Name: Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Lernen Sie einen robusten Hochdurchsatz-Fluss-Streckungs-Assay zur Untersuchung der eindimensionalen Diffusion von Molekülen entlang DNA. Diese Methode nutzt TIRF-Bildgebung und biotin-markierte Lambda-DNA.

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Wir danken Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick und Evangelos Gatzogiannis für Unterstützung bei der anfänglichen Instrumentierung einrichten und testen. Wir danken weiter Tony Kulesa für bedeutende Hilfe schreiben und Bewertung der individuellen Einzelkorn-Tracking-Software. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Start und einen Karriere-Award auf der wissenschaftlichen Schnittstelle (PCB) von Burroughs Wellcome Foundation unterstützt.

1. Vorbereitung der Biotin-λ-DNA Hinweis: Biotin-λ-DNA-Moleküle sind bereit, durch Ligation eine Biotin-markierten Oligonukleotid, 5 &#39;-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - Biotin - 3 &#39;, Λ-DNA Moleküle 20.
<ol><li>Prepare 0,1 mM Biotin beschriftet Oligo in TE-Puffer.</li>
	<li>Wärme 0,5 mg/mL λ-DNA Lager bei 65 ° C für 60 s und Sprung in nassem Eis sofort. 
	Hinweis: Schnelle Quench Kühlung reduziert λ-DNA-Concatemerization.</li>
	<li>Pipette 100 µL der λ-DNA-Lösung zu einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Add 1 µL 0.1 mM Oligo in 9 µL TE-Puffer.</li>
	<li>Add 2 µL der Oligo-Lösung für den Microcentrifuge Schlauch mit λ-DNA. Gründlich mischen. 
	Hinweis: Oligo ist in etwa eine 12-fold Molaren Überschuss über ergänzende λ-DNA Ende.</li>
	<li>Erhitzen Sie die Mischung der λ-DNA/Oligo bei 65 ° C für 60 s.</li>
	<li>Langsam die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen. 
	Hinweis: In diesem Schritt können die Oligo bis zu ergänzenden λ-DNA Ende Tempern.</li>
	<li>Legen Sie die Mischung auf dem Eis. Fügen Sie 11 µL T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (endgültige Puffer Konzentration 1 X). Mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie 2 µL (800 Stück) T4 DNA-Ligase-Enzym. Vorsichtig mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 16 ° C oder über Nacht bei 4 ° c</li>
	<li>Reinigen Sie das Produkt mit zentrifugalen Filterschläuche mit einem nominalen Molekulargewicht Limit von 100 kDa. Insbesondere übertragen die Schritt 1,9-Mischung in eine zentrifugale Filter Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min, mit 400 µL TE-Puffer zweimal waschen und sammeln das gereinigte Produkt. 
	Hinweis: Die als gereinigt Biotin-λ-DNA in TE-Puffer sind stabil bei-20 ° C bis zu einem Jahr.</li>
</ol> 2. Deckglas Funktionalisierung Hinweis: Glasdeckgläser sind durch die Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Diese einstufige Reaktion Protokoll ist einfacher und zuverlässiger erfahrungsgemäß als standard zweistufige Reaktion Protokoll 20. Deckglas Funktionalisierung mit Silan-PEG-Biotin schafft Bindungsstellen für Streptavidin und minimiert die unspezifische DNA und Protein Adsorption an der Oberfläche des Deckglases.
<ol><li>Sonicate fünf Nr. 1 Deckgläsern in 95 % igem Ethanol im Inneren eine Färbung jar für 10 min und dann mit Reinstwasser dreimal ausspülen. 
	Hinweis: Die fünfte Deckglas bietet einen Ersatz bei Bruch.</li>
	<li>Füllen Sie die Färbung Glas mit 1 M KOH, 10 min. lang beschallen und dann spülen Sie mit Reinstwasser dreimal.</li>
	<li>2.1-2.2 Zyklus zweimal wiederholen.</li>
	<li>Trocknen Deckgläsern unter trockenen, sauberen Gasstrom der N 2.</li>
	<li>Weitere reinigen und trocknen Sie die Deckgläsern durch Luft Plasmabehandlung bei 900 mTorr Druck für 5 min.</li>
	<li>Brüten Deckgläsern mit 25 mg/mL Silan-Peg-Biotin speziell in 95 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für 2 h aufgelöst, sandwich-50 µL Silan-Peg-Biotin Lösung zwischen zwei sauberen und trockenen Deckgläsern und inkubieren Sie das Deckglas &#34; Sandwiches &#34; innerhalb einer geschlossenen Pipette Tip Box mit ca. 10 mL Wasser an der Unterseite (nicht in Kontakt mit den Deckgläsern) Lösungsmittel verdampfen zu minimieren.</li>
	<li>Waschen entfernt überschüssige PEG Molekülen mit Reinstwasser und Trocknen der PEG Deckgläsern unter sauberen beschichtet trocknen Gasstrom N 2. 
	Hinweis: Die funktionalisierten Deckgläsern können bis zu drei Tage unter Umgebungsbedingungen gelagert werden.</li>
</ol> 3. Bau der Zelle fließen Hinweis: Durchflusszellen entstehen durch sandwiching eine Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen eine PEG funktionalisiert Deckglas und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen. Mehrere Kanäle fließen pro Durchflusszelle.
<ol><li>Strömungskanäle in einer CAD-Software-design und Schnitt die Kanäle (Breite, Tiefe und Länge der einzelnen Kanäle sind 1, 0,13 und 12 mm, beziehungsweise) auf ein Doppel-Klebeband mithilfe einer Bandabschneider (in der Regel acht Kanäle fließen pro Zelle). Entfernen Sie Klebeband Residuen der Strömungskanäle bilden.</li>
	<li>Zu PDMS Platten, mischen Sie 45 g PDMS mit 5 g Vernetzung Reagenz (genug für die Herstellung von zwölf 5 mm dicker PMDS Platten die unter Umgebungsbedingungen auf unbestimmte Zeit gespeichert werden kann) mit einem Mixer, den Teig in zwei 10 cm Petrischalen und lassen die Gerichte in einer Vakuumkammer bis im Wesentlichen alle Luftblasen sind verschwunden (manuell entfernen Luftblasen, wenn irgendwelche bleiben, wenn die Gerichte aus der Vakuumkammer entfernt werden). Übertragen Sie dann die Gerichte in einem Ofen 80 ° C bis PDMS erstarrt (ca. 2 h).</li>
	<li>Schneiden Sie ein PDMS-Platte, die die Größe der Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanälen entspricht. Peel ein Schutzfilm aus dem Doppel-Klebeband und halten den Film auf eine Ebene Fläche der Platte PDMS. Ablauf und Zulauf Lochen auf der PDMS-Platte mit einem 23 Gauge-Nadel eine Biopsie Loch-Puncher.</li>
	<li>Schälen die zweite Schutzfolie aus dem Doppel-Klebeband und halten die PDMS-Band Montage an die funktionalisierten Oberfläche das Deckglas (stellen Sie sicher, dass das Deckglas flach ist. Sehen ein Bild von einer fertig montierten Durchflusszelle in Abbildung 1a).</li>
</ol> 4. Imaging-TIRF Hinweis: Biotin-λ-DNA sind angebunden an eine Flow-Kanal-Oberfläche und Laminar-Flow gilt für Flow erstrecken sich die DNA-Moleküle ( Abbildung 1 b). Die &#62; 80 % gedehnt DNA Moleküle dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu beobachten. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse TIRF Imaging ( Abbildung 1 c &#38; e).
<ol><li>Fix der Messzelle am Mikroskop Bühne und Last bereits entgast leeren Puffer (10 mM Natriumphosphat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM Ethanol, 5 % (V/V) Glycerin, 0,01 % Tween-20, 1 % (V/V) β-Mercaptoethanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 1 mg / mL Bovine Serum Albumin (BSA) und 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung in vier Stauseen, dass jeweils ein Tygon-Schlauch mit einem Magnetventil-Wert verbunden und eine PEEK-Schlauch durch Sleeven den Tygon-Schlauch über die kleineren PEEK Rohr (ein weiteres Tygon Schlauch verbunden verhindert Rückfluss von Reagenzien). Entgasen von Kleinmengen des Puffers durch Übernachtung Exposition, Vakuum oder kürzeren Exposition gegenüber Vakuum unter Rühren (bis Bläschen nicht mehr sichtbar sind).</li>
