Name: Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation in Maus-T-Zell-Linien zur Untersuchung von Histonmarkierungen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Analysen der Chromatinstruktur bei T-Zell-Aktivierung.

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Wir danken P. Käse und T. Schmidt-Wöll für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die Kooperationsforschung TRR81 und das Heisenberg-Programm (BO 1639 / 5-1) der DFG, der Max-Planck-Gesellschaft und der EXC 294 in Freiburg sowie des Exzellenzclusters für Cardio-Pulmonalsystem unterstützt (ECCPS) in Gießen nach TB

HINWEIS: Alle Puffer und das in diesem Protokoll verwendete Medium sind in Tabelle 1 aufgelistet . Tage 1 und 2 1. Vernetzung der Zellen <ol><li> Übertragen Sie die Maus-T-Zellen aus einer 6-Well-Platte in ein 50 ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 4 ° C und ~ 271 x g. Das Zellpellet wird in 30 ml IMDM-Zellkulturmedium resuspendiert und die Zellen mit einer Neubauer-Kammer gezählt. </li><li> Sammle Aliquots von 20 x 10 6 Zellen in neue 50 ml Röhrchen. </li><li> Füge Formaldehyd (FMA) zu einer 1% Endkonzentration direkt zum Zellkulturmedium hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 10 min. Achtung: FMA ist giftig, wenn eingeatmet, so unter einer Dunstabzugshaube arbeiten und geeignete Schutzausrüstung tragen. Auch bitte behandeln FMA Abfälle nach den Regeln der Gasthochschule. </li><li> Füge 1/8-Volumen 1 M Glycin, pH 7,0 hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5Min bei 4 ° C und ~ 271 xg und waschen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Das Zellpellet mit 1 ml PBS waschen und auf 1,5 ml Röhrchen überführen. </li></ol> 2. Zell-Lyse und Chromatin-Scherung <ol><li> Das Zellpellet wird in 1 ml SDS-Lysepuffer resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. </li><li> Übertragen Sie jede Probe auf ein Ultraschallrohr und führen Sie die Scherung mit einem fokussierten Ultraschallgerät gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Einstellungen durch . </li><li> Nach dem Scheren die Proben auf 1,5 ml Röhrchen übergeben und 10 min bei 4 ° C und ~ 18.000 x g zentrifugieren. </li><li> Übertragen Sie den Überstand auf neue Röhren. </li><li> Sammeln Sie 50 μl, um die Scherwirkung nach Schritt 3 zu bestimmen und das gescherte Lysat in flüssigem Stickstoff einzufrieren. Das Lysat in Einwegaliquots bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol> 3. Bestimmung der Scherwirkung <ol><li> Füge 50 μl Elutionspuffer zu den 50 &amp; #181, L von jedem geschorenen Lysat und inkubieren bei 65 ° C über Nacht, mit Schütteln. </li><li> 100 μl TE-Puffer und 4 μl 10 mg / mL RNase A (0,2 μg / μL Endkonzentration) zugeben. Mischen und inkubieren für 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln. </li><li> 2 μl 20 mg / ml Proteinase K (0,2 μg / μL Endkonzentration) zu jeder Probe geben und 2 h bei 55 ° C unter Schütteln inkubieren. </li><li> Übertragen Sie jede Probe auf ein Gel-Rohr, das für die Bildung von Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol geeignet ist; Handhaben nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> 200 μl Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben und die Röhrchen schütteln. 5 min bei 24 ° C und ~ 16.000 xg zentrifugieren und die obere Phase in neue Röhrchen überführen. Achtung: Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol sind bei Einatmen giftig und korrosiv; Arbeit unter einer Dunstabzugshaube und trage eine persönliche Schutzausrüstung. Auch behandeln Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol Abfälle acNach den Regeln der gastgebenden Einrichtung. <ol><li> Wiederhole einmal. </li></ol></li><li> Reinigen Sie die DNA unter Verwendung von Reinigungsspalten gemäß der Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen: <ol><li> Die Membran zweimal waschen. Nach dem letzten Waschen lassen Sie das Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur stehen, um das restliche Ethanol zu verdampfen. </li><li> Für die