Peptid und Protein Quantifizierung mit Hilfe automatisierter Immuno-MALDI (iMALDI)

Das übergeordnete Ziel dieses automatisierten immuno-MALDI-Assays besteht darin, Peptide und intakte Proteine in komplexen biologischen Flüssigkeiten genau und empfindlich zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der quantitativen Proteomik zu beantworten, beispielsweise die Quantifizierung von Proteinspiegeln für die Diagnostik oder zur Überwachung der Reaktion eines Patienten auf eine Therapie. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt darin, dass sie Proteinspiegel aus komplexen Proben sehr empfindlich und genau quantifizieren kann.

Diese Technik ermöglicht die Diagnose von Krankheiten in einem frühen Stadium, da der Immunoanreicherungsschritt des Assays die Quantifizierung seltener vorkommender Protein- und Peptid-Biomarker erlaubt. Obwohl diese Methode Einblicke in die plasmatische Reninaktivität liefern kann, ist sie auch auf andere krankheitsbezogene Untersuchungen anwendbar, beispielsweise auf die Quantifizierung krebsrelevanter Proteine zur Prognose, Diagnose und Therapiemanagement. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Sie humane Plasma­proben fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf.

Danach die Proben auf Eis stellen, bis sie vollständig aufgetaut sind. Anschließend 200 Mikroliter jeder Plasma probe manuell in separate Vertiefungen einer 1,1-Milliliter-Tieflochplatte überführen. Die Platte 10 Minuten bei zwei Grad Celsius und 3.000 U/min zentrifugieren.

Verwenden Sie anschließend das Bravo, um eine 500 Femtomol pro Mikroliter betragende Ang-1-NAT-Standarlösung seriell zu verdünnen, um sechs Kalibratorlösungen mit Hühnereiweißalbumin herzustellen. Nach der Zentrifugation pipettieren Sie 200 Mikroliter jeder Kalibratorlösung in eine Vertiefung und 125 Mikroliter Generierungspuffer auf die Probenplatte. Mischen Sie mit einem automatisierten Flüssigkeitshandling-System 125 Mikroliter Plasmasupernatant oder 125 Mikroliter der Hühnereiweißalbuminlösung mit 25 Mikrolitern Angiotensin-I-Generierungspuffer in einer neuen 1,1-Milliliter-Tiefbrunnenplatte.

Überführen Sie die Lösungen nun automatisch in eine 96-Loch-Platte mit jeweils drei Wiederholungen pro Lösung und 34 Mikrolitern Lösung pro Vertiefung. Inkubieren Sie anschließend die Platte drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Für die Konjugation des Antikörpers mit Protein-G-Kügelchen überführen Sie zunächst 78 Mikroliter der zuvor hergestellten Kügelchensuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Kügelchen siebenmal mit je einem Milliliter 25 %igem Acetonitril in PBSC und dreimal mit je einem Milliliter PBSC unter Verwendung eines magnetischen Ständers, um die Kügelchen zwischen den einzelnen Waschschritten zu pelletieren. Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Kügelchen in 110 Mikrolitern PBSC und geben 110 Mikroliter Anti-Angiotensin-I-Antikörper hinzu. Mischen Sie die Kügelchen und die Lösung durch Pipettieren.

Anschließend die Kügelchen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, während sie mit acht U/min rotieren. Danach die Kügelchen dreimal mit je einem Milliliter PBSC waschen. Anschließend die Kügelchen in 1.100 Mikrolitern PBSC resuspendieren.

Überführen Sie die Perlsuspension nun manuell in eine 96-Well-Platte. Geben Sie anschließend die Perlen mit dem Bravo in dieselbe 96-Well-Platte ab. Nach der dreistündigen Inkubationszeit zur Generierung von Angiotensin I stellen Sie die Inkubationsplatte 10 Minuten lang auf Eis, um die Bildung von Angiotensin I zu beenden. Verdünnen Sie eine Peptid-Stammlösung mit stabilen Isotopenstandards automatisch 100-fach mit PBS-Puffer.

Weiterhin automatisch die Verdünnung des stabilen Isotopenstandards-Peptids auf eine 96-Loch-PCR-Platte aliquotieren. 10 Mikroliter der verdünnten Peptidlösung in jedes Loch der Inkubationsplatte überführen. Die verdünnte Peptidlösung mit den Plasma-Proben oder der Hühnereiweiß-Albumin-Lösung mischen.

Fügen Sie die Proben- oder Standardslösungen automatisch zu den Bead-Lösungen in der Inkubationsplatte hinzu und mischen Sie sie. Nach einer einstündigen Inkubation waschen Sie die Beads automatisch dreimal mit einer fünf Millimolar-Ammoniumbicarbonatlösung. Verwenden Sie nach jeder Wäsche ein Magnet, um die Beads auf den Boden zu ziehen.

Nach der letzten Waschung 10 Mikroliter der Ammoniumbicarbonatlösung in jedes Brunnen hinzufügen, um die Kügelchen erneut in Suspension zu bringen. Automatisch sieben Mikroliter der Kügelchensuspension auf eine MALDI-Target-Platte mit einer Spotgröße von 2.600 Mikrometern übertragen. Sobald die Kügelchen getrocknet sind, automatisch zwei Mikroliter der zuvor hergestellten HCCA-Matrixlösung aus dem Matrixbrunnen auf jeden Probe-Spot der Targetplatte geben.

Danach analysieren Sie die Probenpunkte mit einem MALDI-TOF-Gerät im positiven Reflektor-Modus. Führen Sie die interne Kalibrierung, Daten Glättung und Baseline-Subtraktion mit der herstellerspezifischen Software durch. Das automatisierte iMALDI-Verfahren zur Messung von Angiotensin I ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse einer großen Anzahl von Proben mit einem Tages-Koeffizienten der Variation unterhalb von 10 %. Hier werden repräsentative Spektren gezeigt, die durch die Messung von Angiotensin I in menschlichen Plasma-Proben erhalten wurden.

Korrelation der PRA-Werte aus 188 Patientenproben, ermittelt mit dem automatisierten iMALDI-Assay, mit PRA-Werten, die mittels einer klinischen LC-MS/MS-Methode erhalten wurden, ist hier dargestellt. Die beiden Methoden weisen einen Korrelationskoeffizienten von 0,98 auf, und der Unterschied zwischen den Steigungen könnte auf die Verwendung unterschiedlicher interner Standards oder verschiedener Antikörper zurückzuführen sein. Der lineare Messbereich des Assays sowie die Präzision des Assays sind hier aufgeführt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa fünf Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist darauf zu achten, den Pipettenspitzenkopf und die Flüssigkeitsmanipulationsgeschwindigkeit korrekt einzustellen. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden zur Bestätigung eines primären Hyperaldosteronismus bei Patienten eingesetzt werden, wie beispielsweise orale Salzbelastung oder Kochsalzinfusionstests.

Die automatisierte iMALDI-Technik ermöglicht die spezifische und genaue hochdurchsatzfähige quantitative Untersuchung biologischer Proben, einschließlich Patientenproben, auf krankheitsrelevante Proteine oder Peptide. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen automatisierten iMALDI-Assay zur massenspektrometriebasierten Quantifizierung von Proteinen und Peptiden durchführt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit biologischen Proben, wie beispielsweise humanem Plasma, äußerst gefährlich ist, und dass stets die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen, während des gesamten Verfahrens.