	<li>PEEK-Schläuche des leeren Puffer Reservoirs in einer Bucht Loch der Durchflusszelle einfügen Prime den Kanal fließt in leeren Puffer, und drei andere PEEK-Schlauch In Saugbohrungen ist der Luftdruck angetrieben von Energiefluss jedes Reagenz durch Magnetventile gesteuert und vollautomatisch über ein Computer-Skript einfügen. Achten Sie darauf, keine Luft Blasenbildung im Kanal zu induzieren.</li>
	<li>Schließen Sie ein Tygon-Schlauch mit einer kurzen PEEK Schläuche aus der Austrittsöffnung zu einem Abfallbehälter. Der kurze Blick Schlauch am Ausgang hilft Luft Blasenbildung während der Infusion zu unterdrücken, durch die Aufrechterhaltung der Überdruck im Inneren des Kanals.</li>
	<li>Tethering Biotin-λ-DNA-Moleküle zu einer Strömung Kanal Oberfläche.
	<ol><li>Flow in 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 5 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen Streptavidin.</li>
		<li>Durchfluss bei 1 mg/mL BSA-Lösung 1 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen BSA. 
		Hinweis: BSA weiter unterdrückt DNA und Probe Adsorption an der Oberfläche.</li>
		<li>Flow in 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung, 10 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen DNAs. 
		Hinweis: Nachdem die DNA an die Oberfläche gebunden ist, vermeiden Sie schnelle fließt die gefesselte DNA-Moleküle beschädigt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um die Qualität der funktionalisierten Deckglas, fließen in DNA Färbung Farbstoff wie Sytox orange unter der Assay-Bedingungen verwendet werden (siehe 4.6 unten), und starten Sie Fluoreszenz imaging unter 532 nm Laser Beleuchtung. 
	Hinweis: Die Qualität der funktionalisierten Deckglas ist in der Regel gut, und die Dichte der Strömung gestreckt DNA-Moleküle wird hoch sein. Es ist wichtig, hochdichte der Fluss erstreckte sich DNA-Moleküle haben, dass DNA-Bindung und Schiebe/1D Verbreitung Ereignisse beobachtet werden können.</li>
	<li>Feinabstimmung den TIRF Winkel zum besten Signal Rauschabstand von Bildern der gestreckten DNA-Moleküle ( Abbildung 1-d) zu erreichen.</li>
	<li>Bahnen der einzelne Moleküle DNA, voran aufzeichnen wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 in einen neuen Kanal (ohne DNA Farbstoff Färbung), dann ziehen bereits entgast Sub-nanomolaren Fluorophore beschriftet Moleküle mit einer genug hohen Durchflussrate mithilfe einer Spritzenpumpe und sammeln Sie Zeitraffer Fluoreszenzbilder mit einer Frame-Rate von 100 Hz. 
	Hinweis: Eine Durchflussmenge entspricht einem Weissenberg-Zahl (Wi: die dimensionslose Produkt die längste Polymer-Relaxationszeit - ca. 0,2 s für λ-DNA- und die Scherrate - die Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit mit Abstand von der Oberfläche des Deckglases) von 500 innerhalb der Kanal wird für die Einzelmolekül-Bildgebung mit einer Frame-Rate von 100 Hz 21 empfohlen.
	<ol><li>Sammeln 10.000 Bilder in einem Field Of View (FOV), einen Film zu produzieren und ähnliche Filme aus mehreren (in der Regel zehn) FOVs pro Probe zu sammeln. 
		Hinweis: Die Dichte der Partikel in einem FOV sollte weder zu hoch - das wird Datenanalyse erschweren, indem man Objektzuordnung in Frames nicht eindeutig noch zu niedrig - die zu geringe Auftreten von Einzelmolekül-Veranstaltungen auf DNA führen könnte.</li>
		<li>Die Beleuchtungsintensität so optimieren, dass Moleküle gebunden an das Deckglas Oberfläche sind schnell Foto-gebleicht, Hintergrund zu unterdrücken, während Moleküle diffundieren auf DNA nicht vorschnell gebleicht werden, so dass längere Trajektorien erkannt werden können. 
		Hinweis: Wir verwenden in der Regel 200-800 W/cm 2 Leistungsdichte in der FOV.</li>
	</ol></li> <li>Am Ende des Schrittes 4.6 Infusion DNA Farbstoff Färbung zu bestätigen, dass DNA-Moleküle noch Strömung gestreckt werden können.</li>
	<li>Laufen sowohl positive als auch negative Kontrollproben. 
	Hinweis: Eine gute positive Kontrolle ist ein Tetrapeptid, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR ist gekoppelt an das N-terminale Amin) hat eine mittlere 1D Verbreitung konstante 10,5 ± 0,7 (Standardfehler) M (bp- 2/s) bei neutralem pH 11. Eine gute Negativkontrolle ist beschriftete Proben von Interesse in Testpuffer in einem Kanal zu messen, die hat keine DNA angebunden, wo keine Diffusion auf DNA-Aktivität erkannt werden sollten.</li>
</ol> 5. Datenanalyse: Hinweis: eine benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software wird verwendet, um die Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen Verbreitung Konstanten. Diese Software ermittelt zunächst Zentroid Positionen der einzelnen Partikel mit hoher Genauigkeit, Partikel, die auf das Deckglas Oberfläche geklebt sind identifiziert und dann links Partikel in verschiedenen Frames Time-Lapse Trajektorien bilden. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten geschätzt.
<ol><li>Zur Datenanalyse zu starten, öffnen Sie eine scripting Software (siehe Tabelle der Materialien) und gehen Sie zum Verzeichnis der einzelnen Partikel tracking-Software. Öffnen Sie das Skript mit dem Namen &#34; largedataprocess3.m &#34;. Ein wichtiger Parameter definiert werden, ist der Schwellenwert für einzelne Partikeldetektoren.</li>
	<li>Zu bestimmen, die optimale Schwellwert, laufen die &#34; Determine_threshold_value.m &#34; Skript. Dieses Skript zeigt wie der Schwellenwert einzelner Partikeldetektoren auswirkt. Nach der Bestimmung des optimalen Schwellenwerts, laufen die &#34; largedataprocess3.m &#34; Skript</li>
	<li>Nach Abschluss der einzelnen Partikels tracking-Analyse, filtern die rohen Flugbahnen durch Ausführen der &#34; Trajectory_filtering.m &#34; Skript. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) basiert der Filterung Schritt zu visualisieren.</li>
	<li>Auf die GUI-Panel setzt die minimale Verschiebung entlang DNA, MinXDisp, auf 2 Pixel soll die maximale Verschiebung quer zur DNA, MaxYDisp, 2 Pixel die minimale Anzahl der Frames, MinFrames, auf 10 festgelegt; minimale Anzahl der Staaten von Triplett, MinTriplets, um 10; Geben Sie die minimale Diffusion konstante entlang DNA, D_par, 0; Geben Sie die maximale geschätzte Verbreitung Konstante, DNA, D_trans, auf 10 M (bp 2) S -1 quer; der minimale statistische Parameter, Chi 2 _stat auf-5 festgelegt; Legen Sie das minimale Verhältnis der Verschiebung entlang der DNA, die quer zur DNA, MinX/Y, 2. 
	Hinweis: Alle rohe Flugbahnen, die diese Filterung Parameter übergeben sind in Tabelle 1 aufgeführt, und diejenigen, die nicht in Tabelle 3 aufgeführt sind.</li>
	<li>Klicken Sie auf eine Flugbahn Nummer in der Tabelle 1, die Flugbahn wird in Grafik 1 verdrängt &#38; 2. Klicken Sie auf die &#34; Play &#34; der rohen Fluoreszenzbilder abzuspielen. Klicken Sie auf die &#34; Add_to_Table2 &#34;, die Flugbahn als ein einzelnes Molekül Schiebe-Flugbahn zu identifizieren. Am Ende werden alle Trajektorien zu Tabelle2 hinzugefügt gespeichert werden, beim Schließen der GUI.</li>
	<li>, Berechnen Sie die durchschnittliche Verbreitung konstanten, führen Sie das Skript &#34; Calculate_mean_diffusion_constant.m &#34;. Die durchschnittliche Verbreitung konstante beläuft sich aus der Menge der Flugbahnen, die haben alle Filter Schritte bestanden und wurden hinzugefügt, Tabelle 2.</li>
</ol>

