Name: Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Kartierung von MLV-Integrationsstellen in menschlichen Zellen zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen. Diese Methode unterstützt Gentherapie-Studien durch die Identifizierung aktiver Promotoren und Enhancer.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Europäischen Forschungsrates (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), des italienischen Ministeriums für Bildung, Universitäten und Forschung (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003) unterstützt , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), das italienische Gesundheitsministerium (Young Researchers Call 2011 GR-2011-02352026) und die Imagine Institute Foundation (Paris, Frankreich).

1. MLV-Transduktion von menschlichen Zellen <ol><li> Isolieren Sie die Zielzellen und transduzieren sie mit einem mVV-abgeleiteten retroviralen Vektor, der das eGFP-Reportergen beherbergt und mit dem vesikulären Stomatitisvirus G (VSV-G) oder dem amphotropen Hüllglykoprotein 16 pseudotypisiert ist. <ol><li> Halten Sie mock-transduzierte Zellen als Negativkontrolle für die folgenden Analysen. Da mVV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen transduzieren können, Kultur die Zielzellpopulation unter Bedingungen, die die Zellteilung stimulieren. Die Transduktionsbedingungen müssen für jeden untersuchten Zelltyp spezifisch optimiert werden. Zellwachstum und Transduktionsbedingungen für menschliche hämatopoetische Vorläufer, T-Zellen und epidermale Zellen sind in den Literaturstellen 7, 14, 15 und 17 beschrieben. </li></ol></li><li> 48 h nach der Transduktion werden 100.000 Zellen in 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% fötalem Rinderserum resuspendiert und die eGFP-Expression mit f gemessenNiedrige zytometrische Analyse (488-nm-Anregungslaser). Verwenden Sie mock-transduzierte Zellen als Negativkontrolle. Zur optimalen Integrationsstelle retrieval, reinigen Sie GFP + -Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). </li><li> Sammeln Sie 0,5 bis 5 Millionen Zellen für die genomische DNA-Präparation. Eine längere Kulturperiode (&gt; 7 Tage) wird bevorzugt, um das unintegrierte Provirus zu verdünnen und notwendig, wenn man die Langzeit-Nachkommenschaft von bona fide Stammzellen analysiert (siehe Diskussionsteil und Referenz 15 ). Die Zellpellets können bei -80 ° C bis zur Verwendung eingefroren und gelagert werden. </li></ol> 2. Amplifikation von mLV-Integrationsstellen durch Linker-vermittelte PCR (LM-PCR) <ol><li> Vorbereitung der genomischen DNA (gDNA) <ol><li> Extrahieren von gDNA unter Verwendung eines säulenbasierten DNA-Extraktionskits und folgen dem Protokoll für kultivierte Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Restriktionsenzym Digestiauf <ol><li> Richten Sie 4 Restriktionsenzymverdauungen pro Probe in 1,5 ml Röhrchen ein. Digest 0,1 bis 1 μg gDNA in jedem Röhrchen durch Zugabe von 1 μl Tru9I (10U) und 1 μl Puffer M in einem Endvolumen von 10 μl. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 65 ° C für 6 h oder über Nacht. </li><li> Zu jeder Reaktion werden 1 μl PstI (10U), 1 μl Puffer H und 8 μl Wasser gegeben. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 ° C für 6 h oder über Nacht. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol></li><li> Linker ligation <ol><li> Vorbereitung einer 100 &amp; mgr; M Tru9I-Linker-Stammlösung in einem 1,5 ml-Röhrchen durch Mischen der Linker plus Strang- und Linker-Minus-Strang-Oligonukleotide bei einer Konzentration von 100 &amp; mgr; M. Setzen Sie das Röhrchen in ein Wasser auf 100 ° C und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Tru9I Linker-Stammlösung kann bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Richten Sie 8 Linker Ligationsreaktionen in 1,5 ml Röhrchen ein. Fügen Sie für jede Reaktion die folgende Komponente hinzuS bis 10 μl Restriktionsenzymverdauung: 1,4 μl 10X T4 DNA Ligase Reaction Puffer, 1 μl 10 μM Linker Tru9I, 1 μL (2.000U) T4 DNA Ligase und 0,6 μl Wasser. Inkubieren bei 16 ° C für 3 bis 6 h. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol></li><li> Erste PCR <ol><li> Stellen Sie 48 PCR-Reaktionen (6 Reaktionen von jedem Ligaturrohr) in 0,2 ml Röhrchen auf. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Reagenzien zu 2 μl Ligationsreaktion hinzu: 5 μl 10X PCR Puffer, 2 μl 50 mM Magnesiumsulfat, 1 μl 10 mM Desoxynukleotid (dNTP) Mix, 1 μl 10 μM Linker Primer, 1 &amp; Mgr; l 10 &amp; mgr; M mLV-3 &#39;LTR-Primer, 0,3 &amp; mgr; l (1,5 U) Taq-DNA-Polymerase und 37,7 &amp; mgr; l Wasser. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 angegeben. </li><li> Die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt durchführen: 95 ° C für 2 min; 25 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; 72 °C für 5 min; Bei 4 ° C halten. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol></li><li> Zweite PCR <ol><li> Stellen Sie 48 PCR-Reaktionen (1 von jedem &quot;ersten PCR&quot; -Rohr) in 0,2 ml Röhrchen auf. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Komponenten zu 2 μl der ersten PCR-Reaktion hinzu: 5 μl 10X PCR-Puffer, 2 μl 50 mM Magnesiumsulfat, 1 μl 10 mM dNTP Mix, 1 μl 10 μM Linker verschachtelter Primer, 1 &amp; Mgr; l 10 &amp; mgr; M mLV-3 &#39;LTR-verschachtelter Primer, 0,3 &amp; mgr; l Taq-DNA-Polymerase (1,5 U) und 37,7 &amp; mgr; l Wasser. Verwenden Sie verschachtelte Primer, die für die gewählte massive Sequenzierungsstrategie entwickelt wurden: (i) Linker verschachtelte Primer und mLV-3 &#39;LTR verschachtelte Primer kompatibel mit Illumina Plattform; (Ii) Linker verschachtelte Primer und mLV-3 &#39;LTR verschachtelte Primer kompatibel mit Roche-Plattform. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet. </li><li> Die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt durchführen: 95 ° C für 2 min; 25Zyklen von 95 ° C für 15 s, 58 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 5 min; Bei 4 ° C halten. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Beide die 48 verschachtelten PCR-Reaktionen in einem 15-ml-Röhrchen (Endvolumen von ~ 2,4 ml). Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Anwesenheit und die Größe der LM-PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese. <ol><li> Man gibt 4 μl Ladepuffer auf 20 μl LM-PCR-Produkte und beladen die Probe auf ein 1% Agarosegel zusammen mit einer 100 bp DNA Leiter. Führen Sie das Gel bei 5 V / cm für 30 bis 60 min und visualisieren Sie die PCR-Produkte durch Ethidiumbromid-Färbung. </li><li> Führen Sie eine LM-PCR-Reaktion aus der mock-transduzierten Probe als Negativkontrolle aus. </li></ol></li><li> Die Amplifikate durch Zugabe von 0,1 Volumina Natriumacetatlösung (3 M, pH 5,2) und 2,5 Volumina 100% igem Ethanol abfließen lassen. Mischen und Einfrieren bei -80 ° C für 20 min. <ol><li> Spin bei fuGeschwindigkeit in einer Standard-Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 20 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet mit 70% Ethanol waschen. Mit hoher Geschwindigkeit in einer Standard-Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min drehen. </li><li> Den Überstand verwerfen und das Pellet an der Luft trocknen. 200 μl PCR-Wasser geben und die DNA resuspendieren. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol></li><li> Füge 20 μl Ladepuffer auf 100 μl der LM-PCR-Produkte hinzu und lade die Probe auf ein 1% Agarosegel zusammen mit einer 100 bp DNA Leiter. <ol><li> Führen Sie das Gel bei 5 V / cm für 30 bis 60 min und schneiden Sie den Teil des Gels mit 150 bis 500 bp-langen Ampullen. </li><li> Reinigen Sie die LM-PCR-Produkte mit einem säulenbasierten Gel-Extraktionskit und messen Sie die Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer. </li></ol></li><li> Verwenden Sie 1 μl Bibliothek, um die Länge der LM-PCR-Produkte mit einem Bioanalyzer-Instrument nach den Anweisungen des Herstellers zu bewerten. </li><li><sTrong&gt; Schrotflinte Klonen von Ampullen <ol><li> Verwenden Sie 20 ng der gereinigten LM-PCR-Produkte und klonen sie im pCR2.1-TOPO-Vektor gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie Sequenzierungsreaktionen mit dem M13 Universal-Primer durch, gefolgt von einer genomischen Kartierung der resultierenden Sequenzen, um die Anwesenheit der Virus-Genom-Übergänge (einschließlich des mLV-3 &#39;LTR-verschachtelten Primers) in&gt; 50% der Klone zu identifizieren, um die geeigneten Proben zu identifizieren Für massive sequenzierung. Beispiel einer Virus-Genom-Kreuzung: <img alt="Kreuzung" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> MLV-3 &#39;LTR verschachtelte Primer 454 und Linker verschachtelte Primer 454 ( Tabelle 1 ) sind fett markiert und das 3&#39;-Ende des viralen LTR kursiv. Die menschliche genomische Sequenz wird im roten Text hervorgehoben (chr10: 6439408-6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. Massive Sequenzierung von mLV Integration Sites HINWEIS: LM-PCR prodKönnen mit kommerziellen Plattformen sequenziert werden (Auswahl des richtigen verschachtelten Primerpaares in der zweiten PCR-Reaktion, siehe Abschnitt 2.5.1). Zur Sequenzierung der Roche GS-FLX Pyrosequenzierungsplattform siehe vorherige Papiere 7 , 14 , 15 . In diesem Abschnitt wird ein neu optimiertes Protokoll für die Illumina-Sequenzplattform beschrieben. <ol><li> Bibliotheksvorbereitung <ol><li> Stellen Sie 1 Indexing PCR Reaktion pro Probe in 0,2 ml Röhrchen ein. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Reagenzien zu 5 μl (150-170 ng) gereinigtem LM-PCR-Produkt hinzu: 5 μl Index Primer 1, 5 μl Index Primer 2, 25 μl 2X Master Mix und 10 μl PCR- Klasse Wasser. Verwenden Sie für jede Probe eine andere Indexkombination. </li><li> Durchführen von PCR-Reaktionen in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt: 95 ° C für 3 min; 8 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s; 72 ° C für 5 mim; Bei 4 ° C halten. </li><li> Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Festphasen-Reversible Immobilisierungsprotokoll (SPRI) -Wulst-Isolationsprotokoll: In neuen 1,5-ml-Röhrchen werden 56 μl Perlen zu jeder Probe gegeben und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 25 &amp; mgr; l Tris-HCl 10 mM. Bibliotheken können bei -20 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. </li></ol></li><li> Bibliotheksprüfung <ol><li> Verwenden Sie 1 μl Probe, um die Bibliotheksgröße mit einem Bioanalyzer-Instrument zu beurteilen. </li><li> Verwenden Sie 1 &amp; mgr; l Probe, um die Bibliotheksmolarität unter Verwendung eines Fluoreszenz-basierten Echtzeit-PCR-Tests gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren. </li></ol></li><li> Bibliotheksverdünnung und Sequenzierung <ol><li> Verdünnen Sie Bibliotheken auf 10 nM mit Tris-HCl 10 mM. Zur Bündelung von Bibliotheken werden 5 μl jeder verdünnten Bibliothek in ein neues 1,5 mL Röhrchen gegeben und dann den Pool auf 4 nM in Tris-HCl 10 mM verdünnt. </li><li> Mischen Sie 5 μl verdünntes Pool mit 5 μl 0,2 N NaOH in einer neuen 1,5 mL-Röhrchen, kurz vorspülen, abschleudern und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bibliotheken zu denaturieren. </li><li> Die Röhrchen auf Eis geben und 990 μl vorgekühlter Hybridisierungspuffer (HT1) zugeben. Aliquotieren Sie 300 &amp; mgr; l denaturierten Pool in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie 300 &amp; mgr; l vorgekühltes HT1 hinzu, um ein 10 pF-Endbibliothekspool zu erhalten. </li><li> Parallel dazu werden 2 μl PhiX-Kontrollbibliothek (10 nM) mit 3 μl Tris-HCl 10 mM in einem 1,5 mL-Röhrchen vermischt. 