Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Integrationsstellen von retroviralen Vektoren, die vom Maus-Leukämievirus abgeleitet sind, zu kartieren, um zellspezifische regulatorische Regionen zu definieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in Gentherapie- und Genregulationsstudien zu beantworten, z. B. wo sich der Vektor in das menschliche Genom integriert und welches regulatorische Element über einen bestimmten Subtyp aktiv genutzt werden kann. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir in gentherapeutischen Studien beobachteten, dass MLV-Vektoren in aktive subspezifische Promotoren und Enhancer integriert werden.

Beginnen Sie mit der Transduktion der Zielzellen mit einem MLV-abgeleiteten retroviralen Vektor, der das EGFP-Reportergen beherbergt und mit VSV-G oder dem amphrotopischen Hüllglykoprotein pseudotypisiert ist. Mock-transduzierte Zellen werden als Negativkontrolle verwendet. 48 Stunden nach der Transduktion zentrifugieren Sie die Proben und resuspendieren Sie dann 100.000 Zellen in 300 Mikrolitern PBS, die zwei Prozent fötales Rinderserum enthalten.

Messen Sie dann die EGFP-Expression durch metrische Analyse der Durchflussstelle. Ernten Sie weitere 0,5 bis fünf Millionen transduzierte Zellen für die genomische DNA-Vorbereitung und den anschließenden Verdau von Restriktionsenzymen. Richten Sie vier Restriktionsenzymaufschlüsse pro Probe in 1,5-Milliliter-Röhrchen ein.

Verdauen Sie 0,1 bis ein Mikrogramm G-DNA in jedem Röhrchen. Durch Zugabe von 10 Einheiten TRU91 und einem Mikroliter Puffer M pro Probe in einem Endvolumen von 10 Mikrolitern. Geben Sie zwei Mikroliter der Mischung in Aufschlussröhrchen.

Und dann inkubieren Sie die Reaktionen bei 65 Grad Celsius für sechs Stunden oder über Nacht. Geben Sie nach der Inkubation 40 Mikroliter Wasser in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie in dasselbe Röhrchen 10 Einheiten PST1 und einen Mikroliter Puffer H pro Probe.

Geben Sie 10 Mikroliter des Aufschlussreaktionsgemisches in die Aufschlussröhrchen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden oder über Nacht. Am nächsten Tag wurden acht Linker-Ligationsreaktionen in 1,5-Milliliter-Röhrchen durchgeführt.

Für jede Reaktion fügen Sie das Ligase-Reaktionsgemisch zu 10 Mikrolitern der genomischen DNA des Verdauungs hinzu. Inkubieren Sie bei 16 Grad Celsius für drei bis sechs Stunden. Für die PCR der ersten Runde werden 48 PCR-Reaktionen in 0,2-Milliliter-Röhrchen eingerichtet.

Für jede PCR wird das Reaktionsgemisch mit dem Linker-Primer und dem MLV3-Prime-LTR-Primer zu zwei Mikrolitern der Ligationsreaktion gegeben. Legen Sie die Proben in einen Thermocycler mit Heizdeckel. Legen Sie die Zyklusparameter fest und führen Sie die PCR-Reaktion der ersten Runde durch.

Für die zweite PCR-Runde richten Sie das Reaktionsgemisch ein, einschließlich des Linker-Nested-Primers und des MLV3-Prime-LTR-Nested-Primers. Fügen Sie dann zwei Mikroliter des PCR-Produkts aus der PCR der ersten Runde als Template hinzu. Führen Sie dann die PCR-Reaktion der zweiten Runde durch, um die endgültigen LN-PCR-Produkte zu generieren.

Nach der zweiten PCR-Runde ziehen Sie die 48 verschachtelten LM-PCR-Reaktionen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dann 20 Mikroliter Ladepuffer zu 100 Mikrolitern des gepoolten und gefällten LM-PCR-Produkts hinzu. Und laden Sie die Probe zusammen mit der 100-Basenpaar-DNA-Leiter auf ein einprozentiges Agarosegel.

