Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Chromatin-Immunpräzipitation in Maus-T-Zelllinien effizient und mit hoher Reproduzierbarkeit innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens durchzuführen, um die Verteilung von Histonmarkierungen in spezifischen genomischen Regionen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Chromatinbiologie zu beantworten, insbesondere im Zusammenhang mit T-Zellen, beispielsweise wie die Chromatinstruktur während der Teilung oder Aktivierung von T-Zellen reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Chromatinspaltung effizient und äußerst reproduzierbar ist.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Bedingungen für das Chromatinscheren schwierig zu etablieren sind, weil die Schritte mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol herausfordernd sein können. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert Francesca Ferrante, eine Doktorandin in unserem Labor. Am ersten Tag überführen Sie die Maus-T-Zellen von einer 6-Loch-Platte in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Anschließend die Zellen fünf Minuten bei 24 Grad Celsius und etwa 271 × g zentrifugieren. Nach dem erneuten Aufschwemmen des Zellenpellets in 30 Milliliter IMDM-Zellkulturmedium die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zählen. Aliquote von jeweils 20 Millionen Zellen in neue 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Danach Formaldehyd direkt zum Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen, und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Fügen Sie anschließend ein Achtel des Volumens einer einmolarigen Glycinlösung mit pH 7,5 hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten bei 24 Grad Celsius und etwa 271 × g. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Zellpellet in 10 Milliliter gepuffertem Phosphatsalzlösung (PBS) resuspendieren und die Zentrifugation wiederholen. Waschen Sie die Zellen erneut mit einem Milliliter PBS.

Überführen Sie die resuspendierten Zellen vor der Zentrifugation in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Das Scheren der Chromatin ist der kritischste Schritt, da es von der Zellmenge, den Scher-Röhrchen, dem Gerät, dem Lysepuffer sowie den Scherparametern abhängt. Nach der Wäsche resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter SGS-Lysepuffer und inkubieren es auf Eis.

Nach 10 Minuten jede Probe in ein Sonikationsröhrchen überführen. Anschließend die Fragmentierung mit einem fokussierten Ultraschallgerät gemäß den im Textprotokoll angegebenen Einstellungen durchführen. Nach der Fragmentierung die Proben in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei vier Grad Celsius und etwa 18.000 × g. Danach überführen Sie das Überstand in neue Röhrchen. Sammeln Sie 50 Mikroliter zur Bestimmung der Scherwirkungsgrad und schockfrieren Sie das geschnittene Lysat in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie das Lysat in Einweg-Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius.

Um die Scherwirkung zu bestimmen, geben Sie zunächst 50 Mikroliter Elutionspuffer zu 50 Mikrolitern jedes geschernten Lysats hinzu. Inkubieren Sie die Ansätze über Nacht bei 65 Grad Celsius unter Schütteln. Am zweiten Tag geben Sie 100 Mikroliter TE-Puffer und vier Mikroliter Rnase A (10 Milligramm pro Milliliter) zu den Proben hinzu.

Mischen Sie die Proben und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Geben Sie dann zwei Mikroliter einer 20 Milligramm pro Milliliter-Proteinase-K-Lösung zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie erneut zwei Stunden bei 55 Grad Celsius unter Schütteln. Überführen Sie anschließend jede Probe in ein Gelröhrchen, das für die Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion geeignet ist.

Behandeln Sie die Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie 200 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und schütteln Sie die Röhrchen. Überführen Sie nach der Zentrifugation die obere Phase in neue Röhrchen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Reinigen Sie die DNA mithilfe von Reinigungssäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers, wobei die Membran zweimal gewaschen wird. Lassen Sie nach dem letzten Waschschritt das Röhrchen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur geöffnet, um das restliche Ethanol zu verdampfen.

Für die Elution 50 Mikroliter Wasser auf die Säule geben und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend das Röhrchen eine Sekunde lang zentrifugieren, um die Membran vollständig zu benetzen. Die Membran eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren, bevor die DNA durch Zentrifugation eluiert wird.

Quantifizieren Sie die gereinigte DNA mit einem Fluorometer unter Verwendung eines Hochsensitivitätskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Analysieren Sie abschließend etwa 500 Nanogramm der gereinigten DNA in einem 1,8 %igen Agarosegel und etwa ein Nanogramm der gereinigten DNA in einem Elektrophorese-System unter Verwendung eines Hochsensitivitätskits.