5 μl NaOH 0,2 N zugeben, kurz vorspülen, abschleudern und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um das verdünnte PhiX zu denaturieren. Setzen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie 990 μl vorgekühltes HT1 hinzu. </li><li> Aliquotieren Sie 300 &amp; mgr; l denaturierten PhiX in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie 300 &amp; mgr; l vorkühlendes HT &amp; sub1; hinzu, um ein 10 pM EndphiX zu erhalten. </li><li> In einem neuen 1,5-ml-Röhrchen werden 510 μl denaturierter Bibliothekspool mit 90 μl denaturierter PhiX-Bibliothek vermischt und damit ein endgültiges 10 pM-Pool mit 15% PhiX-Kontrolle erhalten. </li><li> Pipettieren Sie diese 600 μl ProbeVolumen in das Load Sample Reservoir der aufgetauten Sequenzreagenzkartusche ein und fährt sofort fort, um einen einmal gelesenen 150-Zyklus-Lauf durchzuführen. HINWEIS: Die für dieses Protokoll benötigten kritischen Reagenzien und Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet. </li></ol></li></ol>

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<li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+enhancers%3A+from+properties+to+genome-wide+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsstellen von mLV beschrieben, ein Retrovirus, das Chromatinregionen anspricht, epigenetisch als aktive Promotoren und Enhancer markiert. Kritische Schritte und / oder Einschränkungen des Protokolls umfassen: (i) mLV-Transduktion der Zielzellpopulation; (Ii) Amplifikation von Virus-Host-Übergängen durch LM-PCR; (Iii) Abrufen eines hohen Anteils an Integrationsstellen. MLV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen. Die geringe Effi...

Die Zellidentität wird durch die Expression spezifischer Gene bestimmt. Die Rolle von cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern ist entscheidend für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen. Diese regulatorischen Regionen zeichnen sich durch spezifische Chromatin-Merkmale aus, wie z. B. eigenartige Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren-Bindung und Chromatin-Zugänglichkeit, die für ihre genomweite Identifizierung in mehreren Zelltypen 1 , 2 , 3 weit verbreitet sind. Insbesondere wird das genomweite Profil der Acetylierung von Histon H3-Lysin 27 (H3K27ac) üblicherweise zur Definition von aktiven Promotoren, Enhancern und Super-Enhancern 4 , 5 , 6 verwendet. Moloney murine Leukämie-Virus (MLV) ist ein Gamma-Retrovirus, das weit verbreitet für Gen verwendet wirdTransfer in Säugetierzellen. Nach der Infektion einer Zielzelle wird das retrovirale RNA-Genom in einem doppelsträngigen DNA-Molekül retro-transkribiert, das virale und zelluläre Proteine ​​bindet, um den Vorintegrationskomplex (PIC) zu bilden. Der PIC tritt in den Kern ein und bindet das Wirtszellchromatin. Hier vermittelt die virale Integrase, eine Schlüssel-PIC-Komponente, die Integration der proviralen DNA in das Wirtszellgenom. Die mLV-Integration in die genomische DNA ist nicht zufällig, sondern tritt in aktiven cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern in zellspezifischer Weise 7 , 8 , 9 , 10 auf . Dieses eigenartige Integrationsprofil wird durch eine direkte Wechselwirkung zwischen der mLV-Integrase und den zellulären Bromodomain- und extraterminalen Domänen (BET) -Proteinen 11 , 12 , 13 vermittelt. BET - Proteine ​​(BRD2, BRD3 undBRD4) als Brücke zwischen Wirtschromatin und mLV PIC: Durch ihre Bromodomänen erkennen sie hoch acetylierte cis-regulatorische Regionen, während die extraterminalen Domäne mit der mLV-Integrase 11 , 12 , 13 wechselwirkt. Hier beschreiben wir das retrovirale Scannen, ein neuartiges Werkzeug, um aktive cis-regulatorische Regionen auf der Basis der Integrationseigenschaften von mLV abzubilden. Kurz gesagt werden die Zellen mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der