Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Herstellung von selbstorganisierten, dreidimensionalen Bündeln von longitudinal ausgerichteten astrozytären Spaltöffnungen und Prozessen innerhalb einer mikrometergroßen Hydrogel-Mikrosäule zur Verwendung als neurobiologisches In-vitro-Modell oder als neuroregenerative Therapie zu leiten. Traumata und neurodegenerative Erkrankungen sind für die Patienten besonders nachteilig, da die neurogene Kapazität in der inhibitorischen Umgebung eingeschränkt ist und die Regeneration im Zentralnervensystem einschränkt. Künstlich hergestellte astrozytäre Bundles gehen an die Grenzen aktueller Behandlungsstrategien heran, indem sie versuchen, wichtige neuroanatomische Merkmale und Glia-vermittelte Entwicklungsmechanismen zu replizieren, um eine gezielte Zellmigration und Axonwegfindung zu fördern.

Die Architektur dieser astrozytären Gerüste ist in erster Linie von den ausgerichteten astrozytären Prozessen in den Gliaröhren des rostralen Migrationsstroms inspiriert. Beginnen Sie mit der Zubereitung einer Agaroselösung mit 3 % Gewicht pro Volumen und DPBS in einem sterilen Becherglas. Halten Sie das Erhitzen und Rühren aufrecht, um zu verhindern, dass sich die Lösung vorzeitig verfestigt.

Führen Sie eine Akupunkturnadel in die untere Öffnung des Zwiebelspenders ein. Legen Sie ein Kapillarrohr über die freiliegende Nadel und sichern Sie die beiden, indem Sie einen Teil davon in den Gummibereich des Kolbenspenderzylinders einführen. Verschließen Sie den Zylinder, um die Montage abzuschließen.

Übertragen Sie einen Milliliter flüssige Agarose auf die Oberfläche einer leeren Petrischale. Während Sie die Gummikappe des Kolbenspenders einklemmen, führen Sie ein Ende des Kapillarrohrs in die Agarose ein und lassen Sie den Druck auf die Kappe ab, um Agarose in das Röhrchen zu ziehen. Legen Sie die Kolben-, Röhren- und Nadelbaugruppen auf eine Petrischale und lassen Sie die Agarose 5 Minuten lang in den Kapillarröhrchen erstarren.

Ziehen Sie dann die Nadel aus dem Kapillarrohr, so dass die Mikrosäule die Nadel immer noch umgibt. Schiebe die Mikrosäule mit den Spitzen des Foreceps an das Ende der Nadel, halte dann die Nadel über eine offene DPBS-enthaltende Petrischale und schiebe die Mikrosäule in die DPBS. Um Mikrosäulenschiffchen herzustellen, die die spätere Handhabung dieser Konstrukte erleichtern, beginnen Sie mit der Herstellung einer Agaroselösung mit einem Gewicht von 4 % pro Volumen und halten Sie die Lösung erhitzt und gerührt.

Bewege mit einer Pinzette eine Mikrosäule zu einer leeren Petrischale. Verwenden Sie dann bei der Arbeit unter einem Stereoskop ein Mikroskalpell, um die Mikrosäulen auf die gewünschte Länge zu trimmen, wobei die Enden in einem 45-Grad-Winkel geschnitten werden. Nachdem Sie drei weitere Mikrospalten abgeschnitten haben, richten Sie die vier Spalten parallel aus.

Laden Sie eine Pipette mit 50 Mikrolitern 4%iger Agaroselösung und geben Sie eine Linie Flüssigkeit über das Mikrosäulenarray, um die Konstrukte zu verbinden und zu einem Boot zu bündeln. 1 bis 2 Minuten abkühlen lassen, damit die 4%ige Agarose gelieren kann. Nehmen Sie dann mit einer feinen Pinzette das Mikrosäulenschiffchen an der verbindenden Agarosebrücke auf.

Und bringen Sie es in eine Petrischale, die DPBS enthält. Bringen Sie das Mikrosäulenschiffchen in eine Biosicherheitswerkbank und sterilisieren Sie es dreißig Minuten lang unter Einwirkung von ultraviolettem Licht. Bereiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank eine Lösung von 1 Milligramm pro Milliliter Rattenschwanzkollagen Typ 1 in Co-Kulturmedium vor.