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<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57, 179-186 (2012).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).</li>
</ol>

Broad Institute können wählen, Patentanmeldungen, die Aspekte der hier vorgestellten Arbeit enthalten.

Beim Umschalten von der traditionellen zweistufigen Deckglas Funktionalisierung Reaktion Protokoll auf eine einstufige Reaktion Protokoll, bemerkten wir, dass die Zuverlässigkeit des Deckglases Funktionalisierung deutlich verbessert wird. Wie die praktische Gesamtzeit für Deckglas Vorbereitung weniger als 30 min ist, empfehlen wir bereitet frische Deckgläsern jeden Tag Einzelmolekül-Bildgebung geplant ist. Um die Verschlechterung von Silan-PEG-Biotin zu minimieren, sollte das Reagenz regelmÄÑig und abgelegt unter N2 Trockengas bei-20 ° C nach Erhalt. Hier verwenden wir keine PEG-Moleküle, die produzieren -COO– oder -CH3 terminal Gruppen, die in den letzten20verwendet wurden. Die negativen Ladungen von -COO– und die hydrophoben -CH3 Gruppen wurden genutzt, um unspezifische Adsorption von DNA-Molekülen und spezifische Proteinproben bzw. an die Oberfläche zu verhindern. Wir beobachten sehr geringe Oberfläche Adsorption von kleinen Peptid Proben auf der Biotin-terminierte PEG Oberfläche, während Silan-PEG-COOH und/oder Silan-PEG-CH3 für Tests von bestimmten Proteinproben nützlich sein könnte oder wenn Bedingungen Test (z.B. pH &#60; 7,5) Förderung der DNA-Oberflächen-Wechselwirkungen.
Die Verlagerung von Glas-Folie-Durchflusszellen PDMS Flow Zellen beschleunigt den Fluss Zelle-Bau und ermöglicht die einfache Integration von mehreren Kanälen. Oft konstruieren wir acht Kanäle pro Durchflusszelle acht unabhängige Experimenten pro funktionalisierten Deckglas zu ermöglichen. Durchsatz pro Deckglas weiter zu steigern, könnte sogar größere Anzahl von Mikro-fabrizierten Kanäle verwendet werden.
Es ist ratsam, zu verhindern, dass Luft Blasenbildung im Inneren des Kanals zu jedem Zeitpunkt nach der Erstbefüllung. Luftblasen verursachen in der Regel keinen Verlust der gefesselte DNAs (obwohl dies möglich ist), sondern eher Fluss gestört und möglicherweise verursachen DNAs an das Deckglas halten. Puffer Entgasung und die Zugabe von kleinen Tensid Mengen sind in der Regel wirksam verhindern Blasenbildung innerhalb der Schläuche und Flow-Kanal. Versuchen Sie in Fällen, wo Luftblasen in das Rohr eingeführt werden, die Bläschen unter eine langsame Strömung durchspülen und stellen Sie sicher, dass sie nicht durch die Region fließen wo DNAs angebunden sind.
Eine schlanke und effiziente Datenanalyse-Software ist von entscheidender Bedeutung, durch die riesige Menge an Daten generiert. Wir sammeln in der Regel 700.000 hochauflösende Bilder von Messungen auf einer Messzelle, die unsere benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software innerhalb eines Tages auf einem Desktop-Computer mit einem Quadcore-Prozessor und 32 Gb Speicher verarbeitet werden können. False-positive-Rate 1D Verbreitung Flugbahnen von der Software (Schritt 5.5) zu erkennen ist Probe abhängig und kann ziemlich niedrig da: 1) die Dichte der einzelnen Partikel in das Blickfeld ist niedrig genug, so dass es etwas Mehrdeutigkeit Teilchen ganz Frames (verbindet Proteinproben sind im Allgemeinen anfälliger für unspezifische Adsorption auf das Deckglas als Peptid Proben, und somit der Puffer und die Leistungsdichte für jedes Protein probieren muss optimiert werden); (2) das Signal Rauschabstand von einzelnen Partikeln ist hoch genug, so dass die Wahrscheinlichkeit falsch-Identifikation der Partikel gering ist. Doch die Software kann gelegentlich Fehler machen, und wir empfehlen manuelle Inspektion der Daten mit dem mitgelieferten GUI zur Bewertung der Softwareleistung. In einer Anwendung, die besonders empfindlich auf falsch-Positive Flugbahn Erkennung Prozess-Parameter einschließlich der Schwellenwert, MinFrames, MinTriplets und Chi2_stat stringenter auf Kosten der geringeren Empfindlichkeit für wahre Bindung einstellbar Veranstaltungen und potenziell höhere statistische Verzerrungen bei der Flugbahn Identifikation. Wir hier teilen und unsere Einzelkorn-Tracking-Software mit der Hoffnung auf Hilfe für Daten-Analyse-Methoden zu standardisieren und zur Diskussion über best Practices zu beschreiben.
In unserem Protokoll, die kontinuierlichen Fluss erfordert während der Bildgebung um den gestreckten Zustand der DNA Schablone Moleküle zu erhalten, könnte der Flüssigkeitsströmung den Transport einiger Proteine entlang DNA-Templates bias, wenn sie durch einen hopping-Mechanismus diffundieren oder der hydrodynamischen Radius der beschrifteten Fluorophor ist große22,23. Während solche Vorurteile gemessen und in die meisten Datensätze korrigiert werden kann, der Transport von Proteinen mit einer kleinen Fluorophore beschriftet und Verbreitung durch einen Schiebemechanismus ist nicht in der Regel voreingenommen nachweisbar Maße von Flow2,4, 24. Insbesondere wurde die Auswirkungen der Strömungsgeschwindigkeit auf den Transport von Proteinen entlang DNA verwendet, die Mechanismen der Verbreitung entlang DNA23Protein zu studieren. A eng im Zusammenhang mit alternativer Ansatz, die es Messungen in Ermangelung des Flusses ermöglicht nutzt DNA-Templates mit Biotin an beiden Termini, die vorübergehend im Fluss gestreckt sind und angebunden durch beide Enden auf dem Deckglas so, dass die DNA-Moleküle bleiben ein Erweiterte Konfiguration25,26,27,28der Strom ausgeschaltet ist. Die Doppel-Tether-Methode hat den Vorteil, dass strömungsfreien Transport Experimente aber erfordert eine Änderung der beiden Enden der DNA-Vorlage Moleküle, sorgfältige Flusssteuerung in Anbindehaltung und charakterisieren die Abstände zwischen den beiden Standorten angebunden. Darüber hinaus muss die Auswirkungen der heterogenen Spannungen und DNA Konformationsänderungen Dynamik über DNA-Moleküle auf der Einzelmolekül-Assay bewertet werden.
Insgesamt neben dem Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA, als berichtet Einzelmolekül-Assay profitieren viele in-vitro- biochemischen und biophysikalische Studien Ebene einschließlich DNA Einzelmolekül Ziel Suchprozesse durch Proteine, enzymatischen Aktivitäten auf DNA und mehr.
Fehlerbehebung
Problem 1: Die Strömungskanäle auslaufen.
Lösung: Stellen Sie zunächst sicher, dass die Gestaltung der Strömungskanäle mindestens 1,5 mm Rand zur Abdichtung rund um und zwischen den Kanälen ermöglicht; und dann, während der Montage der Messzelle, stellen Sie sicher, dass Kontaktflächen zwischen dem Deckglas, Doppel-Klebeband und PDMS-Platte sind flach, trocken und frei von Schmutz, dass der Druck angewendet, um die Dichtung zu bilden einheitliche, und der Schweißvorgang wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
Problem 2: Die Dichte der gefesselte DNAs ist zu niedrig.
Lösung: Dieses Problem entsteht, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist oder die DNA-Moleküle sind nicht mit Biotin funktionalisiert. Aus unserer Erfahrung, die Dichte der gefesselte DNA sollte so hoch für &#62; 90 % von den Deckgläsern zubereitet aus frischen oder Silan-PEG-Biotin Reagens ordnungsgemäß gelagert. In Fällen wenn die Dichte der gefesselte DNA mit einem bewährten Batch von Biotin-λ-DNA niedrig ist, versuchen Sie, Steigerung der Konzentration von Silan-PEG-Biotin während PEG Funktionalisierung und Konzentrationen von Streptavidin und Biotin-λ-DNA während DNA Anbindehaltung. Wenn dies fehlschlägt, ersetzen Sie die PEG und Streptavidin Reagenzien.
Problem 3: DNAs halten Sie sich an das Deckglas eind kann nicht durch Strömung gedehnt werden.
Lösung: Dieses Problem kann auch entstehen, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist und wird durch niedrige Assay pH verschärft. Versuchen Sie fließt in mehr BSA oder Erhöhung des pH-Werts (zB auf 8.0) zu helfen, DNA-Adsorption an der Oberfläche (Schritt 4.3.2) zu unterdrücken. Wenn DNA-Adsorption eine anhaltende Problem unter einer bestimmten Assay-Bedingung ist, versuchen Sie auch bis zu 90 % Silan-PEG-COOH während PEG Funktionalisierung.
Daten-Analyse-Hinweise:
Wir verwenden benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software, um Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA, von identifizieren die ihre 1D Verbreitung konstanten, D1 geschätzt. Um die Datenanalyse zu verbessern, haben wir die radiale Symmetrie Algorithmus18 zur Lokalisierung der Partikel und der Kovarianz-basiertes Kalkulationstool19 für die Schätzung der 1D Verbreitung konstanten, die Datenanalyse ohne dramatisch beschleunigt Genauigkeit. Wir zuvor validiert die Individualsoftware durch die Analyse von simulierten Daten11. Die wichtigsten Schritte sind nachfolgend beschrieben.
Teilchenidentifikation:
Dieser Schritt ist für die Erkennung und Segmentierung Partikel - Beugung begrenzte Flecken - Hintergrund. Erstens räumlich Bandpass-filtern die Bilder verbessern das Signal von Partikeln im 3-5 Pixelbereich (entspricht der Größe der Point-Spread Funktion in unserem System) und dann Schwelle anhand der Intensität (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).
Schwerpunkt-Zuordnung
Segmentierung des Bildes lokalisiert nur Moleküle auf Pixel-Ebene räumliche Auflösung. Um Moleküle zu viel höhere Präzision zu lokalisieren, beschäftigen Sie die radiale Symmetrie Superresolution Algorithmus18 Bilder gefiltert wie oben beschrieben. (Diese Methode basiert auf einer analytischen Berechnung und rechnerische Belastung im Vergleich zu anderen beliebten präzise Methoden wie 2D "glockenförmig" Montage erheblich reduziert (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Particle tracking:
Um die Flugbahn eines Teilchens durch die Zeit zu verfolgen, müssen wir die gleichen Partikel wieder erkennen, wie sie zwischen den Rahmen bewegen. Wir betrachten die Einleitung, blinken und Beendigung Stadien Komponenten eine Flugbahn. Wir beschränken die Verknüpfung der Partikel im aktuellen Frames für diejenigen, die in vorherigen Frames durch die maximale Verschiebung erlaubt pro Frame. In Fällen wo mehrere Verbindungen möglich sind, der Jonker-Volgenant-Algorithmus wird verwendet, um Global optimale Verknüpfung Sätze ergeben (siehe Skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1-Einschätzung:
Um D1-Werte von Trajektorien abschätzen zu können, verwenden wir die Kovarianz-basierten Schätzer (CVE)19. Basierend auf eine analytische Berechnung, diese Methode ist mehr rechnerisch effizient und statistisch strenger als andere gängigen Methoden wie die Rückbildung der mittleren quadratischen Verschiebungen (siehe Skript: runspt5_SD.m).
Flugbahn zu filtern:
Einige Bahnen Artefakte wie Anbindung an Oberfläche gebundene Moleküle enthalten und müssen entfernt werden. Wir implementiert verschiedene Funktionen wie minimale Verschiebung parallel zur DNA, maximale Verschiebung quer zur DNA, minimale Länge der Flugbahn, minimale Anzahl von Triolen in Folge erkannt Positionen und minimale Wahrscheinlichkeitsergebnis (siehe Xiong Et al.,11 Definition), kann gefiltert werden, um einen minimal voreingenommene Satz von Trajektorien Moleküle diffundieren auf DNA dar zu isolieren (siehe Skript: sptViewFig2_update3x.m).

