Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen einfachen, robusten und hochdurchsatzfähigen Einzelmolekül-Fluss-Streckversuch zur Untersuchung des Transports von Molekülen entlang der DNA aufzubauen. Dies wird zunächst erreicht, indem biotinmarkierte Lambda-DNA hergestellt wird, indem ein biotinmarkiertes Oligo an die Lambda-DNA ligiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, mit Polyethylenglykol (PEG) funktionalisierte Deckgläser nach einer Ein-Schritt-Reaktionsanleitung herzustellen.

Anschließend wird eine Hochdurchsatz-Flusszelle hergestellt, indem ein doppelseitiges Klebeband mit vorpräparierten Kanälen zwischen einer PEG-funktionalisierten Deckglasplatte und einer Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Platte mit Einlass- und Auslassöffnungen eingeschlossen wird. Im letzten Schritt werden die Trajektorien einzelner fluoreszierender Moleküle im Flusskanal mithilfe von zeitraffender Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie oder TIRF-Bildgebung verfolgt. Um die Trajektorien einzelner Moleküle zu identifizieren, die entlang von im Fluss gestreckter Lambda-DNA diffundieren, kommt eine zuverlässige und effiziente, eigens entwickelte Software zur Einzelpartikel-Verfolgung zur Analyse der rohen Fluoreszenzbilder zum Einsatz.

Die wichtigsten Vorteile dieser Assay-Konfiguration gegenüber Alternativen sind die Zuverlässigkeit der Deckgläserherstellung, die höhere Durchsatzkapazität, die reduzierte manuelle Arbeitszeit für die Probenvorbereitung und eine effizientere, unbeaufsichtigte Datenanalyse. Die Durchführung des Verfahrens wird ein Postdoktorand in meinem Labor, Dr. Kan Xiong, demonstrieren. Bevor Sie mit diesem Assay beginnen, bereiten Sie alle erforderlichen Reagenzien gemäß dem Protokolltext vor.

Erhitzen Sie den Lambda-DNA-Standard mit 0,5 Milligramm pro Milliliter auf 65 Grad Celsius für 60 Sekunden und geben Sie ihn anschließend sofort in nasses Eis. Mischen Sie 100 Mikroliter der Lambda-DNA-Lösung mit zwei Mikrolitern eines 10 Mikromolar-Biotin-markierten Oligos in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Erhitzen Sie das Gemisch auf 65 Grad Celsius für 60 Sekunden und kühlen Sie es dann langsam auf Raumtemperatur ab.

Stellen Sie die Mischung auf Eis. Geben Sie 11 Mikroliter T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig. Anschließend zwei Mikroliter, entsprechend 800 Einheiten T4-DNA-Ligase, hinzufügen und erneut vorsichtig mischen.

Die Mischung zwei Stunden bei 16 Grad Celsius oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Das Produkt mithilfe von Zentrifugalfilterröhrchen mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton reinigen. Nummer-eins-Deckgläser in einem Färbegefäß 10 Minuten lang in 95 %igem Ethanol beschallen und anschließend dreimal mit ultrareinem Wasser spülen.

Füllen Sie das Färbegefäß mit einmolarer Kaliumhydroxidlösung, beschallen Sie erneut 10 Minuten lang und spülen Sie anschließend dreimal mit ultrareinem Wasser. Wiederholen Sie diesen Zyklus zweimal. Trocknen Sie die Deckgläser unter einem Strom von sauberem, trockenem Stickstoffgas.

Reinigen und trocknen Sie die Deckgläser anschließend durch eine Luft-Plasmabehandlung bei einem Druck von 900 Millitorr für fünf Minuten. Inkubieren Sie die Deckgläser mit 50 Mikroliter einer 25 Milligramm pro Milliliter Silan-Polyethylenglykol-Biotin-Lösung in 95 %igem Ethanol bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Entfernen Sie überschüssiges Polyethylenglykol mit ultrareinem Wasser und trocknen Sie die mit Polyethylenglykol beschichteten Deckgläser unter einem Strom von sauberem, trockenem Stickstoffgas.