Elution werden 50 &amp; mgr; l H 2 O zugegeben, bei Raumtemperatur für 1 min inkubiert, das Röhrchen für 1 s gedünstet, um die Membran richtig zu benetzen und bei Raumtemperatur für 1 min vor der Eluierung der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei inkubieren 24 ° C und ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Quantifizieren Sie die gereinigte DNA auf einem Fluorometer mit einem hochempfindlichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Analysieren Sie etwa 500 ng der gereinigten DNA auf einem 1,8% Agarosegel und etwa 1 ng auf einem Elektrophoresesystem unter Verwendung eines hochempfindlichen Kits. HINWEIS: Das erwartete SizE der DNA-Fragmente zwischen 200 und 500 bp liegt. </li></ol> Tage 3 und 4 4. Immunpräzipitation <ol><li> 1 Volumen geschliffenes Lysat mit 5 Volumina Verdünnungspuffer verdünnen </li><li> Mit 30 &amp; mgr; l / ml Protein A-Agarose-Kügelchen (hergestellt gemäß Anhang A ) für 30 min unter Rotation im kalten Raum vorschneiden. </li><li> Bei 4 ° C für 5 min bei 750 x g zentrifugieren </li><li> Sammle 10% des Eingangs und stelle sie bei 4 ° C auf. </li><li> Aliquot die gewünschte Menge an Lysat in neue Röhrchen (siehe Tabelle 3 für Details). Fügen Sie die gewünschten Antikörper zu jeder Röhre hinzu (siehe Tabelle 3 für Details) und drehen Sie sich über Nacht bei 4 ° C. </li><li> 40 &amp; mgr; l Protein A-Kügelchen zugeben und 1 h bei 4 ° C während des Rotierens inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml salzarmer Puffer, hochsalzigem Puffer, LiCl-Puffer und TE-Puffer (für jede Wäsche, inkubieren für 5 min bei 4 ° C während Rotieren und ZentrifugierenFür 3 min bei 4 ° C und ~ 950 xg). Siehe Tabelle 3 für Details. </li><li> Füge 110 μl Elutionspuffer hinzu und inkubiere für 15 min bei Raumtemperatur, Vortexen alle 2 min. </li><li> 3 min bei 4 ° C und ~ 950 xg zentrifugieren und 100 μl Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.7-4.8 mit 100 μl Elutionspuffer und kombinieren Sie die Eluate. Füge den Elutionspuffer bis zu 200 μl hinzu, um die Proben zu geben. </li><li> Inkubieren Sie alle Proben über Nacht bei 65 ° C unter Schütteln. </li></ol> Tag 5 5. DNA-Reinigung <ol><li> Zugabe von 200 μl TE-Puffer zu jedem Eluat und 8 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μL Endkonzentration). Mischen und inkubieren für 2 h bei 37 ° C, unter Schütteln. </li><li> 4 μl 20 mg / ml Proteinase K (0,2 μg / μL Endkonzentration) zu jedem Eluat geben und 2 h bei 55 ° C unter Schütteln inkubieren. </li><li> Übertragen Sie jede Probe in ein GelRohr geeignet für Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol Extraktion; Handhaben nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> 400 μl Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben und die Röhrchen schütteln. 5 min bei 24 ° C und ~ 16.000 x g zentrifugieren Übertragen Sie die obere Phase auf neue Röhren. Achtung: Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol sind bei Einatmen giftig und korrosiv; Arbeit unter einer Dunstabzugshaube und trage eine persönliche Schutzausrüstung. Auch Phenol-, Chloroform- und Isoamylalkoholabfälle nach den Regeln der gastgebenden Einrichtung behandeln. <ol><li> Wiederhole einmal. </li></ol></li><li> Reinigen Sie die DNA mit Reinigungsspalten gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen: </li><li> Die Membran zweimal waschen. Nach dem letzten Waschvorgang die Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur öffnen, um das restliche Ethanol zu verdampfen. </li><li> Für die Elution 50 μl H 2 O zugeben, bei Raumtemperatur inkubierenRe für 1 min, drehen die Röhrchen für 1 s, um die Membran richtig zu benetzen und bei Raumtemperatur für 1 min vor dem Eluieren der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 24 ° C und ~ 17.900 x g zu inkubieren. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