Ein altes Problem in der Biologie ist wie körpereigene Proteine, die auf spezifische Handeln stellen im Genom finden ihre DNA Ziele schnell genug für den Organismus zu überleben und wirksam auf seine Umwelt reagieren. Studien in den vergangenen vierzig Jahren vorgeschlagen und weitgehend Unterstützung, die die Hypothese, dass die Kinetik der DNA durch ein Protein Suche gezielt durch beschleunigt werden kann erleichterte Diffusion, in dem das Protein zwischen 3D Diffusion in der Masse und 1D Diffusion (einschließlich wechselt Rutschen und hüpfen Prozesse) entlang des DNA-1. Es ist nun bekannt, dass viele Proteine, die in der Genregulation, Nukleinsäure-Stoffwechsel und andere Prozesse in der Lage des Gleitens auf DNA-2,3,4,5,6,7 ,8,9. Neuere Studien berichtet darüber hinaus, dass sogar kleine Peptide binden an und schieben Sie auf DNA, mit der Fähigkeit, eine Ladung tragen können; zum Beispiel ein Eiweißmolekül oder PCR Primer entlang DNA-10,11,12,13,14.
In den letzten 15 Jahren hat Einzelmolekül Fluss-stretching Assay verbreitet, Bindung und Diffusion von Molekülen entlang DNA2,15,16zu studieren. Bei dieser Art des Tests, Biotinylierte doppelsträngige DNA-Moleküle auf der Oberfläche immobilisiert sind und eine laminare Strömung gilt für Durchfluss dehnen die DNA. Die &#62; 80 % gedehnt DNAs dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Untersuchung von Bindung und Transport Aktivität von Molekülen mit Fluorophore beschriftet wo werden die Bahnen der einzelnen Moleküle entlang DNA durch Time-Lapse Fluoreszenz-Bildgebung verfolgt. In unserer Implementierung optimiert hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit, dieser Test besteht aus fünf Hauptschritte: Vorbereitung der Biotin-λ-DNA, Deckglas Funktionalisierung, Flow Zelle Bau, Fluoreszenz-Bildgebung und Datenanalyse. In früheren Protokollen17waren Glasdeckgläser funktionalisiert durch erste reagierenden mit (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) und dann mit Amin-reaktive Polyethylenglykol (PEG) Reagenzien (z. B. NHS-PEG-Biotin) um eine PEG Schicht bilden, die widersteht unspezifische Adsorption von Assay-Komponenten auf dem Deckglas Oberfläche. Die Qualität der funktionalisierter Deckgläsern hing weitgehend von der Qualität der PEG Reagenzien und Reaktionsbedingungen bei jedem Schritt. Unser Protokoll beschreibt eine vereinfachte Funktionalisierung Protokoll und Multiplex-Flow Zelle Konstruktion erfordert keine flüssigen Klebstoff oder Aushärtungszeit auf die Tag-Durchflusszellen montiert. Wir beschreiben auch eine schlanke und robuste Daten Analyse Verfahren11 , die rechenintensive Regression Schritte beseitigt durch die Anwendung einer radiale Symmetrie-Methode für Zentroid Lokalisierung18 und eine Kovarianz-basierte diffusion konstante Schätzer19.
Hier berichten wir eine einfache, robuste und Hochdurchsatz-Molekül fließen stretching Assay-Umsetzung mit signifikanten Verbesserungen im Deckglas Funktionalisierung, Flow-Zelle-Bau und Datenanalyse. Unter anderem entwickelten wir eine einstufige Deckglas Funktionalisierung Protokoll, in dem sauberen und trockenen Deckgläsern direkt mit Silan-PEG-Biotin reagieren. Dieses Protokoll vereinfacht die Vorbereitung Deckglas und verbessert die Zuverlässigkeit der Qualität der funktionalisierten Oberflächen im Vergleich zu den standard zweistufige Reaktion Protokoll. Wir beschreiben die Verwendung von so funktionalisiert Deckgläsern mit Mehrkanal PDMS Durchflusszellen, die robuste Schlauchverbindungen erfolgen ohne Leim zu ermöglichen. Diese Durchflusszellen weiter gehören mehrere computergesteuerte Einlässe für jede Kammer fließen die automatisierte Reagenz Stromfluss, Hands-on-Zeit während der Installation und erhöhte Assay Durchsatz zu verringern zu können.

