Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Ziel dieses Verfahrens ist es, klonale Knockout-Zelllinien zu isolieren und zu identifizieren, die durch zwei Arten von CRIPSR/Cas9-vermittelter Genomeditierung erzeugt wurden. Eine Methode weist Protein-Knockouts nach, die durch nicht-homologe Endverbindung verursacht werden, während die andere genomische Störungen erkennt, die durch homologiegesteuerte Reparatur erzeugt werden. Diese Methode ist besonders nützlich im Bereich der Molekularbiologie, wo die Erzeugung von Zelllinien mit genetischen Störungen ein wichtiges Werkzeug zur Entschlüsselung der Genfunktion ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine schnelle und relativ hohe Durchsatzmethode handelt, die mit grundlegenden molekularbiologischen Techniken leicht ausgeführt werden kann. Die nicht-homologe Endverknüpfung führt zu kleinen Deletionen oder Insertionen und wird mit einem Punkt-Immunoblot bewertet, während die homologiegerichtete Reparatur größere und präzisere Störungen ermöglicht und durch Kolonie-PCR beurteilt wird. In diesem Experiment werden T-REx-293-Zellen verwendet, die in DMEM-Medien kultiviert wurden, ergänzt mit 10 % FBS bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Vor der Transvektion werden die Zellen auf Sechs-Well-Platten plattiert und mit einem Well für eine nicht transvektierte Kontrolle versehen. Lassen Sie die Zellen auf eine Konfluenz von ca. 70 % wachsen. Transvektieren Sie die Zellen mit 2,5 Mikrogramm Gesamtplasmid unter Verwendung eines kommerziellen Transvektionsprotokolls.

Für die Transvektion von Zellen ohne Selektion verwenden Sie 2,5 Mikrogramm Cas9-sgRNA-Plasmid. Für die Transvektion von Zellen mit Selektion verwenden Sie 0,75 Mikrogramm Cas9-sgRNA1, 0,75 Mikrogramm Cas9-sgRNA2 und ein Mikrogramm homologe Rekombinationsvorlage. Inkubieren Sie die transvektierten Zellen und die nicht transvektierte Kontrolle 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Bei Zellen, die mit Selektion transvektiert wurden, beginnen Sie die Arzneimittelauswahl, indem Sie die Zellen mit dem entsprechenden Arzneimittel behandeln, das in diesem Fall Neomycin ist. Setzen Sie die Sechs-Well-Platte wieder in den Inkubator ein. Beobachten Sie die behandelten Zellen einmal täglich, um die Zelltodrate zu überprüfen, bis alle Zellen in der nicht transvektierten Kontrolle absterben.

Um klonale Populationen zu isolieren, züchten Sie die Zellen zunächst nach der Selektion in der ursprünglichen Vertiefung auf 100%ige Konfluenz. Nehmen Sie als nächstes serielle Verdünnungen der Zellen vor und zählen Sie die Zellen. Da die richtige Erzeugung monoklonaler Kolonien der Schlüssel zum Erreichen eines vollständigen Knockouts ist, muss darauf geachtet werden, die richtige Verdünnung für sitzende Zellen bei der gewünschten Dichte zu bestimmen.

Sobald die richtige Verdünnung bestimmt wurde, setzen Sie die Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 0,33 Zellen pro Well ein. Das Platzieren von drei 96=Well-Platten ist ein guter Ausgangspunkt, um die Isolierung von mehr als einem korrekten Klon zu gewährleisten. Beobachten Sie die Völker über einen Zeitraum von zwei bis vier Wochen, bis die Völker mit dem Auge sichtbar sind.

Diese repräsentativen Bilder zeigen Kolonien in verschiedenen Wachstumsstadien. Eine einzelne Zelle beim Sitzen, Zellen am fünften Tag und eine gut etablierte Kolonie am 10. Tag. Entnehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze die sichtbaren Kolonien mit Sorgfalt und Präzision und setzen Sie sie in neuen Vertiefungen wieder ein, um das Wachstum der Monoschicht zu fördern.