Und dann auf Eis legen. Der pH-Wert der ECM-Lösung wird je nach Bedarf mit Säure oder Base eingestellt, bis der pH-Wert im Bereich von 7,2 bis 7,4 stabil ist. Übertragen Sie das Mikrosäulenschiffchen mit einer Pinzette in eine 35- oder 60-ml-Petrischale.

Platzieren Sie die 10-ml-Spitze einer Mikropipette mit dem Stereoskop an einem Ende jeder Mikrosäule und saugen Sie sie ab, um das Lumen von DPBS und Luftblasen zu entleeren. Füllen Sie eine P10-Mikropipette mit der Kollagenlösung. Platzieren Sie die 10-ml-Spitze an einem Ende jeder Mikrosäule und geben Sie genügend Lösung ab, um das Lumen zu füllen.

Pipettieren Sie dann ein ECM-Reservoir an beiden Enden der Mikrosäule. Sobald alle Säulen gefüllt sind, pipettieren Sie das Kokulturmedium in einem Ring um die Petrischale, um ein Austrocknen der Säulen zu verhindern. Inkubieren Sie die Schale mit den Mikrosäulen mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die Polymerisation des Kollagens zu fördern, bevor Sie Zellen hinzufügen.

Platzieren Sie anschließend die Spitze einer P10-Mikropipette an einem Ende einer Mikrosäule und geben Sie etwa 5 ml Zelllösung in das Lumen, um es zu füllen. Nachdem Sie alle Mikrosäulen in ein Boot gesetzt haben, inkubieren Sie es 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die Bindung der Astrozyten an die EZM zu fördern. Nach der Inkubationszeit werden die Schalen mit den sitzenden Mikrosäulen vorsichtig mit 3 oder 6 ml Kokulturmedium für 35 bzw. 60 ml Petrischalen gefüllt.

Halten Sie die plattierten Mikrosäulen und die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die Selbstorganisation der ausgerichteten astrozytären Bündel zu fördern, die nach sechs bis zehn Stunden eine gebündelte, kabelartige Struktur bilden sollten. Eine Stunde nach der Beschichtung haben die Astrozyten eine kugelförmige Form und verteilen sich im gesamten Konstrukt. Fünf Stunden nach der Plattierung initiieren Astrozyten die Prozessverlängerung und -kontraktion.

Acht Stunden nach der Beschichtung haben sich die Astrozyten ausgerichtet und zusammengezogen. 24 Stunden nach der Beschichtung hat sich in diesem Beispiel ein dichtes Bündel astrozytärer Prozesse gebildet. Dieses voll ausgebildete Astrozytenbündel zeigt 24 Stunden nach der Beschichtung den Reißverschlusseffekt, bei dem die Enden des Kabels an unterschiedlichen Enden der Wand des Lumens befestigt werden.

Dieses Video zeigt die Bündelung in Aktion, 3 bis 10 Stunden nach dem Plattieren. Die Immunmarkierung der astrozytären Gerüste zeigt die longitudinale Ausrichtung der astrozytären Prozesse. In diesem konfokalen Bild eines astrozytären Bündels wird der astrozytäre Marker GFAP abgelesen.

Und die Kerne sind in Blau zu sehen. Diese höhere Vergrößerung des Bündels ermöglicht es, die Zytoarchitektur der Astrozyten innerhalb der Mikrosäulen sichtbar zu machen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, lebende Gerüste herzustellen, die aus längsausgerichteten Astrozytenbündeln mit einer biologisch inspirierten Zytoarchitektur innerhalb einer Biomaterialhülle bestehen.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Transplantationsstrategie entwickelt werden, um die astrozytären Bündel mit oder ohne Biomaterialummantelung an verletztes Hirngewebe zu verabreichen, um die gerichtete Zellmigration aus neurogenen Regionen zu fördern und auf die begrenzende ZNS-Mikroumgebung zu reagieren. Darüber hinaus kann diese Technik als biofidele Modellierungsplattform für gliavermittelte neurobiologische Phänomene erweitert werden, die von der Nachahmung der nativen dreidimensionalen Umgebung und der inhärenten experimentellen Kontrolle von in vitro-Systemen profitieren.