Lassen Sie das Gel 30 bis 60 Minuten lang bei fünf Volt pro Zentimeter laufen, sobald die Banden aufgelöst sind, schneiden Sie den Anteil des Gels ab, der 500 bis 150 Basenpaare lange Amplikons enthält. Nach der Aufreinigung des LM-PCR-Produkts mit einem säulenbasierten Gel-Extraktionskit messen Sie die Konzentration mit einem UV-Spektralphotometer, bevor Sie mit der Vorbereitung der Bibliothek fortfahren. Bewerten Sie außerdem die Länge der LM PCR-Produkte mit einem Bioanalysegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Bereiten Sie die Bibliothek vor, indem Sie eine Indizierungs-PCR einrichten. Verwenden Sie für jede PCR 150 bis 170 Nanogramm gereinigtes LM-PCR-Produkt in unterschiedlichen Indexkombinationen für jede Probe. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie angegeben durch.

Nach der PCR verdünnen Sie die gereinigte Bibliothek auf 10 Nanomolar mit 10 Millimolar Tris HCL. Mischen Sie anschließend fünf Mikroliter verdünntes Becken mit fünf Mikrolitern 0,2 Newton Natriumhydroxid in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Kurz vortexen, herunterschleudern und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bibliotheken zu denaturieren.

Legen Sie die Röhrchen mit dem denaturierten Pool auf Eis und 990 Mikroliter vorgekühlten HT1-Hybridisierungspuffer. Dann aliquotieren Sie 300 Mikroliter denaturiertes Becken in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Und fügen Sie 300 Mikroliter vorgekühltes HT1 hinzu, um einen endgültigen Bibliothekspool von zehn Pikomolare zu erhalten.

Parallel dazu werden 10 Nanomolare der festen Kontrollbibliothek in einem Volumen von zwei Mikrolitern mit 3 Mikrolitern 10 Millimolar Tris HCl in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gemischt. Fünf Mikroliter 0,2 Newton Natriumhydroxid zugeben und kurz vortexen. Nach dem Schleudern fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um den verdünnten Fix zu denaturieren.

Stellen Sie das Röhrchen nach der Inkubation auf Eis und fügen Sie 990 Mikroliter vorgekühltes HT1 hinzu. Aliquotieren Sie nun 100 Mikroliter denaturierten Fixstoff in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 300 Mikroliter vorgekühltes HT1 hinzu, um eine Endkonzentration von 10 pikomolärem Fixstoff zu erhalten. Schließlich werden in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen 510 Mikroliter denaturierter Bibliothekspool mit 90 Mikrolitern denaturierter fester Bibliothek gemischt, wodurch ein endgültiger 10-Pikomolar-Pool mit 15 % fixer Kontrolle erhalten wird, der sequenziert werden soll.

Dieses Bild zeigt die Analyse von 3498, 2989 und 4103 Clustern von rezidivierenden MLV-Integrationsstellen in hämatopoetischen Stammvorläuferzellen, erythroiden Vorläuferzellen bzw. myeloischen Vorläuferzellen. In jeder Zellpopulation überlappten sich mehr als 95 % der MLV-Cluster mit epigenetisch definierten Enhancern und Promotoren. Zellspezifische MLV-Zielregionen waren stark acetyliert und mit der zellspezifischen Expression des Zielgens assoziiert.

Beispiele hierfür sind der Promotor des HSP-spezifischen SPINK2-Gens. Die Locus-Kontrollregion enthält potente Enhancer der erythroidspezifischen beta-ähnlichen Globin-Gene. Enhancer, die sich stromaufwärts des NPP-spezifischen LYZ-Gens befinden.

Luciferase-Reporter-Assays validierten die Untergruppe der zellspezifischen MLV-zielgerichteten Enhancer in EPP und MPP. Erythroid-spezifische MLV-Zielregionen wiesen eine höhere Aktivität in EPP auf als in MPP und umgekehrt, was bestätigt, dass MLV zellspezifische Enhancer identifiziert, die möglicherweise die Expression benachbarter Gene steuern. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Häufigkeit der transduzierten Zellen für eine optimale Entnahme an der Integrationsstelle zu maximieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale Integrationsstellen kartiert werden können, indem Sie zuerst die genomische DNA anpassen, dann die genomischen Fragmente mit einem DNA-Linker ligieren, gefolgt von der Amplifikation der viralen Verbindung des Wirtsgenoms mittels LM-PCR und schließlich die Tiefensequenzierung der Amplikonbibliothek.