Entwerfen Sie Strömungskanäle mithilfe einer CAD-Software und schneiden Sie die Kanäle mit einem Bandcutter in ein doppelseitiges Klebeband ein. Entfernen Sie Klebebandreste innerhalb der Kanäle. Um PDMS-Platten herzustellen, mischen Sie gründlich 45 Gramm PDMS mit fünf Gramm Vernetzungsreagenz mithilfe eines Mischers.

Geben Sie die Mischung in zwei 100-Millimeter-Petri-Schalen und lassen Sie die Schalen etwa 30 Minuten lang in einer Vakuumkammer, bis alle Luftblasen verschwunden sind. Stellen Sie die Schalen für etwa zwei Stunden in einen 80-Grad-Celsius-Ofen, bis das PDMS erstarrt ist. Schneiden Sie eine PDMS-Platte aus, die der Größe des beidseitigen Klebebands mit vorgeschnittenen Kanälen entspricht.

Entfernen Sie eine Schutzfolie vom doppelseitigen Klebeband und befestigen Sie es an einer flachen Seite des PDMS-Blocks. Stanzen Sie mit einem Biopsie-Lochstecher und einer 23-Gauge-Nadel Einlass- und Auslassöffnungen in den PDMS-Block. Entfernen Sie die andere Schutzfolie vom doppelseitigen Klebeband und befestigen Sie es auf der funktionalisierten Oberfläche der Deckglasplatte.

Befestigen Sie die montierte Durchflusszelle auf einem Mikroskopstadiums-Insert. Füllen Sie alle vorher entgaste Reagenzien in Reservoire, die mit einem Tygon-Schlauch verbunden sind, der an ein Magnetventil angeschlossen ist, sowie mit einem weiteren Schlauch, der an ein PEEK-Rohr angeschlossen ist, um das Zurückfließen der Reagenzien zu verhindern. Der Fluss der Reagenzien wird durch Magnetventile gesteuert, die wiederum über eine skriptbasierte Programmieranwendung gesteuert werden.

Beaufschlagen Sie einen Flusskanal mit Puffer ohne Zusatzstoffe, um ihn zu primieren. Führen Sie drei andere PEEK-Schläuche in die Einlassöffnungen ein. Achten Sie darauf, keine Luftblasenbildung innerhalb des Kanals zu verursachen.

Verbinden Sie einen Tygon-Schlauch mit einem kurzen PEEK-Schlauch von der Auslassöffnung zu einem Abfallbehälter für Proben. Leiten Sie eine Streptavidin-Lösung mit 0,2 Milligramm pro Milliliter durch und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Anschließend spülen Sie nicht gebundenes Streptavidin mit Puffer ohne Zusatz durch.

Ein Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin-Lösung durchströmen lassen und eine Minute inkubieren. Anschließend Puffer ohne Zusatz durchströmen, um nicht gebundenes Rinderserumalbumin auszuwaschen. 100 Pikomolar Biotin-Lambda-DNA-Lösung durchströmen und 10 Minuten inkubieren.

Danach Spülpuffer durchströmen lassen, um nicht gebundene Lambda-DNAs zu entfernen. Um die Qualität der PEG-funktionallisierten Deckgläser zu überprüfen, ein DNA-Färbe-Farbstoff wie SYTOX Orange-Farbstoff durchströmen lassen und mit der Fluoreszenzbildgebung beginnen. Wenn die Qualität des Deckglases gut ist, wird die Dichte der im Durchfluss gestreckten Lambda-DNAs hoch sein.

Stellen Sie außerdem den TIRF-Winkel so ein, dass das höchste Signal-Rausch-Verhältnis bei Bildern nahezu vollständig flussgestreckter Lambda-DNA erreicht wird. Um die Bahnen einzelner Moleküle zu verfolgen, beginnen Sie die Inkubation innerhalb eines neuen Kanals, führen dann subnanomolare, mit Fluorophor markierte Moleküle mit einer ausreichend hohen Flussrate mittels einer Spritzenpumpe zu und nehmen zeitraffergeschaltete Fluoreszenzbilder mit einer Bildrate von 100 Hertz auf. Typischerweise werden 10.000 Bilder pro Bildfeld aufgenommen, wobei Filme aus mehreren Bildfeldern erstellt werden.

Am Ende wird erneut DNA-Färbe-Farbstoff durchströmt, um zu bestätigen, dass die DNA weiterhin gestreckt werden kann. Eine benutzerdefinierte Einzelpartikel-Verfolgungssoftware wird verwendet, um die Trajektorien einzelner Moleküle, die entlang der DNA diffundieren, zu identifizieren. Die Software bestimmt zunächst mit hoher Genauigkeit die Schwerpunktpositionen einzelner Partikel.

Entfernen Sie Partikel, die auf der Deckglasoberfläche haften, und verknüpfen Sie anschließend Partikel in verschiedenen Einzelbildern, um Zeitrafferaufnahmen mit Trajektorien zu erstellen. Aus diesen Trajektorien werden die eindimensionalen Diffusionskoeffizienten geschätzt. Um die Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie eine Anwendung zur Skriptprogrammierung und navigieren Sie zum Verzeichnis der Einzelpartikel-Verfolgungssoftware.

Öffnen Sie ein Skript mit dem Namen largedataprocess3.m. Ein wichtiger Parameter, der definiert werden muss, ist der Schwellenwert für die Einzelpartikelerkennung. Um den optimalen Schwellenwert zu bestimmen, führen Sie determine_threshold_value aus.

m-Skript. Dieses Skript veranschaulicht, wie sich der Schwellwert auf die Einzelpartikelerkennung auswirkt. Nachdem der optimale Schwellwert bestimmt wurde, führen Sie das Largedataprocess3-Skript aus.

m-Skript. Nach Abschluss der Einzelpartikel-Verfolgungsanalyse werden die rohen Trajektorien gefiltert, indem das trajectory_filtering.m-Skript ausgeführt wird.

Es wird eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) zur Visualisierung des Filterungsschritts erstellt. Legen Sie auf dem GUI-Panel die minimale Verschiebung entlang der DNA, MinXDisp, auf zwei Pixel fest. Stellen Sie die maximale Verschiebung quer zur DNA, MaxYDisp, auf zwei Pixel ein.

Stellen Sie die minimale Anzahl von Einzelbildern, minFrames, auf 10 ein. Stellen Sie die minimale Anzahl von Triplett-Zuständen, minTriplets, auf 10 ein. Legen Sie die minimale Diffusionskonstante entlang der DNA, D_par, auf null fest.

Stellen Sie die maximale geschätzte Diffusionskonstante quer zur DNA, D_trans, auf 10 Megabasenpaare pro Sekunde ein. Stellen Sie den minimalen statistischen Parameter, Chi2 Stat, auf minus fünf ein. Stellen Sie das minimale Verhältnis der Verschiebung entlang der DNA zu der quer zur DNA, MinX/Y, auf zwei ein.

Alle Rohdaten der Trajektorien, die diese Filterparameter erfüllen, werden in Tabelle eins aufgelistet, während diejenigen, die sie nicht erfüllen, in Tabelle drei aufgeführt werden. Klicken Sie auf eine Trajektoriennummer in Tabelle eins. Die Trajektorie wird in Grafik eins und zwei angezeigt.

Klicken Sie auf die Wiedergabetaste, um die rohen Fluoreszenzbilder abzuspielen. Klicken Sie auf „Zu Tabelle 2 hinzufügen“, wenn es sich bei dieser Trajektorie um eine Einzelmolekül-Gleittrajektorie handelt. Am Ende werden alle Trajektorien, die Tabelle 2 hinzugefügt wurden, beim Schließen der Benutzeroberfläche gespeichert.

Die Trajektorien, die alle Filterungsschritte durchlaufen haben, werden zusammengefasst, um daraus die mittlere Diffusionskonstante zu schätzen. Um die mittleren Diffusionskonstanten zu berechnen, führen Sie einfach das Skript calculate_mean_diffusion_constant.m aus. Dieses Verfahren wird vielen Personen zugutekommen, die in der Einzelmolekül-Biophysik in vitro forschen.