ChIP ist eine gültige Technik, um zu untersuchen, ob Proteine ​​oder ihre PTMs an bestimmten genomischen Regionen angereichert sind. ChIP-Assay-Ergebnisse sind oft schwierig, aus biologischen oder technischen Gründen zu interpretieren. Die biologischen Gründe sind vielfach und beinhalten eine schwache oder indirekte Bindung von Proteinen an DNA. Es gibt auch technische Einschränkungen, wie z. B. begrenzte Antikörperspezifität und ineffiziente Zelllyse oder Chromatinscherung. Ein Handbuch zur Fehlerbehebung ( Tabelle 5 ) kann dem Leser helfen, die Probleme zu lösen, die bei ChIP-Assays auftreten können. Dieses Protokoll, das eine kühlende fokussierte Ultraschallvorrichtung verwendet, ermöglicht es, das Chromatin einer reifen Maus-T-Zelllinie effizient zu scheren. Der wichtigste kritische Schritt des Protokolls wird durch die Scherung des Chromatins dargestellt, die immer für jeden Zelltyp optimiert werden muss. Es wird empfohlen, die Anzahl der Zellen und die Anzahl der Beschallungszyklen zu variieren. Außerdem ist sie das<html> Wird durch die Anwesenheit von SDS-Präzipitaten in den Proben, die sich bei der Lyse der Zellen auf Eis mit SDS-Lysepuffer bilden können, negativ beeinflusst. In diesem Fall ist es am besten, die Probe nach der Lyse bei Raumtemperatur für einige Minuten zu inkubieren, um das Vorhandensein von SDS-Präzipitaten zu reduzieren. Es wird empfohlen, das Protokoll zu optimieren, um gescherte Fragmente zwischen 200 und 500 bp zu erhalten und immer die Scherqualität der Proben zu bewerten, bevor sie mit der Immunpräzipitation fortfahren. Zusätzlich müssen die Fixierungszeit, die Menge an Antikörper und / oder Zellen und die Waschbedingungen für jeden Antikörper optimiert werden. Ein weiterer kritischer Schritt bei der erfolgreichen ChIP-Prozedur ist die Wahl des Antikörpers, da Antikörper mit niedriger Spezifität die Effizienz der Immunpräzipitation deutlich reduzieren. Bisher hat ein einheitliches Qualitätsprüfverfahren die Bewertung der Spezifität mehrerer auf dem Markt verfügbarer Antikörper ermöglicht<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19 Die Screening-Pipeline basierte auf Dot-Blot, Western Blot und ChIP und lieferte eine Liste von hochwertigen Reagenzien, die für ChIP 19 geeignet sind. In jüngerer Zeit wurde die Spezifität von mehreren handelsüblichen Antikörpern mit hochdichten Histonpeptid-Mikroarray-Plattformen ausgewertet, was die Einrichtung einer Datenbank über die Antikörperspezifität 20 ermöglicht. Der Leser kann dieses nützliche Werkzeug verwenden, um die spezifischsten Antikörper zu identifizieren, die für ChIP-Experimente verwendet werden können. Dieses Protokoll wurde nicht auf primäre T-Zellen getestet und in diesem Fall sollte sich der Leser auf andere veröffentlichte Protokolle beziehen, die ChIP auf den primären T-Zellen 3 , 4 , 21 erfolgreich durchführen. Bemerkenswert ist, dass dieses Protokoll erfolgreich verwendet wurde, um ChIP auf einer Maus-Progenitor-T-Zelllinie sowie auf einer Maus-Endothelzelllinie durchzuführen. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 Zellen sollten für jede Immunpräzipitation für die Analyse von Histonmarken verwendet werden. Da dieses Protokoll auch bei einigen Optimierungen geeignet ist, ChIP auf TFs oder Cofaktoren durchzuführen, ist es am besten, die Anzahl der Zellen zu erhöhen Die für die Immunpräzipitation in diesen Fällen verwendet werden. Um die erforderliche Anzahl von Zellen für jedes Experiment zu erreichen, können mehr Aliquots von geschertem Lysat zusammengemischt werden, bevor das Chromatin in dem Verdünnungspuffer verdünnt wird. Dieses Protokoll könnte auch modifiziert werden, um ChIP auf endogenen Proteinen durchzuführen, die nicht direkt an die DNA binden. In diesem Fall kann eine Vorfixierung mit Protein-Protein-Vernetzern ( z. B. Dimethyladipimidat, DMA) erforderlich sein (siehe Anhang B für weitere Informationen). Die erfolgreiche Leistung von ChIP auf Kofaktoren wurde zuvor durch Überexpression von Proteinen, die mit einem Biotin-Tag fusioniert wurden, durchgeführt. In diesem Fall wurde das Protein mit Streptavidin-Konjuga gereinigtMagnetische Perlen und eine Vorfixierung mit DMA wurde durchgeführt 22 .

Entwicklung, Differenzierung und Homöostase hängen von spezifischen Genexpressionsprogrammen ab, die durch Signalisierungsereignisse bestimmt werden, die die Chromatinstruktur modulieren und somit bestimmen, ob ein spezifisches Gen zell- und zeitabhängig aktiviert oder unterdrückt wird. Während der T-Zell-Entwicklung müssen spezifische Genexpressionsprogramme etabliert werden, um die Reifung von T-Zell-Vorläufern vom doppelnegativen (DN) zum ein-positiven (SP) -Zustand zu bestimmen, indem sie mehrere Zwischenstufen 1 durchlaufen. Wie das Genexpressionsprogramm während der T-Zell-Entwicklung dynamisch reguliert wird, wurde in den vergangenen Jahren von mehreren Laboratorien 2 , 3 , 4 , 5 , 6 weitgehend untersucht. Durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen, der Austausch vonKanonische Histone mit Histonvarianten, Nukleosomen-Räumung und DNA-Methylierung regulieren den ON / OFF-Schalter von Genen. Mehrere Gruppen haben die genomweite Verteilung von PTMs und Histonvarianten untersucht, um Markierungen zu bestimmen, die mit verschiedenen Chromatinzuständen an den proximalen und distalen regulatorischen Regionen 7 , 8 , 9 , 10 assoziiert sind. Signalisierungskaskaden orchestrieren die dynamische Chromatinregelung über den Austausch von positiven und negativen chromatinmodifizierenden Enzymen (auch als Chromatinmodifikatoren bekannt) an spezifischen Enhancer-Elementen. Diese Chromatin-Modifizierungsmittel regulieren die Chromatinstruktur und damit die Transkriptionsausgabe beispielsweise durch dynamische Histon-Methylierung und Acetylierung. Dies ist der Fall in dem Notch-Signalweg 11 , 12 , 13 ,14 Dynamische Histon-PTMs; Austausch mit Histonvarianten; Und die dynamische Belegung von Histonen, Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren können durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) -Assays untersucht werden. Hochspezifische Antikörper werden verwendet, um spezifische DNA-Protein-Komplexe zu reinigen, und die gereinigte DNA wird durch quantitative PCR (qPCR) analysiert; Tiefsequenzierung (ChIP-Seq); Oder, seltener heutzutage, Hybridisierung mit Mikroarray (ChIP-ChIP). ChIP-Assays sind manchmal anspruchsvoll aufgrund von Komplikationen mit der Lyse der Zellen, Scherung des Chromatins und / oder geringer Spezifität der Antikörper. Es wurden mehrere Strategien zur Verbesserung des Protokolls verabschiedet, wie es bei NEXSON 15 der Fall ist. Die Verwendung von Kühlwasser-Bad-Sonicatoren vermeidet Probenerwärmung, die die auf dem zu untersuchenden Protein vorhandenen Epitope beschädigen könnte, aber die Energie, die für das Scheren der Proben erforderlich ist, wird in das Wasser dispergiert.Eine weitere Verbesserung wurde mit der Entwicklung von fokussierten Ultraschallgeräten gemacht, die die Verteilung der Energie verhindern. Daher ermöglichen fokussierte Ultraschallgeräte Verbesserungen bei der Zelllyse und Chromatinscherung, eliminieren durch Operator-induzierte Variationen und erhöhen die Reproduzierbarkeit erheblich. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll (schematische Übersicht in Abbildung 1 ), um das ChIP von Histonproteinen in einer reifen Maus-T-Zelllinie mit der Bezeichnung E2-10HA 16 , 17 effizient durchzuführen. T-Zellen sind in der Regel schwer zu lysieren, und die Scherung ihrer Chromatin wurde offenbart, um ineffizient zu sein. In diesem Protokoll, das einen kühlenfokussierten Ultraschallgerät nutzt, wurden die Anzahl der Zellen, der Lysepuffer und die Schereinstellung für die E2-10HA-Maus-T-Zelllinie optimiert. Dieses Protokoll erlaubt es, ChIP mit hoher Reproduzierbarkeit und in einer angemessenen Zeit durchzuführen. In der Tat, es requirEs etwa zwei Tage, um das Chromatin zu scheren und die Qualität der Scherung zu bewerten, und drei Tage, um die Immunpräzipitation durchzuführen, die Vernetzung umzukehren und die DNA zu reinigen.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagenzien</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyladipimidat (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulinlösung human&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essentielles Medium nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Primaton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&nbsp; ml</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K-Lösung (20 mg/ml),</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Analyseröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase und Proteasefrei (10&nbsp; mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen AFA Faser & Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin-immunpräzipitation (chip) in maus-t-zell-linien

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signalisierungswege regulieren Genexpressionsprogramme über die Modulation der Chromatinstruktur auf verschiedenen Ebenen, wie durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonschwänzen, den Austausch von kanonischen Histonen mit Histonvarianten und Nukleosomenvorsätze. Eine solche Regulation erfordert die Bindung von signalempfindlichen Transkriptionsfaktoren (TFs), die chromatinmodifizierende Enzyme an regulatorischen Elementen, die als Enhancer definiert sind, rekrutieren. Das Verständnis, wie Signalkaskaden die Enhancer-Aktivität regulieren, erfordert eine umfassende Analyse der Bindung von TFs, chromatinmodifizierenden Enzymen und der Belegung von spezifischen Histonmarken und Histonvarianten. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) -Assays verwenden hochspezifische Antikörper gegen Immunpräzipitation spezifischer Protein / DNA-Komplexe. Die anschließende Analyse der gereinigten DNA ermöglicht die Identifizierung der Region, die von dem vom Antikörper erkannten Protein besetzt ist. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für effizientes peRip ChIP von Histonproteinen in einer reifen Maus-T-Zelllinie. Das dargestellte Protokoll erlaubt die Durchführung von ChIP-Assays in einem angemessenen Zeitrahmen und mit hoher Reproduzierbarkeit.

Reife murine T-Zellen wurden einer ChIP-Analyse unterzogen, um die Anreicherung der Histonmark-Monomethylierung von Lysin 4 auf Histon 3 (H3K4me1), Tri-Methylierung von Lysin 4 auf Histon 3 (H3K4me3) und Acetylierung von Lysin 27 zu untersuchen Histon 3 (H3K27ac), sowie die Nukleosomenbelegung, wie aus panH3 ChIP hervorgeht. Die Scherqualität wurde durch Analyse auf einem 1,8% Agarosegel ( Fig. 2A ) und auf einem Elektrophorese-System ( Fig. 2B ) bewertet. H3K4me1 und H3K4me3 werden im Allgemeinen verwendet, um Enhancer-Stellen und Promotoren zu identifizieren (Abbildung 3A ). Tatsächlich ist H3K4me3 prominent, aber nicht ausschließlich an den Promotoren 5 , 8 , 14 angereichert. Eine Eigenschaft von aktiven Enhancern ist für H3K4me1 und H3K27ac hoch angereichert und für H3K4me3 (&lt;Starke Klasse = &quot;xfig&quot;&gt; Abbildung 3A, oberes Panel), während inaktive Enhancer niedrige Niveaus von H3K4me3 und H3K27ac aber hohen Niveaus von H3K4me1 (Abbildung 3A , unteres Panel) darstellen. Wie in Fig. 3B gezeigt , ist das Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase ( Gapdh ) -Gen repräsentativ für die Analyse von aktiven Gen-Promotoren ( Gapdh-Promotor ). In der Tat zeigt es hohe Niveaus von H3K4me3 und H3K27ac und niedrigem Niveau von H3K4me1. In Abbildung 3B ist Deltex1 ( Dtx1 ) repräsentativ für inaktive Enhancer ( Dtx1 Enhancer ), da es für H3K4me1 hoch angereichert und für H3K4me3 und H3K27ac schlecht angereichert ist. Die Gen-Wüste ist repräsentativ für eine Region, die keine kodierenden Gene enthält und wird gewöhnlich als Negativkontrolle für aktive Chromatin-Markierungen verklagt. Die Beobachtung, dass H3K4me1, eine gut akzeptierte Enhancer Mark 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , ist nicht bereichert an Gene Wüste deutet darauf hin, dass diese Region fehlt Enhancer. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Übersicht über das vorgestellte ChIP-Protokoll. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Abbildung 2: Scherqualitätskontrolle der reifen Maus-T-Zelllinie. ( A ) Zwei verschiedene Aliquots der reifen Maus-T-Zelllinie E2-10HA wurden geschert und etwa 500 ng gereinigte DNA wurden auf einem 1,8% Agarosegel analysiert, um ihre Scherung zu bewertenQualität. ( B ) 1 ng gereinigter DNA aus Probe 2 wurde durch Elektrophorese analysiert, um ihre Scherqualität zu bewerten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Abbildung 3: Chromatin-Marken, die Enhancer und Promotoren charakterisieren. ( A ) Aktive Verstärker (obere Tafel) zeichnen sich durch hohe H3K4me1, niedrige H3K4me3 und hohe H3K27ac aus, während inaktive Enhancer (untere Tafel) hohe H3K4me1, niedrige H3K4me3 und niedrige H3K27ac vorhanden sind. ( B ) Die in Fig. 2A dargestellten Proben wurden zusammengefaßt und für die ChIP-Analyse gegenüber den Histonmarken H3K4me1, H3K4me3 und H3K27ac und Histonbelegung verwendet, wie durch panH3-ChIP aufgedeckt wurde. Diese Analyse zeigt, dass thE-Promotor des Haushaltgens Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase ( Gapdh-Promotor ) ist für H3K4me3 und H3K27ac hoch angereichert und für H3K4me1 niedrig angereichert. Auf der anderen Seite ist der Enhancer des inaktiven Gens Deltex1 ( Dtx1 Enhancer ) für H3K4me1 hoch angereichert, aber schlecht angereichert für H3K4me3 und H3K27ac. ChIP unter Verwendung eines panH3-Antikörpers wurde verwendet, um die Nukleosomenbelegung zu untersuchen. Gene Wüste wurde als Negativkontrolle verwendet. Ein repräsentatives Experiment wird gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Name des Puffers </td><td> Reagens </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td rowspan="5"> Verdünnungspuffer </td><td> NatriumdodecYl-sulfat (SDS) </td><td> 0,01% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA-Lösung </td><td> Dimethyladipimidat (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Elutionspuffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Hochsalzpuffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EthylendiamiNetetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM-Medium </td><td> Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Fetales Rinderserum (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Pepton-Primaton </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Insulinlösung Mensch </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Minimale essentielle wesentliche nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl-Salzpuffer </td><td> Lithiumchlorid (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Niedriger Salzpuffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Protein A Sepharose Perlen Waschpuffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS-Lyse-Puffer </td><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EthylendiAmintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE-Puffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der Puffer und des in diesem Protokoll verwendeten Mediums. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> AUF </td><td> AUS </td></tr><tr><td> Spitzenleistung </td><td> 150,0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Duty Faktor </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Zyklen / Burst </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Anzahl der Zyklen </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabelle 2: Schereinstellungen, die in diesem Protokoll verwendet werden. Diese Bedingungen wurden für eine reife Maus-T-Zelllinie optimiert. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Lieferant </td><td> Menge an Antikörper / Immunpräzipitation </td><td> Menge der Zellen / Immunpräzipitation </td><td> Waschbedingungen </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Einmal in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce in niedrigem Salzpuffer, zweimal in hohem Salzpuffer, zweimal in LiCl-Salzpuffer und dreimal in TE-Puffer </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td><td> Variable* </td></tr><tr><td colspan="5"> * Im Fall der IgG-Kontrolle müssen die Menge an Antikörper und Zellen sowie die Waschschritte die Bedingungen der anderen Immunpräzipitationen spiegeln. </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: In dieser Studie verwendete Antikörper und Waschbedingungen <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;immer&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gen </td><td> Vorwärtsprimer </td><td> Rückwärtsprimer </td><td> Sonde </td></tr><tr><td> Gapdh-Promoter (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 Enhancer (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Gene Wüste </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Primer und Sonden für qPCR in dieser Studie verwendet. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;immer&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problem </td><td> Ursachen </td><td> Lösung </td></tr><tr><td rowspan="3"> Chromatin ist unter Schere und Fragmente sind zu groß. </td><td> Zu viele Zellen wurden verwendet. </td><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Zellen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Die Scherung ist zu niedrig. </td><td> Erhöhung der Anzahl der Scherzyklen. </td></tr><tr><td> Erhöhen Sie die Scherspitzenleistung, das Tastverhältnis und / oder die Zyklen / Burst. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Chromatin ist über geschert und Fragmente sind zu klein. </td><td> Es wurden nur wenige Zellen verwendet. </td><td> Erhöhe die Anzahl der Zellen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Das Scheren ist zu hoch. </td><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Scherzyklen. </td></tr><tr><td> Reduzieren Sie die Scherspitzenleistung, das Tastverhältnis und / oder die Zyklen / Burst. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Zu wenig Erholung über IGG-Steuerung und / oder Negativkontrolle (hoher Hintergrund). </td><td> Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. </td><td> Erhöhung der Chromatinmenge </td></tr><tr><td> Die Menge des Antikörpers ist zu niedrig. </td><td> Erhöhe die Menge an Antikörper. </td></tr><tr><td> Die Menge des Antikörpers ist zu hoch. </td><td> Reduzieren Sie die Menge an Antikörper. </td></tr><tr><td> Der Antikörper hat eine geringe Spezifität. </td><td> Ändern Sie den Antikörper. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Waschbedingungen sind zu streng. </td><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Wäsche. </td></tr><tr><td> Reduzieren Sie die Stringenz der Waschpuffer. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Waschbedingungen sind nicht streng genug. </td><td> Erhöhen Sie die Anzahl der Wäsche. </td></tr><tr><td> Erhöhe die Stringenz der Waschpuffer. </td></tr><tr><td> Zu viel DNA wurde im qPCR pipettiert. </td><td> Reduzieren Sie die Menge an DNA, die im qPCR pipettiert wurde. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR-Bedingungen sind nicht optimal. </td><td> Optimiere die qPCR-Bedingungen. </td></tr><tr><td> Reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Bei der qPCR-Reaktion der Eingangsmuster ist kein Produkt oder Produkt zu niedrig. </td><td> Nicht genügend DNA wurde im qPCR pipettiert. </td><td> Erhöhe die DNA-Menge, die im qPCR pipettiert wurde. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR-Bedingungen sind nicht optimal. </td><td> Optimiere die qPCR-Bedingungen. </td></tr><tr><td> Erhöhung der Anzahl der Zyklen. </td></tr><tr><td> Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. </td><td> Erhöhung der Chromatinmenge </td></tr><tr><td rowspan="4"> Kein Signal in der Positivkontrolle und / oder PanH3 ChIP. </td><td> Nicht genug Chromatin für das Experiment verwendet. </td><td> Erhöhung der Chromatinmenge </td></tr><tr><td> Die Menge des Antikörpers ist zu niedrig. </td><td> Erhöhe die Menge an Antikörper. </td></tr><tr><td> Die AntiKörper hat eine geringe Spezifität. </td><td> Ändern Sie den Antikörper. </td></tr><tr><td> Elution ist suboptimal. </td><td> Achten Sie darauf, die Proben häufig zu verwirbeln, um die Perlen in Lösung zu halten. </td></tr></tbody></table> Tabelle 5: Fehlersuche.

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) unter Verwendung einer reifen Maus-T-Zelllinie. Dieses Protokoll ist geeignet, um die Verteilung von spezifischen Histonmarken an bestimmten Promotorstellen oder genomweiten zu untersuchen.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Chromatin-Immunpräzipitation in Maus-T-Zelllinien effizient und mit hoher Reproduzierbarkeit innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens durchzuführen, um die Verteilung von Histonmarkierungen in spezifischen genomischen Regionen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Chromatinbiologie zu beantworten, insbesondere im Zusammenhang mit T-Zellen, beispielsweise wie die Chromatinstruktur während der Teilung oder Aktivierung von T-Zellen reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Chromatinspaltung effizient und äußerst reproduzierbar ist.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Bedingungen für das Chromatinscheren schwierig zu etablieren sind, weil die Schritte mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol herausfordernd sein können. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert Francesca Ferrante, eine Doktorandin in unserem Labor. Am ersten Tag überführen Sie die Maus-T-Zellen von einer 6-Loch-Platte in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Anschließend die Zellen fünf Minuten bei 24 Grad Celsius und etwa 271 × g zentrifugieren. Nach dem erneuten Aufschwemmen des Zellenpellets in 30 Milliliter IMDM-Zellkulturmedium die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zählen. Aliquote von jeweils 20 Millionen Zellen in neue 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Danach Formaldehyd direkt zum Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen, und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Fügen Sie anschließend ein Achtel des Volumens einer einmolarigen Glycinlösung mit pH 7,5 hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten bei 24 Grad Celsius und etwa 271 × g. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Zellpellet in 10 Milliliter gepuffertem Phosphatsalzlösung (PBS) resuspendieren und die Zentrifugation wiederholen. Waschen Sie die Zellen erneut mit einem Milliliter PBS.Überführen Sie die resuspendierten Zellen vor der Zentrifugation in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Das Scheren der Chromatin ist der kritischste Schritt, da es von der Zellmenge, den Scher-Röhrchen, dem Gerät, dem Lysepuffer sowie den Scherparametern abhängt. Nach der Wäsche resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter SGS-Lysepuffer und inkubieren es auf Eis.Nach 10 Minuten jede Probe in ein Sonikationsröhrchen überführen. Anschließend die Fragmentierung mit einem fokussierten Ultraschallgerät gemäß den im Textprotokoll angegebenen Einstellungen durchführen. Nach der Fragmentierung die Proben in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei vier Grad Celsius und etwa 18.000 × g. Danach überführen Sie das Überstand in neue Röhrchen. Sammeln Sie 50 Mikroliter zur Bestimmung der Scherwirkungsgrad und schockfrieren Sie das geschnittene Lysat in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie das Lysat in Einweg-Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius.Um die Scherwirkung zu bestimmen, geben Sie zunächst 50 Mikroliter Elutionspuffer zu 50 Mikrolitern jedes geschernten Lysats hinzu. Inkubieren Sie die Ansätze über Nacht bei 65 Grad Celsius unter Schütteln. Am zweiten Tag geben Sie 100 Mikroliter TE-Puffer und vier Mikroliter Rnase A (10 Milligramm pro Milliliter) zu den Proben hinzu.Mischen Sie die Proben und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Geben Sie dann zwei Mikroliter einer 20 Milligramm pro Milliliter-Proteinase-K-Lösung zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie erneut zwei Stunden bei 55 Grad Celsius unter Schütteln. Überführen Sie anschließend jede Probe in ein Gelröhrchen, das für die Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion geeignet ist.Behandeln Sie die Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie 200 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und schütteln Sie die Röhrchen. Überführen Sie nach der Zentrifugation die obere Phase in neue Röhrchen.Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Reinigen Sie die DNA mithilfe von Reinigungssäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers, wobei die Membran zweimal gewaschen wird. Lassen Sie nach dem letzten Waschschritt das Röhrchen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur geöffnet, um das restliche Ethanol zu verdampfen.Für die Elution 50 Mikroliter Wasser auf die Säule geben und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend das Röhrchen eine Sekunde lang zentrifugieren, um die Membran vollständig zu benetzen. Die Membran eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren, bevor die DNA durch Zentrifugation eluiert wird.Quantifizieren Sie die gereinigte DNA mit einem Fluorometer unter Verwendung eines Hochsensitivitätskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Analysieren Sie abschließend etwa 500 Nanogramm der gereinigten DNA in einem 1,8 %igen Agarosegel und etwa ein Nanogramm der gereinigten DNA in einem Elektrophorese-System unter Verwendung eines Hochsensitivitätskits.Am dritten Tag verdünnen Sie ein Volumen des gesonifizierten Lysats mit fünf Volumina Verdünnungspuffer. Präklären Sie das verdünnte Lysat mit 30 Mikrolitern pro Milliliter