Setzen Sie das Wachstum der Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid fort. Knockout-Kandidaten ohne Selektion werden mit einem Punkt-Immunoblot gescreent, um das Proteinprodukt im Hochdurchsatz zu bewerten. Nachdem Sie einzelne Klone auf eine Konfluenz von 50 bis 100 % gezüchtet haben, entfernen Sie die Monoschicht der Zellen durch Pipettieren in der Vertiefung.

Aliquotieren Sie 90 Mikroliter des Gesamtvolumens von 100 Mikrolitern aus jeder Vertiefung in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen. Für die Zwecke dieses Videos werden nur zwei Proben verarbeitet. Schleudern Sie fünf Minuten lang mit 6.000 U/min, entfernen Sie das Medium und lysieren Sie die Zellpalette in 10 Mikrolitern 1X SDS-Ladepuffer.

Geben Sie 90 Mikroliter neues Medium zu den restlichen Zellen in der Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um die Zellen weiter zu vermehren. Pipettieren Sie einen Mikroliter Zelllysat auf eine trockene Nitrozellulosemembran, um einen Punkt zu bilden. Tupfen Sie jede Probe zweimal auf zwei separate Membranen, wodurch zwei identische Probenmuster entstehen.

Blockieren Sie die Membranen in 5%iger Milch in TBST bei Raumtemperatur unter Schaukeln für eine Stunde. Nach einer Stunde tupfen Sie die Membranen mit Primärantikörpern in der empfohlenen Primärantikörperverdünnung und TBST plus 5 % Milch ab. Auf einer Membran wird in diesem Experiment der Primärantikörper gegen das Zielprotein ELAVL1 verwendet.

Auf der anderen Membran wird der Primärantikörper für ein Kontrollprotein verwendet, von dem nicht erwartet wird, dass es sich verändert, hier wird PUM2 verwendet. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus jedem Blot, fügen Sie TBST hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Waschen Sie die Kleckse auf diese Weise dreimal mit TBST. Anschließend wird jeder Membran der entsprechende HRP-konjugierte Sekundärantikörper zugesetzt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur abtupfen. Waschen Sie die Membranen nach einer Stunde dreimal jeweils fünf Minuten lang mit TBST.

Tragen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers eine chemilumineszierende Substratlösung auf die Blots auf und bilden Sie die getupften Membranen auf einem digitalen Chemilumineszenz-Imager ab. Quantifizieren Sie schließlich die Punktintensitäten für das Ziel- und Kontrollprotein mit der entsprechenden Software und analysieren Sie die Ergebnisse, wie im Textprotokoll beschrieben. Kandidaten mit dem selektierbaren Resistenzmarker werden mittels Kolonie-PCR gescreent.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einzelne Kolonien in einer neuen 96-Well-Platte duplizieren und sie für die Herstellung von Zelllysaten auf 100 % Konfluenz züchten. Entfernen Sie das Medium von einem Satz der Klone, resuspendieren Sie die Zellen aus jeder Vertiefung in 30 Mikrolitern Extraktionspuffer aus einem kommerziellen DNA-Vorbereitungskit und geben Sie es in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Erhitzen Sie die Lösung 15 Minuten lang auf 96 Grad Celsius und lassen Sie sie dann auf Raumtemperatur abkühlen.

Geben Sie 30 Mikroliter Stabilisierungspuffer in jedes Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es gut. Um Wildtyp- und monoallelische oder biallelische Mutantenlinien durch Kolonie-PCR zu identifizieren, entwerfen Sie zwei separate Sätze von PCR-Primern, um Regionen um die Homologiearme herum zu amplifizieren, basierend auf einer erfolgreichen oder erfolglosen Integration der Resistenzkassette. Verwenden Sie auf jeder Seite einen gemeinsamen Primer, der außerhalb des Homologiearms annehmt.

