Untersuchung von Willebrand Faktor Pathophysiologie mit einem Flow-Kammer-Modell des von Willebrand-Faktor-Thrombozyten String Bildung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den von-Willebrand-Faktor oder die VWF-Thrombozytenstringbildung als Reaktion auf Sekretagogen zu beobachten und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Biologie des Von-Willebrand-Faktors und der Pathophysiologie des wavo-palliativen Körpers zu beantworten. Es hilft uns auch, Fragen zu Mutationen zu beantworten, die die Freisetzung des von-Willebrand-Faktors und die Thrombozytenbindungsfunktion beeinträchtigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die in-vivo-Wechselwirkungen zwischen subendothelialem Kollagen, endoetholialen Zellen VWF und Blutplättchen in einem visuellen und quantifizierbaren in-vitro-System rekapituliert. Ich halte die visuelle Demonstration dieser Methode für unerlässlich. Die erforderlichen Mikroskopieschritte zur Erfassung der VWF-Thrombozytenstringbildung unter mehreren gleichzeitigen Bedingungen in Echtzeit können mit Text allein schwer zu bewältigen sein.

Beginnen Sie damit, 0,5 Milliliter Kollagen-Beschichtungspuffer in eine 1-Milliliter-Luer-Lock-Spritze zu füllen. Drehen Sie das Ende der Spritze auf das Reservoir eines Durchflusskammerschiebers und drücken Sie den Kolben langsam zusammen, bis die gesamte Bahn beschichtet ist und jedes Reservoir voll ist. Füllen Sie die Behälter auf, um sicherzustellen, dass jeder gefüllt ist.

Wenn alle Bahnen beladen sind, inkubieren Sie die Kammer 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie am nächsten Tag eine 200-Mikroliter-Pipette, um den Kollagenbeschichtungspuffer zu entfernen. Spülen Sie dann jede Bahn mit HBSS und saugen Sie die Kochsalzlösung mit einer 200-Mikroliter-Pipette an.

Nachdem die dritte Runde HBSS verworfen wurde, fügen Sie etwa dreimal 10 zu den 6. Blutauswuchs-Endothelzellen pro Milliliter in 100 Mikroliter Wachstumsmedium hinzu, ergänzt mit 10 % FBS auf jeder Spur der Durchflusskammer. Stellen Sie die Kammer dann für 24 Stunden wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und wechseln Sie das Medium alle acht bis 12 Stunden. Um das Durchflussgerät zusammenzubauen, befestigen Sie zunächst einen männlichen Ellbogen-Luer-Anschluss an einem Ende von jeweils drei 70 Zentimeter großen sterilen Silikonschläuchen.

Und befestigen Sie einen weiblichen Luer-Lock-Adapter am anderen Ende jedes Schlauchs. Verbinden Sie die weiblichen Luer-Lock-Adapter mit einzelnen 20-Milliliter-Spritzen und programmieren Sie die Spritzenpumpe. Laden Sie die Spritzen auf die Pumpe und befestigen Sie die Halterungen fest um die Spritzen und Kolben.

Befestigen Sie dann einzelne männliche Ellenbogen-Luer an beiden Enden von drei verschiedenen 20-Zentimeter-Stücken sterilem Silikonschlauch und verbinden Sie eine abgestumpfte 18-Gauge-Nadel mit einem der drei Ellbogen-Luer. Wählen Sie anschließend an einem Spinning-Disk-Mikroskop, das mit einem vollautomatischen Tisch ausgestattet ist, das 20-fach-Objektiv aus und stellen Sie die entsprechenden Kanaleinstellungen ein. Um den vollen dynamischen Datenbereich zu erhalten, stellen Sie das Elektronenmultiplikationsladungsgekoppelte Gerät auf eine Elektronenmultiplikationsverstärkung von 150 bei einer Belichtungszeit von 200 Millisekunden ein.

Stellen Sie die Laserleistung von 491 Nanometern auf 20 % ein und markieren Sie mit der Mikroskopsoftware die Mitte aller drei Spuren. Stellen Sie den Z-Bereich auf 1,0 Mikrometer und die Schrittweite auf 0,5 Mikrometer ein. Wählen Sie abschließend die Dauer und das Intervall aus, um alle 10 Sekunden zu 60 Zeitpunkten pro Folie ein Bild aufzunehmen.

