Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren
30. Dezember 2017
Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist eine schnelle und effiziente Methode zum Präparieren von Puppenflügeln von Drosophila, die für Immunnachweise oder PCR-Assays geeignet ist. Das hier beschriebene Verfahren wurde aus dem Bedürfnis heraus entwickelt, eine schnelle und effiziente Methode zur Gewinnung von Puppenflügelproben zu finden, die für die Durchführung von PCR-Assays oder Immundetektionsprotokollen geeignet ist. Entfernen Sie mit einem feuchten Pinsel vorsichtig die Null-Stunden-APF-Puppe aus den Kulturfläschchen und legen Sie sie in neue Fläschchen, um die Entwicklungsphase abzuschließen.
Wenn Sie zum Beispiel eine Puppe verwenden, die 24 Stunden APF ist, würde sie nur 22 Stunden in der Durchstechflasche bleiben. Übertragen Sie die Puppe nach 22 Stunden mit dem doppelseitigen Klebeband auf den Objektträger. Diese Übertragung kann mit einem Pinsel erfolgen, um eine Beschädigung der Puppe zu vermeiden.
Die Puppe sollte in einer Reihe mit der Rückenseite nach oben und den Kopfenden in die gleiche Richtung positioniert werden. Danach stellen Sie den Objektträger wieder auf eine konstante Temperatur und lassen Sie die Puppe die entsprechende Entwicklungszeit abschließen. In diesem Fall wären es 24 Stunden.
Der Objektträger mit dem doppelseitigen Klebeband wird eine vorübergehende Präparierplattform sein, um das Puppengehäuse zu entfernen. Während der zwei Stunden auf dem Objektträger trocknet das Puppengehäuse, so dass es mit einer Pinzette leicht zerbrechlich ist. Der erste Schritt beim Sezieren besteht darin, die Puppe aus dem Kadaver zu entfernen.
Dann wird die Puppe auf eine andere Folie übertragen, auf die doppelseitiges Klebeband geklebt wird. Der Kadaver wird zurückgelassen. Diese Puppe wird mit der Bauchseite nach oben in die Mitte des Klebebandes geklebt.
Vor dem Flügelschnitt muss die Puppe mit einer Lösung gemäß dem immunhistochemischen Verfahren bedeckt werden. Diese Lösung ist fixierend und der Flügel wird von der Kutikula befreit. Entfernen Sie das Operculum vorsichtig mit einer Pinzette aus der Puppenhülle.
Brechen Sie das Gehäuse mit einer Pinzette und ziehen Sie eine Linie entlang der Seite der Puppe bis zum kaudalen Ende. Mit der entsprechenden Beleuchtung ist es möglich, die innere Form der Puppe sichtbar zu machen, so dass ein sichtbarer Raum direkt über dem Scharnier des Puppenflügels entsteht. Dieser Raum dient als Führung, um das Öffnen durchzuführen, ohne die Puppe zu beschädigen.
Wenn das Gehäuse seitlich geöffnet wird, ist es möglich, Teile davon zu entfernen, sie am offenen Rand aufzunehmen und auf die gegenüberliegende Seite zu tragen, wo sie mit dem doppelseitigen Klebeband gehalten werden. Am Ende der Sektion ist die Puppe fast nackt. Nur ein Stück Hülle bedeckt die hintere Spitze.
Drücken Sie mit Hilfe der Pinzette den Rest des Gehäuses vorsichtig nach unten. Durch diese Bewegung wird das innere Ende der Puppe angehoben, so dass sowohl der Kopf als auch der Thorax in einer bevorzugten Position bleiben, um an der nächsten Stufe festzuhalten. Nehmen Sie eine neue Folie mit doppelseitigem Klebeband und drehen Sie sie auf der Puppe um.
Drücken Sie dann leicht, damit die Puppe am Klebeband klebt, und schieben Sie den Schieber vorsichtig hinein, um die Puppe von den restlichen Hüllen zu entfernen. Drehen Sie den Objektträger um. Die Puppe wird auf der dorsalen Seite auf Höhe des Kopfes oder des Thoraxbereichs festgeklemmt.
Für die immunhistochemische Anwendung bedecken Sie die gesamte nackte Puppe mit 4% Paraformaldehyd. Nach 10 Minuten im Fixiermittel mit Hilfe einer Schere einen kleinen Schnitt im Scharnierbereich des Flügels oder in dessen Nähe machen. Lassen Sie das Fixiermittel das Flügelepithel erreichen.