Um das Wildtyp-Allel zu testen, verwenden Sie den gemeinsamen Primer mit dem entsprechenden gepaarten Primer, der komplementär zu der endogenen Sequenz ist, die die Homologieregion umfasst. Um auf die gewünschte Mutation zu testen, verwenden Sie den gemeinsamen Primer mit einem anderen gepaarten Primer, der die eingesetzte Resistenzkassette ergänzt. Für jede zu prüfende Probe ist ein Reaktionsgemisch herzustellen, das Folgendes enthält: 0,5 Mikroliter Zelllysat, 1,25 Mikroliter 10X KOD-Puffer, 0,75 Mikroliter 25 Millimolare Magnesiumsulfate, 1,25 Mikroliter zwei Millimolare dNTPs, 0,375 Mikroliter Forward-Primer, 0,375 Mikroliter Reverse-Primer, 0,25 Mikroliter KOD-Polymerase und 7,75 Mikroliter Wasser.

Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen durch: 95 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 25 Zyklen mit 95 Grad Celsius für 20 Sekunden, Primer-Schmelztemperatur für 10 Sekunden und 70 Grad Celsius für 20 Sekunden pro KB. Anschließend visualisieren Sie die PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese. Zur Generierung von ELAVL1-Knockout-Linien wurde eine Genom-Editierung mittels nicht-homologer Endverknüpfung durchgeführt, gefolgt von einem Punkt-Immunoblot, der auf ELAVL1 und PUM2 untersuchte. Klone, die nur ein geringes Steuersignal zeigten, wurden mit einem X markiert und von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Klone mit niedrigen ELAVL1-Signalen wurden weiter mittels Western Blot getestet. Bestätigte Kandidaten sind grün und ungültige Kandidaten grau gekennzeichnet. Diese Grafik zeigt die Verhältnisse von ELAVL1 zur Steuerung des Proteinsignals in aufsteigender Reihenfolge.

In den meisten Fällen wurden klonale Populationen mit dem geringsten relativen ELAVL1-Signal korrekt als Knockouts identifiziert. Kandidaten, die mit der homologiegerichteten Reparaturmethode erzeugt wurden, wurden durch Kolonie-PCR gescreent und die PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese visualisiert. Gezeigt werden Beispielergebnisse mit Primern, die den Upstream-Integrationsübergang überspannen, mit endogenen Inside-Primern und Knockout-Inside-Primern.

Die Primer wurden zunächst sowohl in elterlichen Zellen als auch in selektierten Massenzellen validiert. Die Ergebnisse von 24 einzelnen Klonkandidaten werden zusammen mit den erwarteten Bandenmustern für Wildtyp-, Knockout- und monoallelische Deletionsklone gezeigt. Die schwarzen Pfeile zeigen die korrekten Amplifikationsprodukte an, Sterne zeigen biallelische Knockout-Klone an.

Die biallelischen Mutantenlinien wurden durch Western Blot weiter validiert. Bei der nicht-homologen Endverknüpfung wird ein einziger Cas9-Schnitt und ein selektionsunabhängiges Screening verwendet, so dass nur eine geringe Vorabvorbereitung erforderlich ist, und das Screening auf Knockout-Klone durch Dot-Blots kann schnell feststellen, ob eine Knockout-Generierung erfolgreich war. Das PCR-basierte Screening erkennt genau korrekte Kandidaten mit großen genomischen Störungen, die durch homologiegesteuerte Reparatur erzeugt werden.

Diese Techniken ermöglichen es Forschern in der Molekularbiologie, Knockouts einfach und effizient zu identifizieren und normale oder dysfunktionale zelluläre Prozesse anhand von Zelllinien zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man klonale Knockout-Zelllinien isoliert und identifiziert, die durch CRISPR/Cas9-vermittelte Genomeditierung erzeugt wurden.