das verstärkte rekonstruierte Gen (EGFP) -Reporter-Gen des grünen fluoreszierenden Proteins exprimiert. Nach der genomischen DNA-Extraktion werden die Übergänge zwischen der 3&#39;-langen terminalen Wiederholung (LTR) des mLV-Vektors und der genomischen DNA durch Linker-vermittelte PCR (LM-PCR) amplifiziert und massiv sequenziert. MLV-Integrationsstandorte werden dem menschlichen Genom zugeordnet, und genomische Regionen, die stark von mLV gezielt sind, werden als Cluster von mLV-Integrationsstellen definiert. Retroviraler ScanNing wurde verwendet, um zellspezifische aktive regulatorische Elemente in mehreren menschlichen Primärzellen 14 , 15 zu definieren. MLV-Cluster, die mit epigenetisch definierten Promotoren und Enhancern co-mapped waren, von denen die meisten aktive Histonmarken wie H3K27ac enthielten und zellspezifisch waren. Das retrovirale Scannen ermöglicht die genomweite Identifizierung von DNA-regulatorischen Elementen in prospektiv gereinigten Zellpopulationen 7 , 14 sowie in retrospektiv definierten Zellpopulationen wie Keratinozyten-Stammzellen, die keine wirksamen Marker für die prospektive Isolation fehlen 15 .

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>0,2 ml Röhrchen</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Röhrchen</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>oder äquivalente</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase-Reaktionspuffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Linker Plus Strang Oligonukleotid</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td>5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' &nbsp; (Reinigungsgrad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Linker Minus Strand Oligonukleotid</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Reinigungsgrad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Puffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platin-Taq-DNA-Polimerase High Fidelity&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>oder gleichwertiges</td></tr><tr><td>Wasser in PCR-Qualität</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Thermocycler (mit beheiztem Deckel)</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linker Primer</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Reinigungsgrad: PCR-Qualität)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR Grundierung</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td>5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Reinigungsgrad: PCR-Qualität)</td></tr><tr><td>Linker Nested Primer 454</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td>5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Reinigungsgrad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR Nested Primer 454</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td>5'-GCCTCCCTCGCCCCTCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Reinigungsgrad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Linker Nested Primer Illumina</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td>5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Reinigungsgrad: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR Nested Primer Illumina</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Reinigungsqualität: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Natriumacetatlösung (3M) pH 5,2</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (absolut) für die Molekularbiologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Topo TA Klonierungskit (mit pCR2.1-TOPO-Vektor)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>100 bp DNA-Leiter</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>6x Loading Buffer</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spektralphotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 oder FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Magnetständer für 2 ml Röhrchen</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 60 ml Kit</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8,5</td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2200 TapeStation System</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>D1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit für Illumina-Plattformen (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, molekular </td><td>allgemeiner Laborlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT1 (Hybridisierungspuffer) für Biologie.Illumina</td><td>&nbsp;</td><td>Im MiSeq Reagenzienkit</td><td></td></tr><tr><td>enthalten MiSeq Reagenzienkit v3 (150 Zyklen)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq System</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

retroviral scanning: mapping mlv integration sites zur definition zellspezifischer regulierungsregionen

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Moloney murine Leukämie (MLV) Virus-basierte retrovirale Vektoren integrieren sich überwiegend in acetylierte Enhancer und Promotoren. Aus diesem Grund können mLV-Integrationsorte als funktionale Marker aktiver regulatorischer Elemente verwendet werden. Hier präsentieren wir ein retrovirales Scan-Tool, das die genomweite Identifizierung von zellspezifischen Enhancern und Promotoren ermöglicht. Kurz gesagt wird die Zielzellpopulation mit einem mLV-abgeleiteten Vektor transduziert und genomische DNA wird mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym verdaut. Nach der Ligation von genomischen Fragmenten mit einem kompatiblen DNA-Linker ermöglicht die Linker-vermittelte Polymerase-Kettenreaktion (LM-PCR) die Amplifikation der Virus-Host-Genom-Übergänge. Die massive Sequenzierung der Ampullen wird verwendet, um das mLV-Integrationsprofil genomweit zu definieren. Schließlich werden Cluster von wiederkehrenden Integrationen definiert, um zellspezifische regulatorische Regionen zu identifizieren, die für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen verantwortlich sind. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Das retrovirale Scan-Tool ermöglicht die genomweite Identifizierung von zellspezifischen Promotoren und Enhancern in prospektiv isolierten Zielzellpopulationen. Bemerkenswerterweise stellt das retrovirale Scannen eine instrumentelle Technik für die retrospektive Identifizierung von seltenen Populationen ( z. B. somatische Stammzellen) dar, die keine robusten Marker für eine prospektive Isolation aufweisen.

Arbeitsablauf des retroviralen Scanvorgangs Der Arbeitsablauf des retroviralen Abtastvorgangs ist in Abbildung 1 schematisiert. Die Zielzellpopulation wird gereinigt und mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der ein eGFP-Reportergen exprimiert. Das Transgen wird von den beiden identischen langen terminalen Wiederholungen (5 &#39;und 3&#39; LTR) flankiert, was die Synthese, die ...

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsorte von Moloney murinen Leukämie-Virus-basierten retroviralen Vektoren in menschlichen Zellen.

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Integrationsstellen von aus murinem Leukämievirus stammenden retroviralen Vektoren abzubilden, um zellspezifische regulatorische Regionen zu definieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Gentherapie und bei Studien zur Genregulation zu beantworten, beispielsweise wo der Vektor im menschlichen Genom integriert und welches regulatorische Element über einen bestimmten Subtyp aktiv genutzt werden kann. Unsere erste Idee zu dieser Methode entstand, als wir beobachteten, dass MLV-Vektoren in Gentherapiestudien in aktive, substypspezifische Promotoren und Enhancer integrieren.Beginnen Sie damit, die Zielzellen mit einem aus MLV stammenden retroviralen Vektor zu transduzieren, der das EGFP-Reportergen enthält und mit VSV-G oder dem amphotropen Hüllglykoprotein pseudotypisiert ist. Als negativen Kontrollansatz werden nicht transduzierte Zellen verwendet. 