<table><tbody><tr><td>Biotin-markiertes Oligo, 5'-AGGTCGCCGCCC(A)20-Biotin-3"</td><td>IDT</td><td>Kundenspezifische Oligosynthese</td><td>Standard-Entsalzungsreinigung ist ausreichend</td></tr><tr><td>&lambda;-DNA</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N3011S</td><td>Herstellung von Aliquoten und Minimierung der Gefrier-Tau-Zyklusnummer</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase und Ligationsreaktionspuffer</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Zentrifugalfilterrohre mit NMWL von 100k Dalton</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510008</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 1 Glasdeckgläser</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Reines Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-186</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid-Pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger, Modell-Nr. PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silan-peg-biotin</td><td>Nanocs</td><td>PG2-BNSL-5k</td><td>Lager bei -20<o/sup>C in trockenem Stickstoffgas</td></tr><tr><td>Eine CAD-Software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD</td><td></td></tr><tr><td>Doppelklebeband</td><td>Klebeanwendungen</td><td>8512-2-DP/DL</td><td></td></tr><tr><td>Bandschneider, Modell-Nr. CE5000-40-CRP</td><td>Graphtec America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS und Vernetzungsreagenzkit</td><td>R.S. Hughes</td><td>RTV615 CLEAR 010</td><td></td></tr><tr><td>Entgasungskammer, Modell-Nr. F42010-0000</td><td>BEL-ART Produkte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mischer, Modell-Nr. ARV-310</td><td>Thinky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Locher, Harris Uni-Cores, Größe 0,5 mm</td><td>Harris Uni-Cores</td><td></td><td>Dies kann durch einen manuellen Biopsie-Stanzer mit einer ähnlichen Nadelstärke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06420-02</td><td>0,020" ID, 0,060"</td></tr><tr><td>OD Peek Schlauch</td><td>Western Analytical</td><td>PK007-031-Y</td><td>0,007" ID, 0,031"</td></tr><tr><td>OD Streptavidin</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N7021S</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Orange Nukleinsäure-Färbung</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop, Kamera, Objektiv, dichroitischer Spiegel und Bandpassfilter können durch ähnliche Geräte ersetzt werden</td></tr><tr><td>100x Objektiv, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMOS Kamera</td><td>Hammamatsu</td><td>Orca Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitisch Spiegel</td><td>Semrock</td><td>FF560/659-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-577/690-25</td><td></td></tr><tr><td>532 nm Laser</td><td>Rayscience Innovation Limited, Shanghai</td><td>OEMLL-FN-532nm-C</td><td>Wählen Sie die Wellenlänge, um der Färbung Ihrer Wahl zu entsprechen</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Chemxy</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>TMR-KRRR, >=85% Reinheit</td><td>MIT Biopolymer Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pVIc-Cy3B, HPLC gereinigt</td><td>Ein Geschenk von Dr. Walter Mangel aus dem Brookhaven National Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skript-Programmiersoftware</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>* siehe Teileliste für Magnetventile, Computerschnittstelle und Montageanleitung unter: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einfach, robust und hohen durchsatz molekül fließen stretching assay-implementierung für das studium transport von molekülen entlang dna

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Wir beschreiben einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA. In diesem Test sind Glasdeckgläser in eine einstufige Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Durchflusszellen entstehen durch ein Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen einem funktionalisierten Deckgläschen und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen sandwiching. Mehrere Kanäle in einer Messzelle integriert sind und die Strömung von Reagenzien in jedem Kanal kann vollständig automatisiert werden, die deutlich erhöht den Durchsatz Assay und Hands-on-Zeit pro Assay reduziert. In jedem Kanal Biotin-λ-DNA sind auf der Oberfläche immobilisiert und eine laminare Strömung wird angewendet, um Fluss-die DNAs Stretch. Die DNA-Moleküle werden gedehnt &#62; 80 % ihrer Kontur Länge und dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu studieren. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse Total interne Reflexion Fluoreszenz (TIRF) Bildgebung. RAW-Bilder werden analysiert, optimierte benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software verwenden, um automatisch Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen ihre 1D-Diffusion-Konstanten.

Abbildung 2a zeigt die erkannten Flugbahnen der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle diffundieren auf DNA in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. Die Verbreitung von pVIc ist Bi-direktional und getrieben von ambient Wärmeenergie. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten (D1-Werte) für jede Trajektorie geschätzt (siehe das Histogramm in Abbildung 2 b). Der Mittelwert D1 Wert dieser pVIc Konjugat ist sein 22,2 ± 0,9 (Standardfehler) M (bp2/s) von durchschnittlich jeder D1-Wert über Flugbahnen gewichtet nach der Anzahl der Triplett aufeinander folgende Position Forderungen in jeder Bahn berechnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Vorrichtung zum Verfolgen von Bewegung der einzelnen Moleküle entlang DNA. (a) eine achtkanalige PDMS Mikrofluidik-Chip eingehalten einem funktionalisierten Deckgläschen auf die DNA kann angebunden werden, (mit USA Viertel für Skala Münze); (b) fließen Sie Zelle Zoom Schaltplan zeigt Fluss-gestreckten λ-DNA-Moleküle; (c) schematische Darstellung der TIRF Mikroskop und Flutsystem zur Dehnung DNA; (d) TIRF Bild der Flow-gestreckten λ-DNA; (e) TIRF Bild der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle gebunden an einen Fluss gestreckt λ-DNA. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis2,12geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Eindimensionale Diffusion von pVIc (GVQSLKRRRCF) entlang DNA. (a). Verbreitung der pVIc entlang erstreckte sich λ-DNA (137 Trajektorien) in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. x(t) und y(t) sind die Verschiebungen entlang und quer zur λ-DNA. Gepunktete horizontale Linien zeigen fehlende Punkte aus Farbstoff zu blinken. (b). Histogramm der Diffusion Konstante, D1 für pVIc diffundieren entlang λ-DNA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll zeigt einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium eindimensionale (1D) Diffusion von Molekülen entlang DNA.

