleinern, damit die Kollagenase das Bindegewebe gründlich infiltrieren kann. Inkubieren Sie die Fragmente bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für 1 Stunde. Anschließend filtrieren Sie das verdaute Material nacheinander durch einzelne 100- und 40-Mikron-Zellsiebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Das resultierende Filtrat wird durch Zentrifugation aufgefangen und das Pellet in 1 Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen für eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz. Sammeln Sie dann die Zellen der stromalen Gefäßfraktion mit einer weiteren Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einem Basalmedium der stromalen Gefäßfraktion zur Zählung.

Um die Adipozyten-Vorläuferzellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung zu isolieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einem magnetisch aktivierten Zellsortier-Blockpuffer bei einer Konzentration von 1 mal 10 bis 6 Zellen pro Milliliter für eine 20-minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius. Es ist wichtig, dass alle Schritte der Isolierung bei 4 Grad Celsius und nicht auf Eis durchgeführt werden. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit 5 Mikrolitern FITC-konjugiertem Maus-Anti-CD34

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Inkubieren Sie dann die Zellen mit 4 Mikrolitern Anti-FITC-Mikrokügelchen in 96 Mikrolitern magnetisch aktiviertem Zellsortierpuffer für 5 Minuten im Dunkeln. Während die Zellen inkubieren, setzen Sie eine Multisortiersäule in den Magnetabscheider ein, unter der sich ein 5-Milliliter-Abfallrohr befindet.

Spülen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern magnetisch aktiviertem Zellsortierpuffer und entsorgen Sie das Abwasser und das Abwasserrohr. Platzieren Sie dann ein neues Röhrchen unter der Säule und laden Sie die Zellen auf die Oberseite der Säule, wobei Sie die unmarkierten CD34-negativen Zellen im neuen Sammelröhrchen sammeln. Wenn alle Zellen die Oberseite der Säule passiert haben, waschen Sie die Säule 3 Mal mit 500 Mikrolitern entgastem, magnetisch aktiviertem Zellsortierpuffer und fahren Sie mit dem Sammeln des Eluats im Sammelröhrchen fort.

Füllen Sie die Säule nach dem letzten Waschen in ein neues Sammelröhrchen und spülen Sie mit dem Säulenkolben 1 Milliliter magnetisch aktivierten Zellsortierpuffer durch die Säule in das Röhrchen, um die CD34-positiven Zellen zu sammeln. Sammeln Sie die Adipozyten-Vorläuferzellen durch Zentrifugation. Inkubieren Sie dann die CD34-positive Fraktion 30 Minuten lang in 10 Mikrolitern des von Kaninchen abgeleiteten antithrombozytenaggregationshemmenden Wachstumsfaktor-Rezeptors alpha.

Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen erneut und inkubieren Sie das Pellet in 4 Mikrolitern Anti-Kaninchen-IgG-Mikrokügelchen in 96 Mikrolitern magnetisch aktiviertem Zellsortierpuffer für die magnetische Bead-Isolierung der alpha-positiven Zellen des plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptors, wie gerade gezeigt. Um die CD34-positiven Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor-Alpha-positiven Adipozyten-Vorläuferzellen zu kultivieren, säen Sie die Zellen in einzelne 6-Well-Gewebekulturplatten in Basalmedium und legen Sie die Platten in einen 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator. Nach 3 seriellen Passagen säen Sie die Zellen in schwarze 96-Well-Gewebekulturplatten bei 1 mal 10 zu den 2 Zellen pro Well und bewerten Sie ihre Proliferation nach 8, 24, 48 und 96 Stunden bei 5 mal 10 zu den 4. Zellen pro Well, in 24-Well-Assay-Platten, gemäß Standard-Proliferations-Assay-Protokollen.

Um die Adipogenese zu induzieren, füttern Sie die Zellen der Adipozyten-Vorläuferzellkultur 48 Stunden lang mit dem Basalmedium der Adipozyten-Vorläuferzellen und behandeln Sie die Kulturen dann weitere 48 Stunden lang mit dem knochenmorphogenen Protein 4. Ersetzen Sie am dritten Tag das Medium durch ein Induktionsmedium für Adipozyten-Vorläuferzellen, ohne IBMX und Examethason für 14 Tage. Der Grad der Adipogenese in den Kulturen kann dann mit 1 mal 10 bis 4. Zellen pro Well in 48-Well-Gewebekulturplatten gemäß den Standard-Adipogenese-Assay-Protokollen beurteilt werden.

Obwohl beide Methoden eine ähnliche Verteilung und Lebensfähigkeit der Zellpopulation aufweisen, erzeugt die magnetisch aktivierte Zellsortierung bei der Isolierung im Vergleich zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung eine größere Anzahl von Zellen für die Kultur. In diesem repräsentativen Experiment wurde die in vitro Proliferation von magnetisch aktivierten zelllich sortierten stromalen Gefäßfraktionen und Adipozyten-Vorläuferzellen, die aus der thorakalen Aorta, kleinen mesenterialen Widerstandsgefäßen und gonadalem Fettgewebe männlicher Ratten isoliert wurden, 8, 24, 48 und 96 Stunden nach der Beschichtung unter Verwendung eines quantitativen DNA-Assays untersucht. Zu keinem Zeitpunkt wurden Unterschiede in den Expansionsraten der stromalen Gefäßfraktion beobachtet, mit Ausnahme der Adipozyten-Vorläuferzellen aus der thorakalen Aorta, die nach 96 Stunden eine geringere Proliferation zeigten, verglichen mit stromalen Gefäßzellen von derselben Stelle.

Die Stimulation konfluenter Adipozyten-Vorläuferzellen mit dem knochenmorphogenen Protein 4 für 48 Stunden induziert die Differenzierung der Adipozyten, was sich in einer größeren Lipidakkumulation in Tröpfchen zeigt, die sowohl durch einen fluoreszierenden Lipidaufnahme-Assay als auch durch eine Öl-Rot-O-Färbung bewertet wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 8 Stunden abgeschlossen werden, wenn sie korrekt ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, während der Isolationsschritte Temperaturen von 4 Grad Celsius aufrechtzuerhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Adipozyten-Vorläuferzellen isoliert und unterscheidet.