Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Integrationsstellen von aus murinem Leukämievirus stammenden retroviralen Vektoren abzubilden, um zellspezifische regulatorische Regionen zu definieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Gentherapie und bei Studien zur Genregulation zu beantworten, beispielsweise wo der Vektor im menschlichen Genom integriert und welches regulatorische Element über einen bestimmten Subtyp aktiv genutzt werden kann. Unsere erste Idee zu dieser Methode entstand, als wir beobachteten, dass MLV-Vektoren in Gentherapiestudien in aktive, substypspezifische Promotoren und Enhancer integrieren.

Beginnen Sie damit, die Zielzellen mit einem aus MLV stammenden retroviralen Vektor zu transduzieren, der das EGFP-Reportergen enthält und mit VSV-G oder dem amphotropen Hüllglykoprotein pseudotypisiert ist. Als negativen Kontrollansatz werden nicht transduzierte Zellen verwendet. 48 Stunden nach der Transduktion zentrifugieren Sie die Proben und resuspendieren anschließend 100.000 Zellen in 300 µL PBS, der zwei Prozent fötales Kälberserum enthält.

Anschließend Messung der EGFP-Expression durch Durchflusszytometrie. Gewinnen Sie weitere 0,5 bis fünf Millionen transduzierte Zellen zur Herstellung von genomischer DNA und anschließender Restriktionsenzymverdauung. Richten Sie vier Restriktionsenzymverdauungen pro Probe in 1,5-Milliliter-Röhrchen ein.

Verdauen Sie 0,1 bis ein Mikrogramm G-DNA in jedem Röhrchen, indem Sie je Probe 10 Einheiten TRU91 und ein Mikroliter Puffer M in einem Endvolumen von 10 Mikrolitern hinzufügen. Geben Sie zwei Mikroliter der Mischung in die Verdauungsgefäße.

Anschießend die Reaktionen sechs Stunden oder über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation 40 µL Wasser in ein 1,5-mL-Röhrchen geben. In dasselbe Röhrchen je Probe 10 Einheiten PST1 und einen µL Puffer H hinzufügen.

Geben Sie 10 Mikroliter der Verdauungsreaktionsmischung in die Verdauungsgefäße. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden oder über Nacht. Richten Sie am nächsten Tag acht Anschlussligationsreaktionen in 1,5-Milliliter-Gefäßen ein.

Fügen Sie für jede Reaktion das Ligase-Reaktionsgemisch zu 10 Mikrolitern des verdauten genomischen DNS hinzu. Inkubieren Sie bei 16 Grad Celsius für drei bis sechs Stunden. Für die PCR der ersten Runde bereiten Sie 48 PCR-Reaktionen in 0,2-Milliliter-Röhrchen vor.

Fügen Sie für jede PCR das Reaktionsgemisch, das den Linker-Primer und den MLV3-prime-LTR-Primer enthält, zu zwei Mikrolitern der Ligationsreaktion hinzu. Geben Sie die Proben in einen Thermocycler mit Heizdeckel. Stellen Sie die Zyklenparameter ein und führen Sie die PCR der ersten Runde durch.

Stellen Sie für die PCR der zweiten Runde das Reaktionsgemisch unter Zugabe des Linker-nestprimers und des MLV3 prime LTR-nestprimers her. Fügen Sie anschließend zwei Mikroliter des PCR-Produkts aus der PCR der ersten Runde als Vorlage hinzu. Führen Sie danach die PCR der zweiten Runde durch, um die endgültigen LN-PCR-Produkte zu erzeugen.

Nach der zweiten PCR-Runde die 48 nested LM-PCR-Ansätze in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Anschließend 20 Mikroliter Puffer für die Gelelektrophorese zu 100 Mikrolitern des gepoolten und präzipitierten LM-PCR-Produkts hinzufügen. Die Probe zusammen mit der 100-Basenpaar-DNA-Leiter auf ein einprozentiges Agarosegel auftragen.

Laufen Sie das Gel bei fünf Volt pro Zentimeter für 30 bis 60 Minuten, bis die Banden aufgetrennt sind, und schneiden Sie den Anteil des Gels aus, der Amplikone mit einer Länge von 500 bis 150 Basenpaaren enthält. Nach der Reinigung des LM-PCR-Produkts mit einem Säulen-basierten Gelextraktionskit messen Sie die Konzentration mithilfe eines UV-Spektrophotometers, bevor Sie mit der Bibliotheksherstellung fortfahren. Außerdem bewerten Sie die Länge der LM-PCR-Produkte mit einem Bioanalyzer-Gerät gemäß den Herstelleranweisungen.

Bereiten Sie die Bibliothek vor, indem Sie eine Indexierungs-PCR einrichten. Verwenden Sie für jede PCR 150 bis 170 Nanogramm des gereinigten LM-PCR-Produkts, jeweils mit einer unterschiedlichen Indexkombination pro Probe. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie angegeben durch.

Nach der PCR verdünnen Sie die gereinigte Bibliothek mit 10 Millimolar Tris-HCl auf 10 Nanomolar. Mischen Sie anschließend fünf Mikroliter der verdünnten Pool mit fünf Mikroliter 0,2 Normal-Natriumhydroxid in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Kurz verwirbeln, kurz zentrifugieren und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bibliotheken zu denaturieren.

Stellen Sie die Röhrchen mit dem denaturierten Pool auf Eis und geben Sie 990 Mikroliter vorgekühlten HT1-Hybridisierungspuffers hinzu. Dann portionieren Sie 300 Mikroliter des denaturierten Pools in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 300 Mikroliter vorgekühlten HT1 hinzu, um einen endgültigen Bibliothekspool mit einer Konzentration von zehn Pikomolar zu erhalten.

Gleichzeitig 10 Nanomolar der fixierten Kontrollbibliothek in einem Volumen von zwei Mikrolitern mit 3 Mikrolitern 10 Millimolar Tris-HCl in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mischen. Fünf Mikroliter 0,2 Normal-Natriumhydroxid hinzufügen und kurz verwirbeln. Nach dem Zentrifugieren fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die verdünnte Fixierung zu denaturieren.

Nach der Inkubation das Röhrchen auf Eis stellen und 990 Mikroliter vorgekühltes HT1 hinzufügen. Nun 100 Mikroliter des denaturierten Fixansatzes in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen aliquotieren und 300 Mikroliter vorgekühltes HT1 hinzufügen, um eine endgültige Konzentration von 10 Pikomolar Fix zu erhalten. Schließlich in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen 510 Mikroliter des denaturierten Bibliothekspools mit 90 Mikrolitern der denaturierten fixierten Bibliothek mischen, um so einen endgültigen 10-Pikomolar-Pool mit 15 % Fix-Kontrolle zum Sequenzieren zu erhalten.

Diese Abbildung zeigt die Analyse von 3498, 2989 bzw. 4103 Clustern rekurrierender MLV-Integrationsstellen in hämatopoetischen Stammvorläuferzellen, erythroiden Vorläuferzellen und myeloischen Vorläuferzellen. In jeder Zellpopulation überlappten mehr als 95 % der MLV-Cluster mit epigenetisch definierten Enhancern und Promotoren. Zellspezifische, durch MLV angezielte Regionen wiesen eine starke Azetylierung auf und standen in Zusammenhang mit der zellspezifischen Expression des targetierten Gens.

Beispiele sind der Promotor des HSP-spezifischen SPINK2-Gens, die Locus-Control-Region, die starke Enhancer der erythroid-spezifischen beta-ähnlichen Globin-Gene enthält, sowie Enhancer, die upstream des NPP-spezifischen LYZ-Gens lokalisiert sind.

Luciferase-Reporter-Assays bestätigten die Untermenge zellspezifischer, auf MLV ausgerichteter Enhancer in EPP und MPP. Erythroide, auf MLV ausgerichtete Regionen wiesen eine höhere Aktivität in EPP als in MPP auf, und umgekehrt, was bestätigt, dass MLV zellspezifische Enhancer identifiziert, die möglicherweise die Expression benachbarter Gene steuern. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie innerhalb einer Woche durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Maximierung der Frequenz transduzierter Zellen für eine optimale Rückgewinnung der Integrationsstellen zu beachten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale Integrationsstellen kartiert werden, indem zunächst die genomische DNA angepasst, anschließend die genomischen Fragmente mit einem DNA-Linker ligiert, danach die Virus-Genom-Übergänge über LM-PCR amplifiziert und schließlich die Amplikon-Bibliothek mittels Tiefensequenzierung analysiert wird.