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen einfachen, robusten und hochdurchsatzfähigen Einzelmolekül-Fluss-Streckversuch zur Untersuchung des Transports von Molekülen entlang der DNA aufzubauen. Dies wird zunächst erreicht, indem biotinmarkierte Lambda-DNA hergestellt wird, indem ein biotinmarkiertes Oligo an die Lambda-DNA ligiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, mit Polyethylenglykol (PEG) funktionalisierte Deckgläser nach einer Ein-Schritt-Reaktionsanleitung herzustellen.Anschließend wird eine Hochdurchsatz-Flusszelle hergestellt, indem ein doppelseitiges Klebeband mit vorpräparierten Kanälen zwischen einer PEG-funktionalisierten Deckglasplatte und einer Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Platte mit Einlass- und Auslassöffnungen eingeschlossen wird. Im letzten Schritt werden die Trajektorien einzelner fluoreszierender Moleküle im Flusskanal mithilfe von zeitraffender Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie oder TIRF-Bildgebung verfolgt. Um die Trajektorien einzelner Moleküle zu identifizieren, die entlang von im Fluss gestreckter Lambda-DNA diffundieren, kommt eine zuverlässige und effiziente, eigens entwickelte Software zur Einzelpartikel-Verfolgung zur Analyse der rohen Fluoreszenzbilder zum Einsatz.Die wichtigsten Vorteile dieser Assay-Konfiguration gegenüber Alternativen sind die Zuverlässigkeit der Deckgläserherstellung, die höhere Durchsatzkapazität, die reduzierte manuelle Arbeitszeit für die Probenvorbereitung und eine effizientere, unbeaufsichtigte Datenanalyse. Die Durchführung des Verfahrens wird ein Postdoktorand in meinem Labor, Dr. Kan Xiong, demonstrieren. Bevor Sie mit diesem Assay beginnen, bereiten Sie alle erforderlichen Reagenzien gemäß dem Protokolltext vor.Erhitzen Sie den Lambda-DNA-Standard mit 0,5 Milligramm pro Milliliter auf 65 Grad Celsius für 60 Sekunden und geben Sie ihn anschließend sofort in nasses Eis. Mischen Sie 100 Mikroliter der Lambda-DNA-Lösung mit zwei Mikrolitern eines 10 Mikromolar-Biotin-markierten Oligos in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Erhitzen Sie das Gemisch auf 65 Grad Celsius für 60 Sekunden und kühlen Sie es dann langsam auf Raumtemperatur ab.Stellen Sie die Mischung auf Eis. Geben Sie 11 Mikroliter T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig. Anschließend zwei Mikroliter, entsprechend 800 Einheiten T4-DNA-Ligase, hinzufügen und erneut vorsichtig mischen.Die Mischung zwei Stunden bei 16 Grad Celsius oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Das Produkt mithilfe von Zentrifugalfilterröhrchen mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton reinigen. Nummer-eins-Deckgläser in einem Färbegefäß 10 Minuten lang in 95 %igem Ethanol beschallen und anschließend dreimal mit ultrareinem Wasser spülen.Füllen Sie das Färbegefäß mit einmolarer Kaliumhydroxidlösung, beschallen Sie erneut 10 Minuten lang und spülen Sie anschließend dreimal mit ultrareinem Wasser. Wiederholen Sie diesen Zyklus zweimal. Trocknen Sie die Deckgläser unter einem Strom von sauberem, trockenem Stickstoffgas.Reinigen und trocknen Sie die Deckgläser anschließend durch eine Luft-Plasmabehandlung bei einem Druck von 900 Millitorr für fünf Minuten. Inkubieren Sie die Deckgläser mit 50 Mikroliter einer 25 Milligramm pro Milliliter Silan-Polyethylenglykol-Biotin-Lösung in 95 %igem Ethanol bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Entfernen Sie überschüssiges Polyethylenglykol mit ultrareinem Wasser und trocknen Sie die mit Polyethylenglykol beschichteten Deckgläser unter einem Strom von sauberem, trockenem Stickstoffgas. Entwerfen Sie Strömungskanäle mithilfe einer CAD-Software und schneiden Sie die Kanäle mit einem Bandcutter in ein doppelseitiges Klebeband ein. Entfernen Sie Klebebandreste innerhalb der Kanäle. Um PDMS-Platten herzustellen, mischen Sie gründlich 45 Gramm PDMS mit fünf Gramm Vernetzungsreagenz mithilfe eines Mischers.Geben Sie die Mischung in zwei 100-Millimeter-Petri-Schalen und lassen Sie die Schalen etwa 30 Minuten lang in einer Vakuumkammer, bis alle Luftblasen verschwunden sind. Stellen Sie die Schalen für etwa zwei Stunden in einen 80-Grad-Celsius-Ofen, bis das PDMS erstarrt ist. Schneiden Sie eine PDMS-Platte aus, die der Größe des beidseitigen Klebebands mit vorgeschnittenen Kanälen entspricht.Entfernen Sie eine Schutzfolie vom doppelseitigen Klebeband und befestigen Sie es an einer flachen Seite des PDMS-Blocks. Stanzen Sie mit einem Biopsie-Lochstecher und einer 23-Gauge-Nadel Einlass- und Auslassöffnungen in den PDMS-Block. Entfernen Sie die andere Schutzfolie vom doppelseitigen Klebeband und befestigen Sie es auf der funktionalisierten Oberfläche der Deckglasplatte.Befestigen Sie die montierte Durchflusszelle auf einem Mikroskopstadiums-Insert. Füllen Sie alle vorher entgaste Reagenzien in Reservoire, die mit einem Tygon-Schlauch verbunden sind, der an ein Magnetventil angeschlossen ist, sowie mit einem weiteren Schlauch, der an ein PEEK-Rohr angeschlossen ist, um das Zurückfließen der Reagenzien zu verhindern. Der Fluss der Reagenzien wird durch Magnetventile gesteuert, die wiederum über eine skriptbasierte Programmieranwendung gesteuert werden.Beaufschlagen Sie einen Flusskanal mit Puffer ohne Zusatzstoffe, um ihn zu primieren. Führen Sie drei andere PEEK-Schläuche in die Einlassöffnungen ein. Achten Sie darauf, keine Luftblasenbildung innerhalb des Kanals zu verursachen.Verbinden Sie einen Tygon-Schlauch mit einem kurzen PEEK-Schlauch von der Auslassöffnung zu einem Abfallbehälter für Proben. Leiten Sie eine Streptavidin-Lösung mit 0,2 Milligramm pro Milliliter durch und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Anschließend spülen Sie nicht gebundenes Streptavidin mit Puffer ohne Zusatz durch.Ein Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin-Lösung durchströmen lassen und eine Minute inkubieren. Anschließend Puffer ohne Zusatz durchströmen, um nicht gebundenes Rinderserumalbumin auszuwaschen. 