Reißen Sie dann nach fünf Minuten mit einer Pinzette von den Nagelhauträndern, erweitern Sie das Loch und ermöglichen Sie die Freisetzung des Flügelepithels aus dem Nagelhautsack. Sobald das Flügelgewebe gelöst ist, lassen Sie es in der Paraformaldehydlösung, bis die 30-minütige Fixierung abgeschlossen ist. Die in diesem Video beschriebene Methode der Sektion kann verwendet werden, um qualitativ hochwertige Proben von Drosophila-Puppenflügeln aus verschiedenen Entwicklungsstadien für viele Arten von Techniken vorzubereiten.
Das Protokoll könnte durchgeführt werden, um eine Puppe oder mehrere Puppen gleichzeitig zu präparieren. Dies beschleunigt den Eingriff und macht es einfacher, eine große Anzahl von präparierten Flügeln zu erreichen. Um die nackte Puppe aus dem geöffneten Gehäuse zu entfernen, ist es wichtig, dass die hintere Spitze klein genug ist.
Obwohl es möglich ist, eine Reihe von vier oder fünf nackten Puppen gleichzeitig zu entfernen, ist dies kein relevanter Punkt, da die verbleibenden Puppen in aufeinanderfolgenden Schritten mit einem einzigen doppelseitigen Klebeband entfernt werden können. Dies ist ein konfokales Bild eines 24- bis 30-Stunden-APF-Flügels. Die Färbung zeigt die Expression des gepatchten Proteins, des kanonischen Rezeptors des Igels, der Zellkerne und der Aktinfilamente.
Ein ähnlicher Dissektionsprozess könnte verwendet werden, um größere Flügelproben zur Isolierung von mRNA zu gewinnen. Diese mRNA kann zur Synthese von cDNA verwendet werden, die in PCR-Reaktionen verwendet werden kann. Hier zeigen wir die Produkte, die zum Nachweis der Expression von Patched und Aktin gewonnen wurden.
Das Protokoll bietet eine unkomplizierte Methode zur Gewinnung von Puppenflügelproben, die die bekannte Morphologie des Flügels beibehalten. Aus diesen Präparaten ist es möglich, Stapel von Bildern zu erhalten, die als 2D- oder 3D-Bilder projiziert werden könnten, um die Verteilung und/oder die Anreicherung von Proteinen während der Differenzierung des Flügels zu untersuchen. Ein ähnliches Protokoll kann verwendet werden, um eine große Puppenflügelprobe zu entnehmen, die für die Synthese von cDNA erforderlich ist, einem Molekül, das für PCR-Reaktionen unerlässlich ist.
Dieses Verfahren stellt einen alternativen und komplementären Ansatz zu den bereits veröffentlichten Methoden zur Puppenflügeldissektion dar.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine schnelle und effiziente Methode zur Dissektion von Puppenflügeln von Drosophila beschrieben, die für verschiedene Techniken wie die Immunodetektion und PCR-Analysen unerlässlich sind. Das Verfahren zielt darauf ab, die Untersuchung der Lokalisation von Transkripten und Proteinen während der Entwicklung zu erleichtern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Das Verständnis der Lokalisation von Transkripten und Proteinen ist entscheidend für Entwicklungsstudien.
- Drosophila dient als Modellorganismus für genetische und entwicklungsgenetische Forschung.
- Eine effiziente Probenvorbereitung ist für genaue experimentelle Ergebnisse erforderlich.
- Immunodetektion und PCR sind gängige Techniken in der biologischen Forschung.
Zweck der Studie
- Eine einfache Methode zur Dissektion von Puppenflügeln bereitzustellen.
- Die Effizienz bei der Gewinnung von Proben für Immunodetektion und PCR-Analysen zu verbessern.
- Die Forschung zur Lokalisierung von Transkripten und Proteinen während der Drosophila-Entwicklung zu unterstützen.
Verwendete Methoden
- Vorsichtige Handhabung der Puppen mit einem feuchten Pinsel.
- Übertragung der Puppen mit doppelseitigem Klebeband auf Objektträger.
- Zeitpunkt der Übertragung anhand des Alters der Puppe bestimmen.
- Schädigung der Puppe während des Präparationsvorgangs minimieren.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht die Gewinnung intakter Puppenflügelproben.
- Die erhaltenen Proben eignen sich für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen.