48 Stunden nach der Transduktion zentrifugieren Sie die Proben und resuspendieren anschließend 100.000 Zellen in 300 µL PBS, der zwei Prozent fötales Kälberserum enthält.Anschließend Messung der EGFP-Expression durch Durchflusszytometrie. Gewinnen Sie weitere 0,5 bis fünf Millionen transduzierte Zellen zur Herstellung von genomischer DNA und anschließender Restriktionsenzymverdauung. Richten Sie vier Restriktionsenzymverdauungen pro Probe in 1,5-Milliliter-Röhrchen ein.Verdauen Sie 0,1 bis ein Mikrogramm G-DNA in jedem Röhrchen, indem Sie je Probe 10 Einheiten TRU91 und ein Mikroliter Puffer M in einem Endvolumen von 10 Mikrolitern hinzufügen. Geben Sie zwei Mikroliter der Mischung in die Verdauungsgefäße.Anschießend die Reaktionen sechs Stunden oder über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation 40 µL Wasser in ein 1,5-mL-Röhrchen geben. In dasselbe Röhrchen je Probe 10 Einheiten PST1 und einen µL Puffer H hinzufügen.Geben Sie 10 Mikroliter der Verdauungsreaktionsmischung in die Verdauungsgefäße. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden oder über Nacht. Richten Sie am nächsten Tag acht Anschlussligationsreaktionen in 1,5-Milliliter-Gefäßen ein.Fügen Sie für jede Reaktion das Ligase-Reaktionsgemisch zu 10 Mikrolitern des verdauten genomischen DNS hinzu. Inkubieren Sie bei 16 Grad Celsius für drei bis sechs Stunden. Für die PCR der ersten Runde bereiten Sie 48 PCR-Reaktionen in 0,2-Milliliter-Röhrchen vor.Fügen Sie für jede PCR das Reaktionsgemisch, das den Linker-Primer und den MLV3-prime-LTR-Primer enthält, zu zwei Mikrolitern der Ligationsreaktion hinzu. Geben Sie die Proben in einen Thermocycler mit Heizdeckel. Stellen Sie die Zyklenparameter ein und führen Sie die PCR der ersten Runde durch.Stellen Sie für die PCR der zweiten Runde das Reaktionsgemisch unter Zugabe des Linker-nestprimers und des MLV3 prime LTR-nestprimers her. Fügen Sie anschließend zwei Mikroliter des PCR-Produkts aus der PCR der ersten Runde als Vorlage hinzu. Führen Sie danach die PCR der zweiten Runde durch, um die endgültigen LN-PCR-Produkte zu erzeugen.Nach der zweiten PCR-Runde die 48 nested LM-PCR-Ansätze in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Anschließend 20 Mikroliter Puffer für die Gelelektrophorese zu 100 Mikrolitern des gepoolten und präzipitierten LM-PCR-Produkts hinzufügen. Die Probe zusammen mit der 100-Basenpaar-DNA-Leiter auf ein einprozentiges Agarosegel auftragen.Laufen Sie das Gel bei fünf Volt pro Zentimeter für 30 bis 60 Minuten, bis die Banden aufgetrennt sind, und schneiden Sie den Anteil des Gels aus, der Amplikone mit einer Länge von 500 bis 150 Basenpaaren enthält. Nach der Reinigung des LM-PCR-Produkts mit einem Säulen-basierten Gelextraktionskit messen Sie die Konzentration mithilfe eines UV-Spektrophotometers, bevor Sie mit der Bibliotheksherstellung fortfahren. Außerdem bewerten Sie die Länge der LM-PCR-Produkte mit einem Bioanalyzer-Gerät gemäß den Herstelleranweisungen.Bereiten Sie die Bibliothek vor, indem Sie eine Indexierungs-PCR einrichten. Verwenden Sie für jede PCR 150 bis 170 Nanogramm des gereinigten LM-PCR-Produkts, jeweils mit einer unterschiedlichen Indexkombination pro Probe. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie angegeben durch.Nach der PCR verdünnen Sie die gereinigte Bibliothek mit 10 Millimolar Tris-HCl auf 10 Nanomolar. Mischen Sie anschließend fünf Mikroliter der verdünnten Pool mit fünf Mikroliter 0,2 Normal-Natriumhydroxid in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Kurz verwirbeln, kurz zentrifugieren und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bibliotheken zu denaturieren.Stellen Sie die Röhrchen mit dem denaturierten Pool auf Eis und geben Sie 990 Mikroliter vorgekühlten HT1-Hybridisierungspuffers hinzu. Dann portionieren Sie 300 Mikroliter des denaturierten Pools in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 300 Mikroliter vorgekühlten HT1 hinzu, um einen endgültigen Bibliothekspool mit einer Konzentration von zehn Pikomolar zu erhalten.Gleichzeitig 10 Nanomolar der fixierten Kontrollbibliothek in einem Volumen von zwei Mikrolitern mit 3 Mikrolitern 10 Millimolar Tris-HCl in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mischen. Fünf Mikroliter 0,2 Normal-Natriumhydroxid hinzufügen und kurz verwirbeln. Nach dem Zentrifugieren fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die verdünnte Fixierung zu denaturieren. Nach der Inkubation das Röhrchen auf Eis stellen und 990 Mikroliter vorgekühltes HT1 hinzufügen. Nun 100 Mikroliter des denaturierten Fixansatzes in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen aliquotieren und 300 Mikroliter vorgekühltes HT1 hinzufügen, um eine endgültige Konzentration von 10 Pikomolar Fix zu erhalten. Schließlich in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen 510 Mikroliter des denaturierten Bibliothekspools mit 90 Mikrolitern der denaturierten fixierten Bibliothek mischen, um so einen endgültigen 10-Pikomolar-Pool mit 15 % Fix-Kontrolle zum Sequenzieren zu erhalten.Diese Abbildung zeigt die Analyse von 3498, 2989 bzw. 4103 Clustern rekurrierender MLV-Integrationsstellen in hämatopoetischen Stammvorläuferzellen, erythroiden Vorläuferzellen und myeloischen Vorläuferzellen. In jeder Zellpopulation überlappten mehr als 95 % der MLV-Cluster mit epigenetisch definierten Enhancern und Promotoren. Zellspezifische, durch MLV angezielte Regionen wiesen eine starke Azetylierung auf und standen in Zusammenhang mit der zellspezifischen Expression des targetierten Gens.Beispiele sind der Promotor des HSP-spezifischen SPINK2-Gens, die Locus-Control-Region, die starke Enhancer der erythroid-spezifischen beta-ähnlichen Globin-Gene enthält, sowie Enhancer, die upstream des NPP-spezifischen LYZ-Gens lokalisiert sind.Luciferase-Reporter-Assays bestätigten die Untermenge zellspezifischer, auf MLV ausgerichteter Enhancer in EPP und MPP. Erythroide, auf MLV ausgerichtete Regionen wiesen eine höhere Aktivität in EPP als in MPP auf, und umgekehrt, was bestätigt, dass MLV zellspezifische Enhancer identifiziert, die möglicherweise die Expression benachbarter Gene steuern. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie innerhalb einer Woche durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Maximierung der Frequenz transduzierter Zellen für eine optimale Rückgewinnung der Integrationsstellen zu beachten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale Integrationsstellen kartiert werden, indem zunächst die genomische DNA angepasst, anschließend die genomischen Fragmente mit einem DNA-Linker ligiert, danach die Virus-Genom-Übergänge über LM-PCR amplifiziert und schließlich die Amplikon-Bibliothek mittels Tiefensequenzierung analysiert wird.

retroviral-scanning-mapping-mlv-integration-sites-to-define-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren...

Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

In voller Länge individuelle proviralen Sequenzierung (FLIPS) bietet eine effiziente und Hochdurchsatz-Methode für die Verstärkung und die Abfolge der einzelnen, in der Nähe von Full-Length (intakt und Defekte) HIV-1-Proviruses und ermöglicht die Bestimmung ihres Potenzials Replikation-Kompetenz. FLIPS überwindet Grenzen der früheren Assays entwickelt, um die latente HIV-1-Reservoir-Sequenz.

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Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

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