Name: Peptid und Protein Quantifizierung mit Hilfe automatisierter Immuno-MALDI (iMALDI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Immuno-MALDI-Technologie zur quantitativen Analyse von Peptiden und Proteinen in komplexen biologischen Flüssigkeiten. Diese Methode ermöglicht die sensitive Quantifizierung niedrig abundanter Biomarker für die frühzeitige Krankheitsdiagnostik.

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Wir danken den finanziellen Unterstützung von Genom Kanada und Genom British Columbia für Operationen (204PRO) und Technologieentwicklung (214PRO) durch das Genom Innovationen Netz (GIN). Wir danken der Drug Discovery-Plattform am Research Institute von der McGill University Health Center für die Nutzung der MALDI-TOF-Instrument für die Dreharbeiten. H.L ist dankbar für die Unterstützung von ein Postdoc-Stipendium von der National Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC). C.H.B ist dankbar für die Unterstützung von Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. ist dankbar für Unterstützung von den Segal McGill Lehrstuhl für Molekulare Onkologie an der McGill University (Montreal, Quebec, Kanada). M.X.C. und C.H.B. sind dankbar für Unterstützung von Warren Y. Soper Charitable Trust und Alvin Segal Family Foundation die Jewish General Hospital (Montreal, Quebec, Kanada).