100 Pikomolar Biotin-Lambda-DNA-Lösung durchströmen und 10 Minuten inkubieren.Danach Spülpuffer durchströmen lassen, um nicht gebundene Lambda-DNAs zu entfernen. Um die Qualität der PEG-funktionallisierten Deckgläser zu überprüfen, ein DNA-Färbe-Farbstoff wie SYTOX Orange-Farbstoff durchströmen lassen und mit der Fluoreszenzbildgebung beginnen. Wenn die Qualität des Deckglases gut ist, wird die Dichte der im Durchfluss gestreckten Lambda-DNAs hoch sein.Stellen Sie außerdem den TIRF-Winkel so ein, dass das höchste Signal-Rausch-Verhältnis bei Bildern nahezu vollständig flussgestreckter Lambda-DNA erreicht wird. Um die Bahnen einzelner Moleküle zu verfolgen, beginnen Sie die Inkubation innerhalb eines neuen Kanals, führen dann subnanomolare, mit Fluorophor markierte Moleküle mit einer ausreichend hohen Flussrate mittels einer Spritzenpumpe zu und nehmen zeitraffergeschaltete Fluoreszenzbilder mit einer Bildrate von 100 Hertz auf. Typischerweise werden 10.000 Bilder pro Bildfeld aufgenommen, wobei Filme aus mehreren Bildfeldern erstellt werden.Am Ende wird erneut DNA-Färbe-Farbstoff durchströmt, um zu bestätigen, dass die DNA weiterhin gestreckt werden kann. Eine benutzerdefinierte Einzelpartikel-Verfolgungssoftware wird verwendet, um die Trajektorien einzelner Moleküle, die entlang der DNA diffundieren, zu identifizieren. Die Software bestimmt zunächst mit hoher Genauigkeit die Schwerpunktpositionen einzelner Partikel.Entfernen Sie Partikel, die auf der Deckglasoberfläche haften, und verknüpfen Sie anschließend Partikel in verschiedenen Einzelbildern, um Zeitrafferaufnahmen mit Trajektorien zu erstellen. Aus diesen Trajektorien werden die eindimensionalen Diffusionskoeffizienten geschätzt. Um die Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie eine Anwendung zur Skriptprogrammierung und navigieren Sie zum Verzeichnis der Einzelpartikel-Verfolgungssoftware.Öffnen Sie ein Skript mit dem Namen largedataprocess3.m. Ein wichtiger Parameter, der definiert werden muss, ist der Schwellenwert für die Einzelpartikelerkennung. Um den optimalen Schwellenwert zu bestimmen, führen Sie determine_threshold_value aus.m-Skript. Dieses Skript veranschaulicht, wie sich der Schwellwert auf die Einzelpartikelerkennung auswirkt. Nachdem der optimale Schwellwert bestimmt wurde, führen Sie das Largedataprocess3-Skript aus.m-Skript. Nach Abschluss der Einzelpartikel-Verfolgungsanalyse werden die rohen Trajektorien gefiltert, indem das trajectory_filtering.m-Skript ausgeführt wird.Es wird eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) zur Visualisierung des Filterungsschritts erstellt. Legen Sie auf dem GUI-Panel die minimale Verschiebung entlang der DNA, MinXDisp, auf zwei Pixel fest. Stellen Sie die maximale Verschiebung quer zur DNA, MaxYDisp, auf zwei Pixel ein.Stellen Sie die minimale Anzahl von Einzelbildern, minFrames, auf 10 ein. Stellen Sie die minimale Anzahl von Triplett-Zuständen, minTriplets, auf 10 ein. Legen Sie die minimale Diffusionskonstante entlang der DNA, D_par, auf null fest.Stellen Sie die maximale geschätzte Diffusionskonstante quer zur DNA, D_trans, auf 10 Megabasenpaare pro Sekunde ein. Stellen Sie den minimalen statistischen Parameter, Chi2 Stat, auf minus fünf ein. Stellen Sie das minimale Verhältnis der Verschiebung entlang der DNA zu der quer zur DNA, MinX/Y, auf zwei ein.Alle Rohdaten der Trajektorien, die diese Filterparameter erfüllen, werden in Tabelle eins aufgelistet, während diejenigen, die sie nicht erfüllen, in Tabelle drei aufgeführt werden. Klicken Sie auf eine Trajektoriennummer in Tabelle eins. Die Trajektorie wird in Grafik eins und zwei angezeigt.Klicken Sie auf die Wiedergabetaste, um die rohen Fluoreszenzbilder abzuspielen. Klicken Sie auf „Zu Tabelle 2 hinzufügen“, wenn es sich bei dieser Trajektorie um eine Einzelmolekül-Gleittrajektorie handelt. Am Ende werden alle Trajektorien, die Tabelle 2 hinzugefügt wurden, beim Schließen der Benutzeroberfläche gespeichert.Die Trajektorien, die alle Filterungsschritte durchlaufen haben, werden zusammengefasst, um daraus die mittlere Diffusionskonstante zu schätzen. Um die mittleren Diffusionskonstanten zu berechnen, führen Sie einfach das Skript calculate_mean_diffusion_constant.m aus. Dieses Verfahren wird vielen Personen zugutekommen, die in der Einzelmolekül-Biophysik in vitro forschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine ​​des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Wir veranschaulichen die Verwendung eines axialen optischen Pinzetten-Systems mit konstanter Kraft, um die mechanischen Eigenschaften kurzer DNA-Moleküle zu untersuchen. Durch axiales Dehnen der DNA minimieren wir sterische Behinderungen und Artefakte, die bei herkömmlicher lateraler Manipulation auftreten, und können so DNA-Moleküle von etwa 100 nm Länge untersuchen.

Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Diese Studie stellt eine detaillierte experimentelle Verfahren zur Looping Dynamik der Doppelstrang-DNA mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu messen. Das Protokoll beschreibt auch, wie die Looping-Wahrscheinlichkeitsdichte genannt J-Faktor zu extrahieren.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Wir präsentieren einen Ansatz zur Visualisierung von fluoreszierenden Protein-DNA-bindenden Peptiden (FP-DBP)-gefärbten großen DNA-Molekülen, die an die Polyethylenglykol- (PEG) und Avidin-beschichtete Glasoberfläche gebunden und mit mikrofluidischen Scherströmungen gedehnt werden.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung der einmolekularen Förster-Resonanzenergieübertragung zur Untersuchung der HJ-Auflösung vorgestellt. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wird eine zweifarbige Wechselanregung verwendet. Einfarbigezeitraffe smFRET wird dann in Echtzeit-Spaltungstests angewendet, um die Verweilzeitverteilung vor hj-Auflösung zu erhalten.

Ein-Molekül Förster Resonanz Energietransfermethoden für Die Echtzeit-Untersuchung der Holliday Junction Resolution von GEN1

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Diese Methode misst die Neigung einer Zelle, ligandenpräsentierende immobilisierte DNA-Duplexen zu brechen, um relative zelluläre Traktionskräfte zu melden. Rupturierte fluoreszierende Oligos werden in die Zelle eingebracht und durch Durchflusszytometrie analysiert, wobei die mechanische Geschichte der Zelle aufgezeichnet wird. Dies ermöglicht die Hochdurchsatzmessung der zellulären Krafterzeugung im Rahmen der zellulären Mechanophänotypisierung.

Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen

Lernen Sie einen robusten Hochdurchsatz-Fluss-Streckungs-Assay zur Untersuchung der eindimensionalen Diffusion von Molekülen entlang DNA. Diese Methode nutzt TIRF-Bildgebung und biotin-markierte Lambda-DNA.

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA (Video) | JoVE Journal

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

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