Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca ²⁺ Sensor Catcher ⁺

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, unsere Protokolle für die Kultivierung und Transfektion von HEK293- und C2C12-Zellen mit CatchER plus und seine Anwendung zur Überwachung von ERSR-Rezeptor-vermittelten Kalziumtransienten bei der Messung des NC2KD zu präsentieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Kalziumsignalisierung und der Bildgebung zu beantworten, wie z. B. die basale Kalziumkonzentration und ihre schnellen Änderungen in der ERSR bestimmter Zellen und wie der Biosensor CatchER plus für diese Messungen eingesetzt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Fluoreszenzreaktion einzelner Zellen in Echtzeit mit schneller Kinetik aufgezeichnet werden kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von ERSR-Kalzium-bedingten Krankheiten, da CatchER plus abnormale Kalziumtransienten in diesen Organellen überwachen kann, die durch dysfunktionale Kalziumsignalelemente entstehen. Die visuelle Demonstration für diese Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Zelltransfektion und der Fluoreszenzbildgebung schwer zu erlernen sind, da Zellkultur und Mikroskopie mehrere Fehlerbereiche aufweisen. Das Verfahren wird von Florence Reddish, einer Postdoktorandin aus unserem Labor, demonstriert.

Um dieses Experiment zu beginnen, säen Sie HEK293-Zellen auf den sterilisierten Glasobjektträgern in den sechs Zentimeterschalen und kulturieren Sie sie ein bis zwei Tage lang, bis sie am Tag der Transfektion zu etwa 70 % konfluierend sind. Leeren Sie dann DMEM aus der Schale und fügen Sie drei Milliliter des reduzierten Serummediums hinzu. Geben Sie dann die DNA-Transfektionsreagenzmischung in die Schale und inkubieren Sie sie vier bis sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Die Transfektion von HEK293-Zellen ist im Allgemeinen einfacher als bei anderen Zelllinien, aber die Zellen sind weniger widerstandsfähig gegen raue Bedingungen. Daher ist es wichtig, sie nur vier bis sechs Stunden lang Transfektionsreagenzien auszusetzen, um Apoptose zu vermeiden. Nach vier bis sechs Stunden waschen Sie die Zellen mit fünf bis sechs Millilitern HBSS.

Entsorgen Sie das HBSS aus der Schale und ersetzen Sie es durch drei Milliliter frisches DMEM. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Expression von GECI zu ermöglichen. Bei C2C12-Myoblastenzellen trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter Trypsin hinzufügen, um den Boden der Schale zu bedecken.

Stellen Sie die Schale anschließend für zwei bis sechs Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, damit das Trypsin die Zellen vom Boden der Schale lösen kann. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Trypsin und aspirieren Sie die Zellen in acht Millilitern DMEM. Pipettieren Sie die Zellen gründlich mit DMEM, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen und wieder zu suspendieren.

Säen Sie sie dann in sechs Zentimeter großen Kulturschalen auf die sterilen Deckgläser und fügen Sie dann drei Milliliter DMEM hinzu, um einen endgültigen Konfluenz von 60 % zu erreichen. Inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit fünf bis sechs Millilitern HBSS.

Entsorgen Sie das HBSS aus der Schale und ersetzen Sie es durch drei Milliliter frisches DMEM. Dann inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Expression des GECI zu ermöglichen. Schalten Sie bei diesem Vorgang das Mikroskop und die Lichtquelle ein und öffnen Sie dann das einfache PCI-Programm.

Decken Sie mit einem Wattestäbchen den Boden der flachen Bildgebungskammer mit offenem Diamantbad mit einer dünnen Schicht Dichtmittel ab. Nehmen Sie dann einen Objektträger mit den transfizierten Zellen aus dem Inkubator und spülen Sie ihn dreimal vorsichtig mit etwa einem Milliliter Ringer-Puffer mit 10 Millimolar Glukose und 1,8 Millimolar Calcium auf 37 Grad Celsius vorgeheizt. Lassen Sie etwa einen Milliliter Ringer-Puffer in der Schale, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern, und nehmen Sie den Objektträger mit einer Pinzette aus der Schale.

Nehmen Sie überschüssige Lösung auf, indem Sie den Rand des Objektträgers mit einem Laborgewebe berühren. Legen Sie es dann mit den Zellen in Richtung Fett auf die Seite der Kammer. Befestigen Sie anschließend die Kammer mit einem Schraubendreher auf der Bühnenhalterung.

Geben Sie etwa einen Milliliter Ringer-Puffer in die Kammer, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern, während Sie ihn auf den Tisch montieren und den Mikroskopaufbau vervollständigen. Schalten Sie das Mikroskopobjektiv auf das 40-fach Öl-Immersionsobjektiv um. Geben Sie einen Tropfen des Immersionsöls auf das Objektiv.

Setzen Sie anschließend die Montierung auf den Mikroskoptisch. Platzieren Sie dann die Vakuumspitze in der Kammer, um die Lösung nivelliert zu halten und ein Überfüllen zu verhindern. Heben Sie dann das Objektiv mit der Kurseinstellung an, bis das Öl auf dem Objektiv die Unterseite des Schlittens berührt.