die Beträge der unten beschriebenen Reagenzien basieren auf der Messung von 20 Patienten Plasmaproben. Das Protokoll Nachstehend folgt die Richtlinien von der University of Victoria &#39; s Humanforschung Ethikkommission.
 1. Generation von Ang ich im menschlichen Plasma <ol><li>tauen Plasmaproben (&#8805; 200 µL) in einem Raum Temperatur Wasser Bad für 5 min, und setzen Sie dann die Proben auf Eis bis vollständig aufgetaut.</li>
	<li>Transfer 200 µL jeder Plasma Probe manuell zu trennen Brunnen von einem 1,1 mL Deep-Well-Platte (Probenteller), und die Platte in einer Zentrifuge für 10 min bei 2 ° C und 1278 X g Zentrifugieren</li>
	<li>Verwenden eine automatisierte Liquid handling-System, um eine 500 Fmol/µL Ang I NAT standard-Lösung zur Vorbereitung sechs Kalibrator Lösungen mit Huhn Eiweiß Albumin seriell zu verdünnen (0,1, 0,2, 0,6, 1,9, 5.7, 17,2 Fmol/µL).</li>
	<li>Jedem Kalibrator, ein gut und 125 µL Generation Pipette 200 µL Puffer Probenteller. 
	Hinweis: Die CEWA in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) Puffer muss am Tag des Experiments frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Mit einer automatisierten Flüssigkeit handling-System, in einer neuen Platte mix 125 µL überstand Plasma oder 125 µL CEWA mit PBS-Puffer mit 25 µL Ang ich Generation Puffer, enthält 1 M Tris, 0,2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF). 
	Hinweis: Bereiten Sie die Ang ich Generation Puffer durch das Mischen von 1 M Tris/0,2 mM EDTA wässrigen Puffers (passen Sie auf pH 5,5 mit Essigsäure) und eine PMSF Lösung (100 mM in Methanol). Beide Lösungen können bis zu 1 Monat bei 4 ° c-Mix der beiden Lösungen am Tag des Experiments gelagert werden.</li>
	<li>Übertragen die Lösungen automatisch in eine 96-Well-Platte, 3 Wiederholungen pro Lösung, 34 µL pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 3 h</li>
</ol> 2. Immuno-Anreicherung von Ang ich mittels Antikörper-beschichtete Perlen <ol><li>Konjugation des Antikörpers auf magnetische Protein G Perlen Hinweis: Konjugation des Antikörpers mit den Perlen erfolgt manuell in den 3 h Ang ich Generation Zeit auf die Tag des Experiments. Für andere Analyte könnte die konjugierten Perlen in PBS-Puffer mit 0,015 % CHAPS (PBSC) bei 4 ° C für drei Monate oder länger, je nach Eigenschaften und Stabilität des Antikörpers gespeichert werden können.
	<ol><li>Transfer 110 µL Wulst Gülle (reicht für 20 Proben zu messen und damit eine standard 6-Punkt-Kurve) in einer 1,5 mL-Tube. Waschen Sie die Perlen siebenmal mit 1 mL 25 % Acetonitril/peripherer und dreimal mit 1 mL peripherer. Verwenden Sie ein Magnetstativ, um die Perlen zwischen jedem Waschschritt pellet. Entfernen Sie die Waschpuffer nach der letzten Wash 
		Hinweis: Waschen 7 Mal mit 25 % ist Acetonitril/peripherer entscheidend zur Beseitigung der MS-inkompatible Additive im Wulst Gülle, wie z. B. Tween-20. In den ausgewählten Perlen gibt es keine solche Zusätze, dieses umfangreiche Waschschritt möglicherweise nicht notwendig sein.</li>
		<li>Die Perlen in 110 µL peripherer aufzuwirbeln, und fügen Sie 110 µL Anti-Ang ich Antikörper (endgültige Antikörperkonzentration: 100 µg/mL). Mischen Sie die Perlen und die Lösung durch pipettieren und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 1 h, 8 u/min drehen.</li>
		<li>Waschen die Perlen 3 Mal mit 1 mL peripherer und in 1100 µL peripherer Aufschwemmen. 
		Hinweis: Wenn keine Wulst-Lösung in die Kappe des Rohres während der Inkubation geflossen ist, spin-down die Lösung unter Verwendung einer Benchtop-Zentrifuge bei 2680 X g.</li>
		<li>Übertragen die Wulst-Lösung manuell in eine 96-Well-Platte (Perle standard Platte). Verwenden Sie die automatisierte Flüssigkeit Handlingsystem, aliquoten die Perlen an der gleichen 96-Well-Platte, 120 µL pro Well.</li></ol></li> <li>Immuno-Anreicherung an den Perlen <ol><li>nach 3 h Ang Generation Zeit, lege ich die Inkubation Platte auf Eis für 10 min in die Generation der Ang I. beenden</li>
		<li>Automatisch Verdünnen der SIS Peptid-Stammlösung (10 Pmol/μL) 100fach mit PBS Puffer, und automatisch weitere Aliquot der stabilen Isoptope standard Peptid Verdünnung auf eine 96-Well-PCR-Platte. 1,5 µL einer stabilen Isotop Normen (SIS) Peptid-Lösung (mit 100 Fmol) in jede Vertiefung der Inkubation Platte übertragen und mischen Sie es mit der Plasma-Proben oder der CEWA in PBS-Puffer.</li>
		<li>Automatisch den Inhalt der Inkubation Platte auf die Wulst Lösung, 10 mL pro Bohrloch übertragen, mix.</li>
		<li>Die Platte bei 4 ° C für 1 h beim Drehen mit 8 u/min inkubieren.</li>
		<li>Die Perlen dreimal waschen automatisch mit 5 mM Ammonium Bicarbonat (AmBic) Lösung, 100 µL pro Bohrloch pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen der Perlen in 7 µL 5 mM AmBic Lösung in jede Vertiefung. Verwenden Sie ein Magnet, um die Perlen nach dem letzten Wash nach unten ziehen</li>
	</ol></li></ol> 3. Übertragung von Perlen auf eine MALDI Zieltafel und Hinzufügen von Matrix-Lösung <ol><li>Transfer 7 µL des Schlickers Wulst automatisch auf eine MALDI-Zieltafel mit einer Spotgröße von 2.600 µm. Lassen Sie die Perlen austrocknen. 
	Hinweis: Ein kleiner USB-betriebenen Ventilator kann verwendet werden, um die Perle, die Trocknung beschleunigen.</li>
	<li>Automatisch hinzufügen 2 µL der α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (HCCA)-Matrixlösung (mit 3 mg/mL HCCA, 1,8 mg/mL Ammonium Citrat, 70 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoroacetic Säure) aus der Matrix gut auf jede Probe vor Ort auf die Zieltafel .</li>
</ol> 4. Übernahme durch ein MALDI-TOF-MS und Datenanalyse-Signal <ol><li>Analyse der Probe Flecken mit einem MALDI-TOF-Instrument mit positiven Reflektor-Modus. Führen Sie interne Kalibrierung Daten Glättung und Grundlinie Subtraktion automatisch mit herstellerspezifischen Software. 
	Hinweis: Die Betriebsart (positiv/negativ, lineare/Reflektor) für MALDI-TOF-Messung hängt von der Ziel-Peptide oder Proteine.</li>
	<li>Die relative Response Ratio (Nat/SIS Intensitätsverhältnis) zu berechnen und vergleichen Sie es mit der Standardkurve bestimmen die ang ich Konzentration in jeder Probe. Berechnen Sie PRA nach Gleichung (1), wo Δt Ang ich Generation repräsentiert die Zeit für die Generation der Ang I. 
	PRA = [Ang ich] / Δt Ang ich Generation (1)</li></ol>

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C.H.B hält das Patent auf die iMALDI-Technologie.

Im Vergleich zu herkömmlichen MS-basierte Protein Quantifizierung, nutzt iMALDI Antikörper zur Bereicherung der Analyten und reinigen sie von komplexen Proben, daher macht es möglich, Proteine oder Peptide in geringen Konzentrationen zu quantifizieren. Ein wichtiger Schritt in das iMALDI-Protokoll ist die Immuno-Anreicherung der Ziel-Peptide. Zu diesem Zweck sollten Antikörper mit hoher Spezifität und Affinität ausgewählt werden. In SISCAPA wurde berichtet, dass Antikörper Affinitäten bei 10-9 M oder besser er...

Massenspektrometrie ist ein unverzichtbares Werkzeug in quantitative Proteomik geworden. Massenspektrometrie kann die Massen der Zielproteine oder Peptide bestimmen, also die erhaltenen Analyten Signale können hochspezifische im Vergleich zu Immunoassays. Zwei sind Ionisation, Electrospray und MALDI, am häufigsten Methoden zur Erkennung von Proteinen und Peptiden1,2,3,4. Eine große Herausforderung in MS-basierte Protein Quantifizierung liegt in der Erkennung von niedrig-Fülle Proteinen in komplexen Proben bei ng/mL oder Pg/mL Konzentrationen in Anwesenheit hoher Fülle Proteine und viele Kandidaten-Protein-Biomarkern im menschlichen Plasma gefunden werden innerhalb dieser Reihe5. Dieses Problem wird weitgehend durch die von Natur aus hohen Dynamikbereich und Komplexität der menschlichen Proteoms6verursacht.
Um diese Erkennung Herausforderungen zu überwinden, Immuno-MS-Methoden wurden entwickelt, um bereichern die Zielproteine oder Peptide aus den Musterlösungen auf einer festen Oberfläche, gefolgt von Elution von Analyten und MS Messung7,8 , 9 , 10. durch Immuno-Anreicherung des Analyten werden gereinigt, von komplexen Proben und minimiert die Ion-Unterdrückung Effekte aus anderen Molekülen. Unter den verschiedenen festen Trägern sind magnetische Beads derzeit am häufigsten verwendet, da sie die Vorteile der hohen Antikörper-Bindungskapazität und einfache Handhabung. Magnetische Beads mit unterschiedlichen Functionalizations und Größen wurden entwickelt und vermarktet für Immunopräzipitation Experimente. Bis heute hat Immuno-Anreicherung auf Perlen mit Electrospray Ionisierung (ESI) und MALDI-MS für Proteine und Peptide Messung angeschlossen. In stabiler Isotope Standards und Gefangennahme durch Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA)-Technologie sind Proteine in den Proben verdaut, gefolgt von Inkubation mit Antikörper-beschichtete Perlen für Immuno-Anreicherung. Im "klassischen" SISCAPA sind die aufgenommenen Proteotypic Peptide eluiert von Perlen und gemessen durch flüssige Chromatographie-ESI-MS (LC-MS) oder durch direkte Infusion ESI-Multiple Reaktion Monitoring-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Immuno-Anreicherung verbessert die MRM-Assay-Empfindlichkeit um Größenordnungen 3-4 niedrige ng/mL Palette13zu erreichen.
Im Vergleich zu Elektrospray-MS, MALDI-MS ist schneller und beinhaltet jedoch nicht die Reinigung und erneute Gleichgewichtherstellung LC Spalten so gibt es keine Verschleppung und Verschmutzung Probleme eignet sich mehr für Hochdurchsatz-Studien14. Immuno-MALDI-Technologie entwickelt wurde, in unserem Labor, Immuno-Anreicherung mit MALDI-MS für empfindliche und spezifische Quantifizierung von Peptiden und Proteinen (basierend auf Quantifizierung von Proteotypic Peptiden) verbinden15,16 ,17. Nach der Immuno-Bereicherung die Perlen sind auf einem MALDI-Zieltafel hinterlegt, die Matrixlösung wird hinzugefügt, um Perlen und die Platte ist bereit für die Analyse von MALDI-TOF-MS nach dem Trocknen. Elution der Peptide aus den Perlen ist nicht als separater Schritt durchgeführt, aber Affinität-gebundenen Analyten sind durch die MALDI-Matrix-Lösung eluiert, wenn es die Perle Spots, dadurch vereinfachen die Probenvorbereitung und Minimierung Probenverlust hinzugefügt wird. Die iMALDI-Technologie in einer Vielzahl von Anwendungen18,19, angewendet wurde und vor kurzem wurde automatisiert und verwendet für die Messung von Angiotensin ich (Ang ich) zur Bestimmung der Plasma-Renin-Aktivität (PRA)-20. Dieses Protokoll zeigen das Verfahren verwendet, um eine automatisierte iMALDI Assay durchzuführen. Nehmen wir als Beispiel, Inter Tag CVs von weniger als 10 % des PRA-Tests durch Automatisierung, mit der Fähigkeit 744 Proben pro Tag20erreicht.
Der iMALDI PRA-Test zeigte in diesem Manuskript erfordert keine Proteinverdauung, als dem Zielmolekül (Ang ich) ist ein Peptid mit einem Molekulargewicht von 1295.7 Da. In anderen Tests wo Proteinverdauung ist notwendig und eine Peptid dient als Leihmutter für das intakte Protein sollte das ausgewählte Peptid für iMALDI, einzigartig und speziell für das Zielprotein, mit einer Masse von über 800 Da, so daß es leicht aus dem c unterschieden werden können hemical Lärm aus der MALDI-Matrix-Lösung. Anti-Peptid-Antikörper sind erforderlich für die Immuno-Bereicherung der Peptide. Das Protokoll für eine iMALDI-Assay PRA Messung besteht aus vier Schritten: 1) Generation von Ang ich im menschlichen Plasma; (2) Immuno-Anreicherung von Ang ich mit Antikörper-beschichtete Perlen; (3) Übertragung von Perlen zu einem MALDI Zieltafel und Hinzufügen von Matrixlösung; und 4) Erwerb von MALDI-TOF-MS und Daten Analyse20zu signalisieren.