Um die Bildung von VWF-Thrombozytensträngen zu induzieren, wird das Kulturmedium von drei Bahnen der Durchflusskammer durch serumfreies Medium allein als Kontrolle ersetzt, dann das interessierende Stimulans in 100 Mikrolitern serumfreiem Medium auf die zusätzlichen Bahnen verdünnt. Inkubieren Sie die Kammer dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie am Ende der Stimulationsphase alle drei Spuren mit 100 bis 200 Mikrolitern PBS und verwenden Sie Gefäßclips, um die Durchflusskammer auf einem Objektträgerständer abzubilden.

Befestigen Sie einen Luer-Stecker am Ende eines 70 Zentimeter langen Schlauchs an jedem Reservoir der Durchflusskammer. Und starten Sie die Spritzenpumpe, um die PBS-Wäsche zu entfernen. Pipettieren Sie zusätzliches PBS in den gegenüberliegenden Durchflusskammerbehälter, um sicherzustellen, dass die Bahnen nicht trocken laufen.

Sobald der äquivalente Durchfluss bestätigt ist, unterbrechen Sie die Spritzenpumpe. Befestigen Sie eine 5-Millileter-Spritze mit einer weiblichen Luer-Lock-Kupplung an den ersten freien männlichen Luer-Anschluss. Tauchen Sie die abgestumpfte Nadel in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit fluoreszenzmarkierter, gewaschener Thrombozytenlösung.

Ziehen Sie die Thrombozytenlösung langsam durch den Schlauch, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im System befinden. Befestigen Sie den männlichen Luer an dem offenen Reservoir der Durchflusskammer und beladen Sie die anderen beiden Bahnen mit Thrombozytenlösung, wie gerade gezeigt. Überprüfen Sie die Einrichtung des Durchflusssystems, um sicherzustellen, dass alle Verbindungen sicher sind.

Starten Sie die Spritzenpumpe neu und stellen Sie den Thrombozytenfluss 10 Minuten lang im Dunkeln dar. Trennen Sie dann den Luer von den Ansaugschläuchen am Durchflusskammerbehälter. Und füllen Sie das Reservoir mit PBS, um einen sanften Salzfluss über die Monoschicht der Endothelzellen aufrechtzuerhalten.

Um die VWF-Thrombozytenstringbildung zu quantifizieren, nehmen Sie 10 Bilder pro Objektträger von jeder Spur ohne Überlappung ab der Mitte des Objektträgers auf. Wenn alle Bilder abgerufen wurden, öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware und klicken Sie auf Bild, Helligkeitskontrast anpassen. Um die Helligkeit des ersten Bildes anzupassen, ziehen Sie die Bildlaufleiste, bis die anhaftenden Blutplättchen für die Quantifizierung gut genug angezeigt werden können.

Nehmen Sie dann einen VWF-Thrombozytenstrang auf, wenn drei oder mehr ausgerichtete Thrombozyten beobachtet werden, und zählen Sie alle Strings im Bild. Nach der Einleitung der Flussbedingungen weisen die unbehandelten Zellen im Vergleich zu Histamin- oder PMA-behandelten Zellen nur sehr wenige VWF-Thrombozytenstränge auf. Diese weisen durchschnittlich zwei bis drei Strings pro Sichtfeld auf.

Darüber hinaus induzieren Histone, die sowohl Blutplättchen als auch Endothelzellen aktivieren, die Produktion von mehr VWF-Thrombozytensträngen als unbehandelte, Histamin- oder PMA-stimulierte Kontrollen. Während Sie dieses Verfahren versuchen, lassen Sie die Blutplättchen bis zum Durchflussexperiment ruhen, indem Sie das erste Blutentnahmeröhrchen verwerfen, alle Reagenzien bei Raumtemperatur aufbewahren und eine schonende Pipettiertechnik anwenden. Modifikationen an diesem Verfahren können vorgenommen werden, um die Bildung von VWF-Thrombozytenstrings in Gegenwart von Leukozyten, Thrombozytenaktivierungsmitteln oder die Stringauflösung durch das spaltende Enzymatom TS13 zu bewerten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die sekretogogeninduzierte VWF-Thrombozytenstringbildung und das In-vitro-Flowkammermodell bewertet.