- Das Verfahren ist schnell und minimiert die Belastung der Proben.
- Erleichtert genaue Lokalisierungsstudien in Drosophila.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode eignet sich zur Dissektion von Puppenflügeln.
- Sie unterstützt die Untersuchung von Entwicklungsprozessen bei Drosophila.
- Die Technik kann an verschiedene experimentelle Anforderungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Eine effiziente Probenvorbereitung von Drosophila-Puppenflügeln ermöglicht den zuverlässigen Nachweis der Transkript- und Proteinausprägung und unterstützt so die Zielvalidierung sowie die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Diese Methode bietet einen schnellen, reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Erzeugung biologischen Materials hoher Qualität, das für nachgeschaltete Analysen geeignet ist, und verringert die Variabilität bei der phänotypischen Bildschirmung und der Assay-Entwicklung. Durch die Standardisierung der Flügel-Dissektion können Forschungsteams das Vorhersagevertrauen in die Pfadanalyse verbessern und Ziele mit stärkerer mechanistischer Begründung priorisieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch lokalisierte Nachweise von Proteinen wie Patched, einem kanonischen Hedgehog-Rezeptor, in sich entwickelndem Flügelgewebe.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem konsistente Probenahmen über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg zur Klärung von Signalwegen ermöglicht werden.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Beurteilung der Zielmolekülbindung und von Expressionsmustern, die für die Identifizierung von Leitstrukturen und die Selektion von Wirkstoffportfolios entscheidend sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt intakte Puppenflügelproben, die für Immunodetektion und PCR-Analysen geeignet sind, und ermöglicht quantitative Aussagen zur Gen- und Proteinexpression.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen.
- Eignung für Analysen: Erzeugt Material, das mit nachgeschalteten molekularen Analysen kompatibel ist, und unterstützt so die zuverlässige Bewertung von Substanzen in phänotypischen Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Bietet ein krankheitsbezogenes System zur Untersuchung der Morphogenese mit direkter Anwendbarkeit für die Modellierung entwicklungsbiologischer Signalwege.
- Mechanistische Ent风险minimierung: Ermöglicht die Visualisierung der Proteinverteilung und -anreicherung während der Differenzierung und liefert damit Hinweise zur Zielvalidität.
- Präklinische Abstimmung: Unterstützt die Beurteilung von Biomarkern durch nachweisbare Expression von Markern wie Actin und Patched im Flügel-Epithel.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Assay-Entwicklung bis zur präklinischen Evaluation ein und bietet eine wiederverwendbare Probenvorbereitungstechnik für auf Drosophila basierende Studien.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem sie die Kommunikation zwischen Adernzellen und die Bildung von Queradern während der Puppenentwicklung nachweisen ermöglicht.
- Screening: Stellt assaysbereite Proben mit konsistenter Morphologie bereit und erhöht dadurch die Zuverlässigkeit von immunhistochemischen Nachweisen und PCR-basierten Messungen.
- Analysen: Ermöglicht die quantitative Bestimmung von Transkript- und Proteinspiegeln und unterstützt somit den vergleichenden Ansatz unter verschiedenen genetischen oder experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe Entdeckungen mit präklinischer Validierung durch konservierte Entwicklungsmechanismen, die in der Flügelmorphogenese beobachtbar sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein standardisiertes Präparationsprotokoll, das auf mehrere Projekte zur Erforschung der Entwicklungsgenetik von Drosophila anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten in Entwicklungsprozessen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Probenvorbereitung und unterstützt damit eine konsistente Assay-Leistung.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige Daten zur Zielexpression und -lokalisation bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Fortschrittsentscheidungen durch qualitativ hochwertigere mechanistische Daten aus reproduzierbaren Proben.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Kenntnisse im Umgang mit Drosophila und in der Mikroskopie.
- Basiert auf Standardwerkzeugen: feuchter Pinsel, Pinzette, Objektträger mit doppelseitigem Klebeband und 4 % Paraformaldehyd.
- Erfordert eine präzise zeitliche Abstimmung in Stunden nach der Puppenbildung (APF), um die Entwicklungsstadien abzugleichen.
- An verschiedene Entwicklungsstadien der Flügel anpassbar, jedoch optimal für Puppen im Zeitraum von 24–30 Stunden APF.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer sorgfältigen manuellen Dissektion, um Gewebeschäden zu vermeiden, wobei die Fähigkeiten mit der Übung verbessert werden können.