<table><tbody><tr><td>Gesunde Kontrolle menschliches Plasma</td><td>Biorekultivierung</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumcitrat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus Hühnereiweiß (>98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>Wasser in LC-MS-Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>39253</td><td>Essigsäure in LC-MS-Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>in LC-MS-Qualität</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G magnetische Kügelchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 mg/ml</td></tr><tr><td>anti-Ang I polyklonaler Antikörper für Ziegen</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat und SIS Ang I</td><td>synthetisiert an der University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatisiertes Liquid-Handling-System</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo Roboter-Arbeitsplatz</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 Magnet</td></tr><tr><td>Röhrenrotator</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Röhrenrotatormagnet</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 Magnet mit seitlichem Rand</td></tr><tr><td>Magnet VP</td><td>Scientific</td><td>771RM-1</td><td>wird verwendet, um die Kügelchen auf den Boden der Vertiefung zu ziehen</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF Instrument</td></tr></tbody></table>

peptid und protein quantifizierung mit hilfe automatisierter immuno-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Massenspektrometrie (MS) ist eine der am häufigsten verwendeten Technologien zur Quantifizierung von Proteinen in komplexen Proben mit ausgezeichneten Assay Spezifität durch die unmittelbare Erfassung des Masse-Ladungs-Verhältnisses der einzelnen Zielmolekül. Aber MS-basierte Proteomics, wie die meisten anderen analytischen Techniken, hat eine Tendenz zur Messung hoher Fülle Analyten, so dass es schwierig ist, um zu erreichen Nachweisgrenzen von niedrigen ng/mL oder Pg/mL in komplexen Proben, und dies ist der Konzentrationsbereich für viele krankheitsrelevante Proteine in auszahlt wie menschlichen Plasma. Zur Unterstützung bei der Erkennung von niedrig-Fülle Analyten wurde Immuno-Anreicherung integriert in den Assay zu konzentrieren und Reinigen des Analyten vor der MS Messung Assay Empfindlichkeit deutlich zu verbessern. In dieser Arbeit ist die Immuno - Matrix Laser Desorption/Ionisierung (iMALDI)-Technologie präsentiert für die Quantifizierung von Proteinen und Peptiden in auszahlt, basierend auf Immuno-Anreicherung auf Perlen, gefolgt von MALDI-MS Messung ohne vorherige Elution. Die Anti-Peptid-Antikörper sind auf magnetische Beads funktionalisiert und mit Proben inkubiert. Nach dem Waschen, die Perlen sind auf ein MALDI-Zieltafel direkt übertragen und die Signale durch eine MALDI-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) Instrument gemessen werden, nachdem die Matrixlösung auf die Perlen angewendet wurde. Die Beispielprozedur Vorbereitung ist im Vergleich zu anderen Immuno-MS-Assays vereinfacht, und die MALDI-Messung ist schnell. Die gesamte Probenvorbereitung ist mit einer Flüssigkeit, die handling-System, mit verbesserten Assay Reproduzierbarkeit und höheren Durchsatz automatisiert. In diesem Artikel dient der iMALDI-Test zur Bestimmung der Peptid Angiotensin ich (Ang ich) Konzentration im Plasma, die klinisch als Auslesen der Plasma-Renin-Aktivität für das Screening von primären Aldosteronism (PA) verwendet wird.

Eine automatisierte iMALDI-Verfahren zur Messung der Ang ist mir in Abbildung 1gezeigt. Ziel-Peptide (endogene Peptide oder Peptide aus verdauliche Proteine) sind auf Anti-Peptid magnetische Beads bereichert, und dann werden die Perlen auf eine Zieltafel für MALDI-Messung übertragen. Das gesamte Verfahren wird vereinfacht, im Vergleich zu anderen Immuno-MS-Technologien, die zusätzliche Peptid Elution Schritte erfordern. Automatisierung des iMALDI-Tests kann f...

Ein Protokoll für die Quantifizierung von Proteinen in komplexen biologischen Flüssigkeiten mit automatisierten Immuno-MALDI (iMALDI)-Technologie präsentiert.