Am dritten Tag verdünnen Sie ein Volumen des gesonifizierten Lysats mit fünf Volumina Verdünnungspuffer. Präklären Sie das verdünnte Lysat mit 30 Mikrolitern pro Milliliter Protein A-Agarose-Kügelchen für 30 Minuten unter Rühren im Kühlschrank. Zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius für fünf Minuten bei etwa 750 × g. Sammeln Sie 10 % des geklärten Lysats als Input-Proben und lagern Sie diese bei vier Grad Celsius.

Als Nächstes aliquotieren Sie die gewünschte Menge des geklärten Lysats in neue Röhrchen. Fügen Sie dann die ausgewählten Antikörper zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rühren. Am vierten Tag geben Sie 40 Mikroliter Protein-A-Kügelchen hinzu.

Die Mischung eine Stunde bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Die Kügelchen mit einem Milliliter Puffer mit niedriger Salzkonzentration waschen, indem sie fünf Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubiert werden. Anschließend drei Minuten bei vier Grad Celsius und etwa 950 × g zentrifugieren. Den Waschschritt mit Puffer mit hoher Salzkonzentration, Lithiumchlorid-Puffer und TE-Puffer wiederholen.

Dann 110 Mikroliter Elutionspuffer zu den Proben hinzufügen. Die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, wobei alle zwei Minuten verwirbelt wird. Nach erneutem Zentrifugieren 100 Mikroliter Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.

Wiederholen Sie die Elution mit 100 Mikrolitern Elutionspuffer und vereinigen Sie die Eluate. In der Zwischenzeit fügen Sie Elutionspuffer zu den zuvor gesammelten Input-Proben hinzu, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Inkubieren Sie alle Proben über Nacht bei 65 Grad Celsius unter Schütteln.

Am fünften Tag 200 Mikroliter TE-Puffer zu jedem Eluat und acht Mikroliter Rnase A mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Die Proben vor der Inkubation zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mischen. Anschließend vier Mikroliter Proteinase K mit einer Konzentration von 20 Milligramm pro Milliliter zu jedem Eluat hinzufügen, bevor die Probe zwei Stunden bei 55 Grad Celsius unter Schütteln inkubiert wird. Danach jede Probe in ein Gelröhrchen überführen, das für die Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion geeignet ist.

Fügen Sie 400 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und schütteln Sie die Röhrchen. Nach der Zentrifugation übertragen Sie die obere Phase in neue Röhrchen und wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Reinigen Sie abschließend die DNA wie zuvor mit Reinigungssäulen.

Dieses repräsentative Ergebnis der Beschallung von Maus-T-Zelllinien zeigt eine effiziente Fragmentierung des Chromatins. Dargestellt ist ein repräsentativer Chromatin-Immunpräzipitationsversuch in Maus-T-Zelllinien. Der Promotor des Housekeeping-Gens Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase weist eine starke Anreicherung der Trimethylierung des Lysins vier am Histon drei auf.

Sowie die Acetylierung von Lysin 27 am Histon drei, jedoch nicht für die Monomethylierung von Lysin 4 am Histon drei. Umgekehrt ist der Enhancer des inaktiven Gens deltex-1 stark angereichert für die Monomethylierung von Lysin 4 am Histon drei.

Aber schlecht angereichert für die Trimethylierung von Lysin vier am Histon drei und die Acetylierung von Lysin 27 am Histon drei. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die SGS-Präzipitate vor der Fragmentierung der Proben aufzulösen.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich bei der Untersuchung der Genregulation in T-Zellen. Wir wählten T-Zellen, da sie für medizinische Anwendungen von großer Bedeutung sind und eines der am besten beschriebenen Modellsysteme zur Erforschung der Genexpression in höheren Eukaryoten darstellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Chromatinbiologie den Weg, um die Chromatinregulation in Säugetiersystemen zu untersuchen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von T-Zell-assoziierten Erkrankungen, da sie die Aufklärung der Entstehung und Regulation der Genexpressionsprogramme in T-Zellen ermöglicht. Es sollte nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit Formaldehyd, Phenol-Chloroform und isoamylischem Alkohol äußerst gefährlich ist, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten unter einem Abzug sowie das Tragen der geeigneten Schutzausrüstung stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die Chromatinregulation von Maus-T-Zellen liefern kann, ist sie ebenfalls auf andere Systeme wie endotheliale Zelllinien und Lungenzelllinien anwendbar.