Protein A-Agarose-Kügelchen für 30 Minuten unter Rühren im Kühlschrank. Zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius für fünf Minuten bei etwa 750 × g. Sammeln Sie 10 % des geklärten Lysats als Input-Proben und lagern Sie diese bei vier Grad Celsius.Als Nächstes aliquotieren Sie die gewünschte Menge des geklärten Lysats in neue Röhrchen. Fügen Sie dann die ausgewählten Antikörper zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rühren. Am vierten Tag geben Sie 40 Mikroliter Protein-A-Kügelchen hinzu.Die Mischung eine Stunde bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Die Kügelchen mit einem Milliliter Puffer mit niedriger Salzkonzentration waschen, indem sie fünf Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubiert werden. Anschließend drei Minuten bei vier Grad Celsius und etwa 950 × g zentrifugieren. Den Waschschritt mit Puffer mit hoher Salzkonzentration, Lithiumchlorid-Puffer und TE-Puffer wiederholen.Dann 110 Mikroliter Elutionspuffer zu den Proben hinzufügen. Die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, wobei alle zwei Minuten verwirbelt wird. Nach erneutem Zentrifugieren 100 Mikroliter Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.Wiederholen Sie die Elution mit 100 Mikrolitern Elutionspuffer und vereinigen Sie die Eluate. In der Zwischenzeit fügen Sie Elutionspuffer zu den zuvor gesammelten Input-Proben hinzu, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Inkubieren Sie alle Proben über Nacht bei 65 Grad Celsius unter Schütteln.Am fünften Tag 200 Mikroliter TE-Puffer zu jedem Eluat und acht Mikroliter Rnase A mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter hinzufügen. Die Proben vor der Inkubation zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mischen. Anschließend vier Mikroliter Proteinase K mit einer Konzentration von 20 Milligramm pro Milliliter zu jedem Eluat hinzufügen, bevor die Probe zwei Stunden bei 55 Grad Celsius unter Schütteln inkubiert wird. Danach jede Probe in ein Gelröhrchen überführen, das für die Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion geeignet ist.Fügen Sie 400 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzu und schütteln Sie die Röhrchen. Nach der Zentrifugation übertragen Sie die obere Phase in neue Röhrchen und wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Reinigen Sie abschließend die DNA wie zuvor mit Reinigungssäulen.Dieses repräsentative Ergebnis der Beschallung von Maus-T-Zelllinien zeigt eine effiziente Fragmentierung des Chromatins. Dargestellt ist ein repräsentativer Chromatin-Immunpräzipitationsversuch in Maus-T-Zelllinien. Der Promotor des Housekeeping-Gens Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase weist eine starke Anreicherung der Trimethylierung des Lysins vier am Histon drei auf.Sowie die Acetylierung von Lysin 27 am Histon drei, jedoch nicht für die Monomethylierung von Lysin 4 am Histon drei. Umgekehrt ist der Enhancer des inaktiven Gens deltex-1 stark angereichert für die Monomethylierung von Lysin 4 am Histon drei.Aber schlecht angereichert für die Trimethylierung von Lysin vier am Histon drei und die Acetylierung von Lysin 27 am Histon drei. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die SGS-Präzipitate vor der Fragmentierung der Proben aufzulösen.Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich bei der Untersuchung der Genregulation in T-Zellen. Wir wählten T-Zellen, da sie für medizinische Anwendungen von großer Bedeutung sind und eines der am besten beschriebenen Modellsysteme zur Erforschung der Genexpression in höheren Eukaryoten darstellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Chromatinbiologie den Weg, um die Chromatinregulation in Säugetiersystemen zu untersuchen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von T-Zell-assoziierten Erkrankungen, da sie die Aufklärung der Entstehung und Regulation der Genexpressionsprogramme in T-Zellen ermöglicht. Es sollte nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit Formaldehyd, Phenol-Chloroform und isoamylischem Alkohol äußerst gefährlich ist, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten unter einem Abzug sowie das Tragen der geeigneten Schutzausrüstung stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die Chromatinregulation von Maus-T-Zellen liefern kann, ist sie ebenfalls auf andere Systeme wie endotheliale Zelllinien und Lungenzelllinien anwendbar.

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Die IP-FCM-Methode vorgestellt, die eine sensible, robust, biochemische Beurteilung der nativen Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Stichproben.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Eine neuartige Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur zur Erforschung der Genregulation in Muskelfasern von Chromatin Immunopräzipitation angepasst präsentiert.

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Genregulation. Das Verfahren birgt jedoch Schwierigkeiten bei der Erlangung reproduzierbarer Chromatinfragmentierung durch mechanisches Scheren. Hier bieten wir ein verbessertes Protokoll für einen ChIP-Assay mit enzymatischer Verdauung.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation in Maus-T-Zell-Linien zur Untersuchung von Histonmarkierungen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Analysen der Chromatinstruktur bei T-Zell-Aktivierung.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

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