Stellen Sie im Hellfeldmodus die Verstärkung auf 175 und die Belichtungszeit auf 0,03 Sekunden ein, um die Zellen zu fokussieren. Sobald die Zellen fokussiert sind, wechseln Sie in den Fluoreszenzmodus mit 488-Nanometer-Anregung und ändern Sie die Belichtungszeit auf 0,07 Sekunden. Suchen Sie ein Sichtfeld mit genügend gesunden Zellen mit ausreichender Fluoreszenz für die Bildgebung.

Nehmen Sie dann Bilder im Fluoreszenz- und Hellfeldmodus auf. Kreisen Sie einen interessanten Bereich in den Zellen ein oder kreisen Sie die gesamte Zelle ein, um die Intensität des ausgewählten Bereichs aufzuzeichnen. Starten Sie nun die Intensitätsmessung, wobei die Bildrate alle fünf Sekunden auf eins eingestellt ist.

Lassen Sie die Basislinienintensität für 20 bis 30 Frames stabilisieren. Berechnen Sie als Nächstes die benötigte Menge an 4-CMC aus einem 20-Millimolar-Stamm basierend auf dem endgültigen Kammervolumen von 450 Mikrolitern, um eine Endkonzentration von 200 Mikromolar zu erreichen. Übertragen Sie dann vorsichtig 60 Mikroliter Ringer-Puffer aus der Kammer in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Verdünnen Sie die berechnete Menge an 4-CMC mit dieser Lösung und geben Sie sie zurück in die Kammer, um die beabsichtigte Reaktion der abgebildeten Zellen hervorzurufen. Warten Sie Zeit, bis das Medikament an den Rezeptor bindet und das Signal nachlässt. Waschen Sie dann die Zellen mit drei bis sechs Millilitern Ringer-Puffer und fügen Sie gleichzeitig den Ereignismarker hinzu.

Wiederholen Sie die Verfahren für 100 mikromolare ATP und 15 mikromolare CPA unter Verwendung eines neuen Objektträgers der transfizierten Zellen für jeden Assay. Sobald die Messung abgeschlossen ist, beenden Sie die Datenerfassung im Fenster zur Intensitätsmessung im einfachen PCI-Programm. Machen Sie anschließend die Fluoreszenz- und Hellfeldbilder der Zellen.

Öffnen Sie dann die Datendatei für das Experiment. Kreisen Sie die Zellen oder Bereiche von Interesse erneut ein, um die Intensitätswerte bei Bedarf neu zu berechnen. Um die NC2KD- und C2C12-Myoblastenzellen zu bestimmen, wiederholen Sie den Transfektionsvorgang und geben Sie einen Milliliter calciumfreien Ringer-Puffer in die Kammer.

Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,002 bis 0,005 % Saponin und intrazellulärem Puffer für 15 bis 30 Sekunden, um die Zellen von CatchER plus zu entleeren, das sich möglicherweise im Zytosol befindet. Waschen Sie dann die Zellen mit drei bis sechs Millilitern KCL-Puffer, der EGTA und 10 mikromolares Ionomycin enthält. Lassen Sie die Intensität abnehmen, bis ein Plateau erreicht ist.

Spülen Sie anschließend die Zellen mit drei bis sechs Millilitern KCL-Puffer mit 10 mikromolaren Ionomycin und lassen Sie die Intensität stabilisieren. Fügen Sie anschließend verschiedene Kalziumlösungen hinzu, damit die Intensität zwischen den einzelnen Zugaben ein Plateau erreicht. Um den Sensor für die Quantifizierung der basalen Calciumkonzentration zu kalibrieren, verwenden Sie EGTA und 100 millimolaren Calciumpuffer, um die minimale und maximale Fluoreszenzintensität zu erhalten.

Hier sind die repräsentativen Merkmale für die normalisierte Intensität dargestellt, die von den permeabilisierten C2C12-Myoblastenzellen gesammelt wurden, die mit CatchER plus transfiziert wurden. Die Zellen wurden 15 bis 30 Sekunden lang mit 0,005 % Saponin im intrazellulären Puffer permeabilisiert. EGTA- und Calciumlösungen wurden in KCL-Puffer hergestellt, und N bezieht sich auf die Anzahl der abgebildeten Zellen.

Diese eingefügten Fluoreszenzbilder sind die Repräsentanten der Zellen vor und nach der Behandlung. 0,2, 0,6, zwei, fünf, 10, 20, 50 und 100 millimolare Calciumzellen wurden den permeabilisierten C2C12-Myoblastenzellen in Gegenwart von 10 mikromolaren Ionomycin zugesetzt, um eine KD von 3,1 plus oder minus 1,4 Millimolar zu erhalten. Diese Abbildung zeigt eine repräsentative Intensitätsmessung von CatchER plus transfizierten Zellen bei Minimal- und Maximalwerten nach Zugabe von jeweils einem Millimolar EGTA und 100 Millimolar Calcium mit je 10 mikromolaren Ionomycin.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in 30 bis 60 Minuten für die Bildgebung oder in drei Tagen durchgeführt werden, wenn die Transfektion eingeschlossen ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen immer in einer sterilen Umgebung zu handhaben, Reagenzien vor dem Experiment vorzubereiten, eine gleichmäßige Fettschicht auf die Kammer aufzutragen und Ihr Vakuum anzubringen, bevor Sie beginnen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blot durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie das Expressionsniveau von CatchER plus zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kalziumsignalisierung und -bildgebung, um die ERSR-Kalziumdynamik in Säugetierzellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit CatchER plus transfiziert und abbildet.