Peptid und Protein Quantifizierung mit Hilfe automatisierter Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Das übergeordnete Ziel dieses automatisierten immuno-MALDI-Assays besteht darin, Peptide und intakte Proteine in komplexen biologischen Flüssigkeiten genau und empfindlich zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der quantitativen Proteomik zu beantworten, beispielsweise die Quantifizierung von Proteinspiegeln für die Diagnostik oder zur Überwachung der Reaktion eines Patienten auf eine Therapie. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt darin, dass sie Proteinspiegel aus komplexen Proben sehr empfindlich und genau quantifizieren kann.Diese Technik ermöglicht die Diagnose von Krankheiten in einem frühen Stadium, da der Immunoanreicherungsschritt des Assays die Quantifizierung seltener vorkommender Protein- und Peptid-Biomarker erlaubt. Obwohl diese Methode Einblicke in die plasmatische Reninaktivität liefern kann, ist sie auch auf andere krankheitsbezogene Untersuchungen anwendbar, beispielsweise auf die Quantifizierung krebsrelevanter Proteine zur Prognose, Diagnose und Therapiemanagement. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Sie humane Plasma­proben fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf.Danach die Proben auf Eis stellen, bis sie vollständig aufgetaut sind. Anschließend 200 Mikroliter jeder Plasma probe manuell in separate Vertiefungen einer 1,1-Milliliter-Tieflochplatte überführen. Die Platte 10 Minuten bei zwei Grad Celsius und 3.000 U/min zentrifugieren.Verwenden Sie anschließend das Bravo, um eine 500 Femtomol pro Mikroliter betragende Ang-1-NAT-Standarlösung seriell zu verdünnen, um sechs Kalibratorlösungen mit Hühnereiweißalbumin herzustellen. Nach der Zentrifugation pipettieren Sie 200 Mikroliter jeder Kalibratorlösung in eine Vertiefung und 125 Mikroliter Generierungspuffer auf die Probenplatte. Mischen Sie mit einem automatisierten Flüssigkeitshandling-System 125 Mikroliter Plasmasupernatant oder 125 Mikroliter der Hühnereiweißalbuminlösung mit 25 Mikrolitern Angiotensin-I-Generierungspuffer in einer neuen 1,1-Milliliter-Tiefbrunnenplatte.Überführen Sie die Lösungen nun automatisch in eine 96-Loch-Platte mit jeweils drei Wiederholungen pro Lösung und 34 Mikrolitern Lösung pro Vertiefung. Inkubieren Sie anschließend die Platte drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Für die Konjugation des Antikörpers mit Protein-G-Kügelchen überführen Sie zunächst 78 Mikroliter der zuvor hergestellten Kügelchensuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie die Kügelchen siebenmal mit je einem Milliliter 25 %igem Acetonitril in PBSC und dreimal mit je einem Milliliter PBSC unter Verwendung eines magnetischen Ständers, um die Kügelchen zwischen den einzelnen Waschschritten zu pelletieren. Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Kügelchen in 110 Mikrolitern PBSC und geben 110 Mikroliter Anti-Angiotensin-I-Antikörper hinzu. Mischen Sie die Kügelchen und die Lösung durch Pipettieren.Anschließend die Kügelchen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, während sie mit acht U/min rotieren. Danach die Kügelchen dreimal mit je einem Milliliter PBSC waschen. Anschließend die Kügelchen in 1.100 Mikrolitern PBSC resuspendieren.Überführen Sie die Perlsuspension nun manuell in eine 96-Well-Platte. Geben Sie anschließend die Perlen mit dem Bravo in dieselbe 96-Well-Platte ab. Nach der dreistündigen Inkubationszeit zur Generierung von Angiotensin I stellen Sie die Inkubationsplatte 10 Minuten lang auf Eis, um die Bildung von Angiotensin I zu beenden. Verdünnen Sie eine Peptid-Stammlösung mit stabilen Isotopenstandards automatisch 100-fach mit PBS-Puffer.Weiterhin automatisch die Verdünnung des stabilen Isotopenstandards-Peptids auf eine 96-Loch-PCR-Platte aliquotieren. 10 Mikroliter der verdünnten Peptidlösung in jedes Loch der Inkubationsplatte überführen. Die verdünnte Peptidlösung mit den Plasma-Proben oder der Hühnereiweiß-Albumin-Lösung mischen.Fügen Sie die Proben- oder Standardslösungen automatisch zu den Bead-Lösungen in der Inkubationsplatte hinzu und mischen Sie sie. Nach einer einstündigen Inkubation waschen Sie die Beads automatisch dreimal mit einer fünf Millimolar-Ammoniumbicarbonatlösung. Verwenden Sie nach jeder Wäsche ein Magnet, um die Beads auf den Boden zu ziehen.Nach der letzten Waschung 10 Mikroliter der Ammoniumbicarbonatlösung in jedes Brunnen hinzufügen, um die Kügelchen erneut in Suspension zu bringen. Automatisch sieben Mikroliter der Kügelchensuspension auf eine MALDI-Target-Platte mit einer Spotgröße von 2.600 Mikrometern übertragen. Sobald die Kügelchen getrocknet sind, automatisch zwei Mikroliter der zuvor hergestellten HCCA-Matrixlösung aus dem Matrixbrunnen auf jeden Probe-Spot der Targetplatte geben.Danach analysieren Sie die Probenpunkte mit einem MALDI-TOF-Gerät im positiven Reflektor-Modus. Führen Sie die interne Kalibrierung, Daten Glättung und Baseline-Subtraktion mit der herstellerspezifischen Software durch. Das automatisierte iMALDI-Verfahren zur Messung von Angiotensin I ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse einer großen Anzahl von Proben mit einem Tages-Koeffizienten der Variation unterhalb von 10 %. Hier werden repräsentative Spektren gezeigt, die durch die Messung von Angiotensin I in menschlichen Plasma-Proben erhalten wurden.Korrelation der PRA-Werte aus 188 Patientenproben, ermittelt mit dem automatisierten iMALDI-Assay, mit PRA-Werten, die mittels einer klinischen LC-MS/MS-Methode erhalten wurden, ist hier dargestellt. Die beiden Methoden weisen einen Korrelationskoeffizienten von 0,98 auf, und der Unterschied zwischen den Steigungen könnte auf die Verwendung unterschiedlicher interner Standards oder verschiedener Antikörper zurückzuführen sein. Der lineare Messbereich des Assays sowie die Präzision des Assays sind hier aufgeführt.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa fünf Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist darauf zu achten, den Pipettenspitzenkopf und die Flüssigkeitsmanipulationsgeschwindigkeit korrekt einzustellen. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden zur Bestätigung eines primären Hyperaldosteronismus bei Patienten eingesetzt werden, wie beispielsweise orale Salzbelastung oder Kochsalzinfusionstests.Die automatisierte iMALDI-Technik ermöglicht die spezifische und genaue hochdurchsatzfähige quantitative Untersuchung biologischer Proben, einschließlich Patientenproben, auf krankheitsrelevante Proteine oder Peptide. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen automatisierten iMALDI-Assay zur massenspektrometriebasierten Quantifizierung von Proteinen und Peptiden durchführt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit biologischen Proben, wie beispielsweise humanem Plasma, äußerst gefährlich ist, und dass stets die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen, während des gesamten Verfahrens.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Stabile Isotope Standards und Capture von Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA) Paare Affinitätsanreicherung von Peptiden mit Isotopenverdünnungsanalyse Massenspektrometrie (MRM-MS) zur quantitativen Messung von Peptiden als Ersatz für ihre jeweiligen Proteine ​​liefern. Hier beschreiben wir das Protokoll mit magnetischen Partikeln in einer teilautomatisierten Format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Wir haben eine Technologie auf mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschicht zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus Humanserum. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften unserer mesoporösen Chips wurden fein abgestimmt, um wesentliche Bereicherung in der Peptid-Kontrolle stellen und damit das Profil Serumproteom für diagnostische Zwecke.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Dieses Protokoll beschreibt, wie absolute Quantifizierungsassays von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben unter Verwendung ausgewählter Reaktionsüberwachung durchgeführt werden. Es wurde verwendet, um Proteine des Chemotaxis-Signalwegs von Mausmakrophagen genau zu quantifizieren. Die Auswahl des Zielpeptids, die Assay-Entwicklung sowie qualitative und quantitative Assays werden ausführlich beschrieben.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Hier beschreiben wir einen chromatographischen Assay, gekoppelt mit der Ionen-Mobilität Trennung von Peptid-Vorstufen, gefolgt von den hochauflösenden (~ 30.000) MS-Detektion von Peptid-Fragmente für die Quantifizierung der Spike Peptid Standards in ein monoklonaler Antikörper Digest.

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

Wir beschreiben die Verwendung von quantitativen Immunoblotting, Immunfluoreszenz Histologie gepaart mit Bildanalyse als Mittel zur Quantifizierung eines Proteins des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der Immunfluoreszenz Histologie für die Ermittlung der relativen Menge Biomarker Proteine im Routine-Biopsie Proben.

Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Sample-Multiplexing-Strategie, die in der Lage ist, die Anzahl der Proben zu erhöhen, die gleichzeitig mit verfügbaren isobarischen Tags analysiert werden können. Die Integration einer Roboterplattform hat den experimentellen Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die quantitative Genauigkeit erheblich erhöht.

Automatisiertes Sample-Multiplexing mit kombinierter Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobaischer Kennzeichnung (cPILOT)

Hier stellen wir ein Protokoll zur Aufreinigung von MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Peptidkomplexen aus Maus- und humanen Zelllinien vor, das qualitativ hochwertige Immunopeptidomik-Daten liefert. Das Protokoll konzentriert sich auf die Probenvorbereitung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper.

Immunpeptidomik: Isolierung von Maus- und humanen MHC-Klasse-I- und II-assoziierten Peptiden für die Massenspektrometrie-Analyse

Hier beschreiben wir einen Proteomik-Workflow zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms verschiedener Zelltypen. Dieser Arbeitsablauf umfasst die Anreicherung von Proteinen auf der Zelloberfläche, die anschließende Probenvorbereitung, die Analyse mit einer LC-MS/MS-Plattform und die Datenverarbeitung mit spezieller Software.

"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

Erfahren Sie die automatisierte Immuno-MALDI-Technologie zur quantitativen Analyse von Peptiden und Proteinen in komplexen biologischen Flüssigkeiten. Diese Methode ermöglicht die sensitive Quantifizierung niedrig abundanter Biomarker für die frühzeitige Krankheitsdiagnostik.

Peptid und Protein Quantifizierung mit Hilfe automatisierter Immuno-MALDI (iMALDI)

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