Peptid und Protein Quantifizierung mit Hilfe automatisierter Immuno-MALDI (iMALDI)

Das übergeordnete Ziel dieses automatisierten Immun-MALDI-Assays ist es, Peptide und intakte Proteine in komplexen biologischen Flüssigkeiten auf genaue und empfindliche Weise zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der quantitativen Proteomik zu beantworten, wie z. B. die Quantifizierung von Proteinspiegeln für die Diagnostik oder für die Überwachung des Ansprechens eines Patienten auf die Behandlung. Der entscheidende Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie den Proteingehalt aus komplexen Proben sehr empfindlich und genau quantifizieren kann.

Diese Technik ermöglicht die Diagnose von Krankheiten in einem frühen Stadium, da der Immunanreicherungsschritt des Assays die Quantifizierung von Protein- und Peptid-Biomarkern mit geringer Häufigkeit ermöglicht. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Reninaktivität im Plasma geben kann, kann sie auch auf andere krankheitsbezogene Studien angewendet werden, wie z. B. die Quantifizierung krebsbezogener Proteine für die Prognose, Diagnose und das Behandlungsmanagement. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Sie menschliche Plasmaproben fünf Minuten lang in einem Wasserbad mit Raumtemperatur auf.

Legen Sie die Proben dann auf Eis, bis sie vollständig aufgetaut sind. Übertragen Sie anschließend manuell 200 Mikroliter jeder Plasmaprobe in separate Vertiefungen einer 1,1-Milliliter-Deep-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei zwei Grad Celsius und 3.000 U/min.

Verwenden Sie dann den Bravo, um eine 500 Femtomol pro Mikroliter Ang-1 NAT-Standardlösung seriell zu verdünnen, um sechs Kalibratorlösungen mit Hühnereiweißalbumin herzustellen. Nach der Zentrifugation pipettieren Sie 200 Mikroliter jedes Kalibrators in eine Vertiefung und 125 Mikroliter Generationspuffer in die Probenplatte. Mischen Sie mit einem automatisierten Liquid-Handling-System 125 Mikroliter Plasmaüberstand oder 125 Mikroliter der Hühnereiweißalbuminlösung mit 25 Mikrolitern Angiotensin-I-Generationspuffer in einer neuen 1,1-Milliliter-Deep-Well-Platte.

Übertragen Sie die Lösungen nun automatisch auf eine 96-Well-Platte mit drei Replikaten pro Lösung und 34 Mikrolitern Lösung pro Well. Dann inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Für die Konjugation des Antikörpers mit Protein-G-Kügelchen werden zunächst 78 Mikroliter der zuvor hergestellten Kügelchenaufschlämmung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt.

Waschen Sie die Kügelchen siebenmal mit einem Milliliter 25 % Acetonitril in PBSC und dreimal mit einem Milliliter PBSC, indem Sie die Kügelchen zwischen jedem Waschgang mit einem Magnetständer pelletieren. Nach dem Waschen der Kügelchen resuspendieren Sie sie in 110 Mikrolitern PBSC und fügen Sie 110 Mikroliter Anti-Angiotensin-I-Antikörper hinzu. Mischen Sie die Kügelchen und die Lösung durch Pipettieren.

Inkubieren Sie die Kügelchen dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur, während Sie sich bei acht Umdrehungen pro Minute drehen. Anschließend die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter PBSC waschen. Dann resuspendieren Sie die Kügelchen in 1.100 Mikrolitern PBSC.

Übertragen Sie nun die Bead-Lösung manuell auf eine 96-Well-Platte. Lassen Sie dann den Bravo die Kügelchen auf dieselbe 96-Well-Platte aliquotieren. Nach der dreistündigen Angiotensin-I-Generationsphase legen Sie die Inkubationsplatte 10 Minuten lang auf Eis, um die Bildung von Angiotensin I zu beenden. Verdünnen Sie automatisch eine stabile Isotopenstandard-Peptidstammlösung 100-fach mit PBS-Puffer.

Aliquotieren Sie außerdem automatisch die Standard-Peptidverdünnung des stabilen Isotops auf eine 96-Well-PCR-Platte. Übertragen Sie 10 Mikroliter der verdünnten Peptidlösung in jede Vertiefung der Inkubationsplatte. Mischen Sie die verdünnte Peptidlösung mit den Plasmaproben oder der Hühnereiweißalbuminlösung.

Geben Sie die Probe oder Standardlösungen automatisch zu den Bead-Lösungen, auf die Inkubationsplatte und mischen Sie sie. Nach einer Stunde Inkubation waschen Sie die Kügelchen automatisch dreimal mit fünf Millimolar Ammoniumbicarbonatlösung. Ziehe die Perlen nach jedem Waschen mit einem Magneten nach unten.

Geben Sie nach dem letzten Waschen 10 Mikroliter der Ammoniumbicarbonatlösung in jede Vertiefung, um die Kügelchen wieder zu suspendieren. Übertragen Sie automatisch sieben Mikroliter der Bead-Slurry auf eine MALDI-Zielplatte mit einer Spotgröße von 2.600 Mikrometern. Sobald die Kügelchen getrocknet sind, geben Sie automatisch zwei Mikroliter der zuvor vorbereiteten HCCA-Matrixlösung aus der Matrixvertiefung auf jeden Probenpunkt auf der Zielplatte.

Analysieren Sie anschließend die Probenspots mit einem MALDI-TOF-Gerät im positiven Reflektormodus. Führen Sie interne Kalibrierung, Datenglättung und Baseline-Subtraktion mit der herstellerspezifischen Software durch. Das automatisierte iMALDI-Verfahren zur Messung von Angiotensin I ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse einer großen Anzahl von Proben mit einem Intraday-Variationskoeffizienten von unter 10 %Repräsentative Spektren, die durch die Messung von Angiotensin I in humanen Plasmaproben erhalten wurden, werden hier dargestellt.

Die Korrelation der PRA-Werte von 188 Patientenproben, die mit dem automatisierten iMALDI-Assay gewonnen wurden, mit den PRA-Werten, die mit einem klinischen LC-MS/MS-Verfahren gewonnen wurden, ist hier dargestellt. Die beiden Methoden haben einen Korrelationskoeffizienten von 0,98, und die Differenz zwischen den Steigungen kann auf die Verwendung unterschiedlicher interner Standards oder unterschiedlicher Antikörper zurückzuführen sein. Hier werden der lineare Bereich des Assays und die Assay-Präzision angezeigt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Stunden durchgeführt werden. Denken Sie bei diesem Vorgang daran, den Spitzenkopf und die Geschwindigkeit des Liquid-Handlings richtig einzustellen. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden zur Bestätigung des primären Aldosteronismus bei Patienten verwendet werden, einschließlich oraler Salzbeladung oder Kochsalzinfusionstests.

Die automatisierte iMALDI-Technik ermöglicht das spezifische und genaue quantitative Screening biologischer Proben, einschließlich Patientenproben, auf krankheitsrelevante Proteine oder Peptide. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen automatisierten iMALDI-Assay für die massenspektrometrische Protein- und Peptidquantifizierung durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben, wie z. B. menschlichem Plasma, äußerst gefährlich ist und bei der Durchführung des Eingriffs immer die notwendigen Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen.