Name: Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Lernen Sie die schnelle Charakterisierung biomolekularer Falt- und Bindungswechselwirkungen mit differentieller Scanningkalorimetrie und thermolabilen Liganden. Diese Methode ermöglicht die effiziente Extraktion thermodynamischer Parameter für die Biokalorimetrie und Arzneimittelentwicklung.

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R. W. H. V wurde von der McGill Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) Schulungsprogramm in Bionanomachines unterstützt. A. K. M. und P. E. J. wurden von NSERC Zuschüsse 327028-09 (A. K. M) und 238562 (P. E. J.) unterstützt.

1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Reinigen Sie die gewünschte Biomolekül13. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet gekauft Kokain-Bindung DNA-Aptamer MN4 nach dem Austausch gegen 2 M NaCl dreimal gefolgt von drei Runden von entionisiertem Wasser mit einem zentrifugalen Filter mit einer 3 kDa Molekulargewicht Cut-off Membran.</li>
	<li>Synthetisieren Sie und zu reinigen Sie, oder kaufen Sie die gewünschte thermolabilen Liganden-13. Hinweis: MN4 bindet die thermolabilen Liganden Kokain. MN4 bindet auch Chinin, das als Negativkontrolle für Liganden Thermolability bei diesen experimentellen Temperaturen verwendet wird.</li>
	<li>Bereiten Sie Puffer für die Dialyse von gereinigten Biomolekül und Auflösung des Liganden (20 mM Natriumphosphat und 140 mM NaCl-Puffer, pH 7,4, für MN4 und die hier verwendeten Liganden vor).</li>
	<li>Dialyse das Biomolekül gegen mindestens 2 L Puffer mit Dialyse Schläuche mit 0,5 - 1,0 kDa Cutoff.</li>
	<li>Filtern Sie die endgültige Puffer (arbeiten Puffer genannt) durch einen 0,2 µm-Filter, der gründlich mit Puffer equilibriert wurde.</li>
	<li>Abwiegen der gewünschten Massen der Liganden und in gefilterten arbeiten Puffer auflösen. Wenn die gewünschte Liganden Konzentrationen Massen, die zu klein erfordern, genau abzuwägen, stellen Sie eine konzentrierte Liganden-Stammlösung (z. B. 10 X). Anmerkung: Es ist wichtig, dass alle DSC Experimente die gleichen Arbeiten-Puffer für die Probe nutzen und Liganden, d.h.führen Sie niemals ein Experiment wo ist der Liganden in einer anderen Charge arbeiten Puffer als das Biomolekül aufgelöst, als Puffer dadurch Mismatch-Artefakte in den Daten.</li>
	<li>Filtern Sie die Biomolekül-Stammlösung durch einen 0,2 µm-Filter, der gründlich mit arbeiten Puffer equilibriert worden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Biomolekül-Konzentration durch Absorption Messungen (260 nm Nukleinsäuren wie MN4 und 280 nm für Proteine).</li>
	<li>Lagern Sie das vorbereitete Biomolekül und Liganden im Kühlschrank (geeignet für MN4 und die hier verwendeten Liganden) 4 ° C oder-20 oder-80 ° C Wenn die Biomolekül und Liganden Einfrieren und langfristige Lagerung tolerieren erforderlich ist. Degas die Puffer, Biomolekül und Liganden Lösungen in eine Tischplatte vor der Verladung in die DSC degasser (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Entgasung verhindert Blasenbildung in der DSC bei höheren Temperaturen. Luftblasen verursachen Signal Artefakte, die DSC Spitze Formen und Basislinien verdunkeln.</li>
</ol>2. DSC Vorbereitung
<ol><li>Schrauben Sie den Druck-Griff von der DSC (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Führen Sie Silikon Schlauch aus dem Puffer arbeiten und befestigen Sie es an den vorderen Flansch (Metall Öffnung) der Referenz-Kapillare.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Brücke zwischen der Referenz und Sample Kapillaren durch den Anschluss des hinteren Referenz-Flansches an der vorderen Probe-Flansch.</li>
	<li>Bringen Sie ein Stück Silikon Schlauch an den hinteren Probe-Flansch, der mit einer Vakuumleitung angebracht zu einem Abfall Kolben läuft.</li>
	<li>Schalten Sie die Vakuumleitung die DSC mit 200 mL arbeiten Puffer geleert.</li>
	<li>Laden Sie die Referenz-Kapillare der DSC mit Puffer arbeiten. Legen Sie etwa 3-5 cm Abschnitte von Silicon Schläuche auf die Referenz Kapillare Flansche.</li>
	<li>Legen Sie eine 1 mL-Pipettenspitze in den hinteren Flansch Silicon Schläuche. Zeichnen Sie 0,8 mL Puffer arbeiten mit einer Pipette zu und setzen Sie die Pipettenspitze mit Puffer in der vorderen Referenz Flansch Silikon Schlauch.</li>
	<li>Drücken Sie vorsichtig die Pipette Kolben bis auf Pass arbeiten Puffer durch den vorderen Silikon Schlauch in der Referenz-Kapillare und hinauf in des hinteren Flansches befestigt Pipettenspitze. Der Pipette Kolben herunterdrücken Sie, bis die Puffer Arbeitsebene oberhalb der vorderen Silikon Schlauch erreicht, dann lassen Sie die Pipette Kolben bis Puffer Arbeitsebene oberhalb der hinteren Silikon Schlauch erreicht.<ol>
<li>Wiederholen Sie, vorbei an der Arbeit Puffer hin und her, um die Lautstärke in der Referenz-Kapillare blasenfrei zu bereinigen. Hinweis: In der Regel reichen 10 Pässe der Lösung hin und her um alle Bläschen klar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verschließen Sie die hinteren Pipettenspitze mit dem Daumen und ziehen Sie vorsichtig auf die hinteren Pipettenspitze und vorderen Pipette zu entfernen aus der Referenz-Flansche mit dem Silikon-Schlauch befestigt.</li>
	<li>Laden Sie die Probe-Kapillare mit Puffer arbeiten wie in den Schritten 2,6-2,9. Die hinteren Referenz setzen Sie eine schwarzen Kunststoff-Kappe auf und probieren Sie Flansche, verlassen die vorderen Flansche aufgedeckt.</li>
	<li>Befestigen Sie den Druck-Griff.</li>
	<li>Öffnen Sie die DSC Software (siehe Tabelle der Materialien) und das Instrument unter Druck zu setzen, indem Sie auf den roten Pfeil am oberen Rand der Schnittstelle nach oben, nach der Stabilisierung der macht Lesung; die DSC-Kraft wird in ein Feld an der Spitze direkt von der Schnittstelle zusammen mit dem Instrumententemperatur und Luftdruck. Hinweis: Monitor unter Druck setzt die Macht als der DSC zu lesen. Änderungen an der Macht von mehr als ~ 10 µW zeigen Blasenbildung in den Kapillaren, die Artefakte in den Daten verursachen können. Die Lösungen müssen entfernt und entgast weiter, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Equilibrate der DSC mit Puffer arbeiten durch eine Forward- und reverse-Scan durchführen. Sicherstellen Sie im Register "Experimentelle Methode" auf der linken Seite des Bildschirms, dass die "Scan"-Option ausgewählt ist, die DSC im scanning-Modus Temperatur ausgeführt. Hinweis: Experimentelle Parameter sind die Temperatur, die Scan-Bereich, Scan-Rate, niedriger und hoher Temperatur Gleichgewichtherstellung Zeit und Anzahl der Scans.<ol>
<li>Klicken Sie im "Temperaturparameter" Einschub "Experimentelle Methode" auf der Registerkarte zum "Heizen". Geben Sie 1 bis 100 ° C für die untere und obere experimentellen Temperaturen, 1 ° C/min für die Abtastrate und 60 s lang Gleichgewichtherstellung.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Hinzufügen-Serie" unter dem Eingabefeld für den Zeitraum entnehmen. Geben Sie 2 im Feld "Schritte zum Hinzufügen" in das Popup-Fenster (für eine Heizung und eine Kühlung Scan) und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Alternative Heizung/Kühlung". Klicken Sie auf "OK"; die zusätzlichen Scans erscheinen im unteren Teil der Schnittstelle. Kontrollieren, ob die Parameter für jeden Scan als gewünscht.</li>
		<li>Starten Sie das Experiment durch Klicken auf den grünen "play" Knopf an der Spitze der Schnittstelle. Navigieren Sie zu dem gewünschten Ordner und geben Sie einen Dateinamen für die Rettung des Experiments in das Popup-Fenster. Zeigen Sie den Experiment Fortschritt, indem Sie auf die Registerkarte "Daten" auf der rechten Seite der Registerkarte "Experimentieren-Methode".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sammeln von thermolabilen Liganden DSC Datasets
Hinweis: Die minimale Verfahren besteht aus fünf Experimente: Puffer Referenz Experimente mit und ohne Liganden (verwendet für die Basislinie Subtraktion, siehe Diskussion), probieren Sie Experimente mit kostenlosen Biomolekül, das Biomolekül Liganden gebunden und die Liganden gebundenes Biomolekül mit Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung länger.
<ol><li>Führen Sie Referenz-Experimente für die Basislinie Subtraktion der Beispieldaten. Laden die DSC mit Puffer arbeiten in beiden Kapillaren und sammeln Mehrfachscans vorwärts und rückwärts über einen geeigneten Temperaturbereich bei 1 ° C min-1 mit einer oberen (hohe Temperatur) Gleichgewichtherstellung Zeit von 120 s.<ol>
<li>Löschen Sie die bisherigen Puffer Gleichgewichtherstellung Scans aus dem unteren Teil der Schnittstelle durch jeweils einzeln markieren und auf das rote X in der Mitte rechts der Schnittstelle. Fügen Sie die neue Scans durch Klicken auf die Schaltfläche "Hinzufügen-Serie", 20 im Feld für "Schritte zum Hinzufügen" eingeben und das Kontrollkästchen "Alternative Heizung/Kühlung". Klicken Sie auf "OK" und führen Sie das Experiment, indem Sie auf den grünen Play-Button wie oben beschrieben.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1 - 3.1.1 mit arbeiten Puffer, enthält die gewünschte Konzentration des Liganden in beiden Kapillaren der Verweis abrufen Experimente für den Liganden (sammeln Sie zwei separate Experimente mit 120 s und s Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung 600-fache bzw. bei Erwerb der Geschwindigkeitskonstante für thermolabile Liganden Konvertierung verwendet werden). Hinweis: Die hier verwendete Abtastrate sorgt dafür, dass das Biomolekül in späteren Experimenten im thermischen Gleichgewicht in den forward und reverse-Scans (siehe Diskussion). Scannen Sie Preise < 0,1-0,2 ° C min-1 zu laut Thermogramme führen und sind nicht anwendbar bei DSC-Experimenten. Die Temperaturen sollten reichen von weit unter der Schmelztemperatur der freien Biomolekül oberhalb der Schmelztemperatur des Liganden gesättigt Biomolekül gut (~ 20-80 ° C für MN4). Überprüfen Sie die Reproduzierbarkeit der Scans (z. B. 10 nach vorn und 10 reverse Scans für insgesamt 20 ist ausreichend).</li>
		<li>Wenn mehrere Liganden (z. B. Kokain und Chinin), Spülen der DSC mit 200 mL arbeiten Puffer (Wiederholung von Schritt 2.5) zwischen den Läufen zur Liganden aus den Kapillaren zu entfernen und zur Vermeidung von Kreuzkontamination. Hinweis: Es ist hilfreich, um festzustellen, ob die vorherigen Liganden stark, die Kapillarwände absorbiert und ist nicht hinreichend mit Puffer spülen entfernt replizieren Experiment auf das kostenlose Biomolekül nach einem Liganden gebundenes Lauf durchführen. Wenn die Thermogramme für das kostenlose Biomolekül erscheinen zu einem größeren Ausmaßes und höhere Denaturierung Temperatur verschoben werden, nachdem der Liganden-gebunden experimentieren, ist es wahrscheinlich, dass die vorherigen Liganden in der Kalorimeter nach dem Spülvorgang noch vorhanden ist. Entfernen den adsorbierten Liganden durch Inkubation der Kapillaren mit 20 % Contrad-70 für 1 h bei 60 ° C mit Kunststoffkappen und Druck Griff aus. In der DSC-Software ändern der experimentellen Modus in "Isotherm" unter die Versuchsmethode Registerkarte und wählen Sie 3.600 s für die Dauer und 60 ° C für die Isotherme Temperatur mit Null zum Gleichgewichtherstellung Mal betrat. Klicken Sie auf "Experimentelle Methode hinzufügen". Die Isotherme Experiment erscheint im unteren Teil des Bildschirms. Spülen Sie nach Beendigung wird das Instrument mit 2 L entionisiertem Wasser und wiederholen Sie ab Schritt 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie Probe Experimente unter Verwendung derselben DSC laden Prozedur und experimentellen Parameter wie die Referenz scans. Sicherstellen Sie für den kostenlosen Biomolekül Datensatz, dass die Referenz-Kapillare der Arbeit Puffer enthält, während die Probe Kapillare das kostenlose Biomolekül in der gewünschten Konzentration in Arbeit Puffer enthält.<ol>
<li>Sicherzustellen Sie für die Liganden gebundenes Experimente, dass die Liganden im Puffer arbeiten in der Referenz-Kapillare, und das Biomolekül plus Liganden in Arbeit-Puffer in der Probe-Kapillare sind. Spülen Sie das System zwischen den Zugaben von verschiedenen Liganden wie in Schritt 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine zusätzliche Experiment mit das Biomolekül an thermolabilen Liganden gebunden, wo ist die hohe Temperatur Gleichgewichtherstellung auf 600 erhöht s und anderen experimentellen Parameter sind identisch mit Schritt 3.2.1. Hinweis: Die Dauer der Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung für das zweite Liganden gebundenes Experiment ist einfach um sicherzustellen, dass die Liganden schneller erschöpft als das kurze Gleichgewichtherstellung Zeit Experiment ausgewählt. Wenn die Liganden gebundenes Gipfel vom ersten Verfall langsam als Funktion des Scan-Nummer experimentieren (z. B.die Unterschiede zwischen aufeinanderfolgenden Peak Maxima sind ≤ 0,5 ° C), 10 bis 20 fache erhöht in der Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung Periode zur Schätzung adäquat zum Abbau des Liganden während des zweiten Versuchs. Die genaue Berechnung der Rate konstant für die Liganden Konvertierung erfordert, dass das zweite Experiment schnelleren Erschöpfung des Liganden relativ zur ersten hat. Die Liganden-Konzentrationen extrahiert aus der globalen Analyse der zwei Experimente werden ähnliche und daher unbrauchbar, wenn die Liganden Erschöpfung nicht ausreichend in das zweite Experiment beschleunigt wird.</li>
</ol>4. Datenverarbeitung
<ol><li>Öffnen die DSC experimentieren Dateien in der DSC-Daten-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien) und die rohe Kraft-Daten als Tabellen exportieren.</li>
	<li>Importieren Sie die Tabellen mit den rohen Leistungsdaten in Software für Daten passend.</li>
	<li>Grundlinie subtrahieren Sie die Beispieldaten durch Subtraktion Puffer Leistungsdaten von der freien und gebundenen Liganden Biomolekül Experimente. Hinweis: Für das Experiment thermolabilen Liganden sinkt die Konzentration der ersten Liganden mit jedem Scan. Daher ist es ideal, um den Puffer Scan 1 Probe Scan 1 subtrahieren, und so weiter. Wir haben festgestellt, dass die Puffer-Scans mit Kokain nicht merklich ändern wie die Liganden-Konvertierung wird fortgesetzt und kann daher ein einzigen thermolabilen Liganden Puffer Scan alle thermolabilen Liganden gebundene Daten subtrahieren verwendet werden.</li>
	<li>Konvertieren Sie die Grundlinie abgezogen macht Beispieldaten in Wärmekapazität. Hinweis: Die Konvertierung erfordert das Biomolekül teilweise spezifische Volumen, das schätzungsweise14,15,16sein können. Die Gleichung für die Umwandlung von Strom zu Wärmekapazität wurde zuvor17beschrieben.</li>
</ol>(5) Datenanalyse
<ol><li>Weltweit passen Sie das kurze Gleichgewichtherstellung Zeit thermolabilen Liganden gebundenes Wärmekapazität Dataset mit einem einzigen Satz der Basislinie, Liganden-Konzentration, Falt- und Ligand verbindliche Parameter wie zuvor beschrieben4.</li>
	<li>Wiederholen Sie die globale fit für die langen Gleichgewichtherstellung Zeit Dataset zur Berechnung der Rate konstant für thermolabile Liganden Konvertierung wie zuvor beschrieben4.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Modifikationen und Fehlerbehebung
Die Details der globalen passende Analyse verwendet in Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden4beschrieben. Hier beschreiben wir die praktischen Aspekte der Durchführung und Analyse von DSC verbindliche Experimente mit thermolabilen Liganden. Beachten Sie, dass Basispläne DSC erhalten für thermolabile Liganden allein von den Liganden subtrahiert wird + Biomolekül Dat...

Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung biomolekularen Bindung und faltende Wechselwirkungen1,2,3. Die Stärken der DSC gehören seine Fähigkeit zur Bindung und Falten Mechanismen aufzuklären und zu der entsprechenden thermodynamischen Parameter2,3. Darüber hinaus DSC kann in Lösung in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und erfordert keine Kennzeichnung der Biomolekül oder Liganden, z. B.mit Fluorophore, Spin-Etiketten oder nuklearen Isotope4. Das Gerät scannt in Temperatur, Messung der Menge an Wärme benötigt, um das Biomolekül in an- und Abwesenheit des Liganden zu denaturieren. Die daraus resultierende Thermogramme werden verwendet, um die thermodynamischen Parameter den Liganden binden und Faltung Prozesse zu extrahieren. DSC oder anderen thermodynamischen Verfahren übermittelten Informationen ist entscheidend für die Führung der Gestaltung der Medikamente gegen Biomoleküle1,5,6,7,8. Jedoch das wiederholte Scannen zu hohen Temperaturen (~ 60-100 ° C) kann problematisch sein. Zum Beispiel viele pharmazeutisch wichtige Verbindungen zu unterziehen, Rearrangement oder Zersetzung auf anhaltende Exposition gegenüber hohen Temperaturen9,10,11, d. h., sie sind thermolabilen. Prüfung von verbindlichen Interaktionen von DSC in der Regel erfordert Mehrfachscans vorwärts und rückwärts um die Reproduzierbarkeit der Thermogramm für thermodynamische Analysen12zu überprüfen. Thermische Umwandlung von einer anfänglichen Liganden an einen sekundären Formen mit veränderten Bindungseigenschaften führt zu ausgeprägten Unterschiede in Form und Position der aufeinanderfolgenden Thermogramme, da verringert sich die Konzentration des ersten Liganden mit jedem Scan während der thermische Umwandlungsprodukte ansammeln. Diese Datensätze sind nicht traditionelle Analysen zugänglich.
Vor kurzem haben wir eine globale Anpassungsmethode für thermolabile Liganden DSC-Datasets, die die Gesamtheit der thermodynamischen Parameter für die biomolekularen Faltung und bindende Wechselwirkungen aus einem einzigen Liganden gebundenes Experiment bezogen auf ergibt die erforderlichen Thermogramm für die kostenlose Biomolekül-4. Die Analyse reduziert den experimentellen Probe vorgeschriebenen ~ 10-fach im Vergleich zu standard-DSC-Ansätze. Wir haben entfielen für Liganden thermische Umwandlung von vorausgesetzt, dies geschieht während der Hochtemperatur-Teil für jeden Scan wo das Thermogramm nicht Liganden-Konzentration hängt. Daher ist die Liganden-Konzentration eine konstante innerhalb des Teils des Thermogramm, die verwendet wird, um thermodynamische Parameter zu extrahieren. Wir zusätzlich gezeigt, wie die Geschwindigkeitskonstante für Ligand thermische Umwandlung erreicht werden kann, durch eine ergänzende Experiment mit Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung länger ausführen. Für Systeme, wo Liganden thermische Umwandlung weniger temperaturabhängig (d.h.auftretenden spürbar bei allen Temperaturen), die Analyse kann geändert werden, um Variable Liganden Konzentrationen enthalten. Hier zeigen wir dieses Verfahren zur DNA-Aptamer MN4 in Anwesenheit von thermolabilen Liganden Kokain, die schnell zum Benzoylecgonin bei hohen Temperaturen Konvertiten (> 60 ° C). Chinin wird als Negativkontrolle für Liganden Thermolability verwendet, da es Konvertierung bei diesen experimentellen Temperaturen nicht unterziehen und auch an MN4 bindet. Wir beschreiben den Erwerb von thermolabilen Liganden DSC Datasets und ihre Analyse nachgeben thermodynamischen und kinetischen Parameter der Faltung, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Entjoinisiertes Wasser für</td> die <td>Molekularbiologie Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0,2 Mikron sterile Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa Zentrifugalfilter</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschläuche 0,5-1,0 kDa Cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschläuche</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>DSC-Flanschkappen aus Kunststoff</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Kokain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Chinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III Mikrokalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun Software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze Software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

messprofile biomolekularen dsc mit thermolabilen liganden schnell zu charakterisieren, falt- und bindende wechselwirkungen

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Quantifizierung der thermodynamischen Parameter für biomolekulare Falt- und bindender Wechselwirkungen. Diese Information ist entscheidend bei der Gestaltung neuer Arzneimittel zur Behandlung. Allerdings sind viele pharmazeutisch relevante Liganden chemisch instabil bei den hohen Temperaturen im DSC-Analysen verwendet. So messen bindender Wechselwirkungen wird schwierig, da die Konzentrationen von Liganden und thermisch umgewandelt Produkte innerhalb der Kalorimeter Zelle ständig in Bewegung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit thermolabilen Liganden und DSC für schnell Informationsbeschaffung thermodynamischen und kinetischen auf die Falten, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse. Wir haben unsere Methode auf die DNA-Aptamer MN4 angewandt, die das Kokain thermolabilen Liganden bindet. Verwenden eine neue globale Fitting-Analyse, die Konten für thermolabile Liganden Umwandlung, die Gesamtheit der Faltung und Bindungsparameter stammen aus ein paar DSC Experimente. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Geschwindigkeitskonstante für thermolabile Liganden Konvertierung mit nur einem zusätzlichen DSC Dataset bezogen werden kann. Die Leitlinien für die Identifizierung und Analyse von Daten aus mehreren komplizierter Szenarien werden vorgestellt, einschließlich irreversible Aggregation der Biomolekül, langsam Falten, langsame verbindliche und schnelle Entleerung des thermolabilen Liganden.

Repräsentative Daten für den DSC thermolabilen Liganden sind in Abbildung 1dargestellt. Die Position und Höhe des thermolabilen Liganden gebundenes Peaks rückt sukzessive nach unten, die das ungebundene Biomolekül thermolabile Liganden mit jedem Scan (Abbildung 1a) erschöpft ist. Das kostenlose Denaturierung-Profil dient als Referenz für den Endpunkt der thermolabilen Liganden Umwandlung (Abbildung 1 b</stron...

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für schnelle Charakterisierung der biomolekularen Faltung und Interaktionen mit thermolabilen Liganden mit differential scanning Kalorimetrie verbindlich.

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, die thermodynamischen Parameter, die biomolekulare Faltungs- und Bindungswechselwirkungen steuern, mittels differentieller Scanning-Kalorimetrie (DSC) unter Verwendung eines thermolabilen Liganden mit nur zwei Experimenten zu ermitteln. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Biokalorimetrie und Wirkstoffdesign zu beantworten, beispielsweise: Wie groß sind die relativen Werte der thermodynamischen Parameter, die die Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen und stark bindenden Inhibitoren bestimmen? Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass in einem einzigen Experiment eine vollständige Liganden-Titration durchgeführt wird, wodurch eine schnelle Bestimmung der thermodynamischen Parameter aus der globalen Anpassungsanalyse möglich ist.Bereiten Sie zunächst Puffer zur Dialyse des gereinigten Biomoleküls in eine Lösung von Liganden vor. Dialysieren Sie das Biomolekül gegen mindestens einen Liter Puffer unter Verwendung von Dialyse-Schläuchen mit einer Grenzgröße von 0,5 bis 1,7 Kilodalton. Der wichtigste Schritt zur Erzielung von hochwertigen DSC-Daten ist die Dialyse des Biomolekül-Liganden gegen den gewünschten Puffer.Dadurch wird sichergestellt, dass keine durch Pufferdiskrepanzen verursachten Artefakte in den DSC-Daten vorhanden sind. Filtern Sie den endgültigen Puffer, der als Arbeitspuffer bezeichnet wird, durch einen 0,2-Mikron-Filter, der gründlich mit Puffer equilibriert wurde. Wiegen Sie die gewünschten Massen der Liganden ab und lösen Sie sie in gefiltertem Arbeitspuffer auf.Wenn die gewünschten Ligandkonzentrationen Massen erfordern, die zu gering sind, um sie genau abzuwiegen, bereiten Sie eine konzentrierte Ligand-Stammlösung zu. Filtern Sie die Biomolekül-Stammlösung durch einen 0,2-Mikron-Filter, der gründlich mit Arbeitspuffer equilibriert wurde. Anschließend bestimmen Sie die Biomolekülkonzentration durch Absorptionsmessungen.Bewahren Sie das hergestellte Biomolekül und Ligand bei vier Grad Celsius im Kühlschrank auf oder bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius, falls das Biomolekül und die Liganden Einfrieren vertragen und eine Langzeitlagerung erforderlich ist. Entgasen Sie den Puffer sowie die Molekül- und Ligandenlösungen in einem Tischentgaser, bevor Sie sie in den differentiellen Scanning-Kalorimeter (DSC) geben. Lösen Sie den Druckgriff vom DSC.Anschließend führen Sie eine Silikonschlauchleitung von der Arbeitspufferlösung und befestigen sie an der vorderen Flanschverbindung der Referenzkapillare. Stellen Sie eine Verbindung zwischen der Referenz- und der Probenkapillare her, indem Sie den hinteren Referenzflansch mit dem vorderen einfachen Flansch verbinden. Danach befestigen Sie ein Stück Silikonschlauch am hinteren Probenflansch, das zu einem Abfallkolben führt, an dem eine Vakuumleitung angeschlossen ist.Schalten Sie die Vakuumleitung ein, um die DSC mit 200 Milliliter Arbeitspuffer zu spülen. Bringen Sie zunächst etwa drei bis fünf Zentimeter lange Abschnitte aus Silikonschlauch an den Referenzkapillarflanschen an. Stecken Sie danach eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze in den Silikonschlauch des hinteren Flansches.Entnehmen Sie 0,8 Milliliter Arbeitspuffer mit einer Pipette und führen Sie die Pipettenspitze mit Puffer in die Silikonleitung des vorderen Referenzflansches ein. Drücken Sie den Pipettenkolben vorsichtig herunter, um den Arbeitspuffer durch die vordere Silikonleitung in die Referenzkapillare und weiter in die angeschlossene Pipettenspitze des hinteren Flansches zu leiten. Drücken Sie den Pipettenkolben so lange herunter, bis der Arbeitspufferstand knapp über der vorderen Silikonleitung liegt, und lassen Sie dann den Pipettenkolben los, bis der Arbeitspufferstand knapp über der hinteren Silikonleitung angelangt ist.Setzen Sie das Hin- und Herbewegen des Arbeitspuffers in der Referenzkapillare fort, um die Kapillare von Blasen zu befreien. Danach verschließen Sie die hintere Pipettenspitze mit dem Zeigefinger und ziehen vorsichtig an der hinteren Pipettenspitze und der vorderen Pipette, um sie zusammen mit dem Silikonrohr von den Referenzflanschen zu lösen. Füllen Sie die Probenkapillare erneut mit Arbeitspuffer wie zuvor beschrieben. Setzen Sie eine schwarze Kunststoffkappe auf die hinteren Referenzproben-Flansche, wobei die vorderen Flansche unbedeckt bleiben. Befestigen Sie den Druckgriff am DSC und öffnen Sie dann die DSC-Software. Drücken Sie die rote Pfeiltaste nach oben oben in der Schnittstelle, sobald die Leistungsanzeige stabil ist, um das Gerät unter Druck zu setzen. Die DSC-Leistung wird in einem Kästchen oben rechts in der Schnittstelle zusammen mit der Instrumententemperatur- und Druckanzeige angegeben.Äquilibrieren Sie die DSC mit dem Arbeitspuffer, indem Sie im Reiter „experimentelle Methode“ auf der linken Seite des Bildschirms einen Vorwärts- und Rückwärts-Scan durchführen. Stellen Sie sicher, dass die Scannoption ausgewählt ist, um die DSC und den Temperatur-Scannmodus auszuführen. Klicken Sie im eingeblendeten Bereich für die Temperaturparameter unter dem Reiter „experimentelle Methode“ auf die Schaltfläche zum Erhitzen.Geben Sie 1 und 100 Grad Celsius für die untere und obere Versuchstemperatur, ein Grad Celsius pro Minute für die Abtastgeschwindigkeit und 60 Sekunden für die Einstellzeit ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche „AddSeries“ unter dem Eingabefeld für die Einstellzeit. Geben Sie im Popup-Fenster zwei in das Feld „Schritte hinzufügen“ ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen „Alternierendes Erhitzen/Kühlen“.Klicken Sie auf „OK“. Die hinzugefügten Scans erscheinen im unteren Bereich der Oberfläche. Überprüfen Sie, ob die Parameter für jeden Scan wie gewünscht eingestellt sind. Starten Sie das Experiment, indem Sie auf die grüne Wiedergabetaste oben in der Oberfläche klicken.Navigieren Sie zum gewünschten Fenster und geben Sie im Popup-Fenster einen Dateinamen zur Speicherung des Experiments ein. Verfolgen Sie den Fortschritt des Experiments, indem Sie auf den Datenreiter rechts neben dem Reiter der Experimentmethode klicken. Führen Sie Referenzexperimente zur Basislinienkorrektur der Probendaten durch, indem Sie die DSC mit Arbeitspuffer in beiden Kapillaren erneut befüllen.Sammeln Sie mehrere Vorwärts- und Rückwärts-Scans über einen geeigneten Temperaturbereich bei einem Grad Celsius pro Minute mit einer Aufwärm-Equilibrationszeit von 120 Sekunden. Löschen Sie die vorherigen Puffer-Equilibrations-Scans aus dem unteren Bereich der Schnittstelle, indem Sie jeden einzeln markieren und auf das rote X in der Mitte rechts der Schnittstelle klicken. Fügen Sie die neuen Scans hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche AddSeries klicken, 20 in das Feld für hinzuzufügende Schritte eingeben und das Kontrollkästchen Alternierendes Erhitzen/Kühlen aktivieren.Klicken Sie dann auf „OK“ und führen Sie das Experiment wie zuvor durch Anklicken des grünen Wiedergabeknopfes aus. Wiederholen Sie diese Schritte mit Arbeitspuffer, der die gewünschte Ligandenkonzentration in beiden Kapillaren enthält, um die Referenzexperimente für den Liganden zu erhalten. Führen Sie zwei separate Experimente durch, die zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante für die thermolabile Umwandlung verwendet werden.Stellen Sie für den Datensatz mit freien Biomolekülen sicher, dass die Referenzkapillare den Arbeitspuffer enthält, während die Probenkapillare das freie Biomolekül in der gewünschten Konzentration im Arbeitspuffer enthält. Führen Sie anschließend die Probendurchläufe mit dem gleichen DSC-Ladeverfahren und denselben experimentellen Parametern wie bei den Referenzmessungen durch. Bei den ligandengebundenen Experimenten muss der Ligand im Arbeitspuffer in der Referenzkapillare enthalten sein, während die Probenkapillare das Biomolekül zusammen mit dem Liganden im Arbeitspuffer enthält.Spülen Sie das System zwischen der Zugabe unterschiedlicher Liganden wie zuvor. Führen Sie ein zusätzliches Experiment mit dem Biomolekül, das an den thermolabilen Liganden gebunden ist, durch, wobei die Hochtemperatur-Gleichgewichtsphase auf 600 Sekunden verlängert wird und alle anderen experimentellen Parameter unverändert bleiben. Setzen Sie die Datenauswertung und -analyse wie im Textprotokoll beschrieben fort.Die Position und Höhe des Peaks des thermolabilen Liganden verschiebt sich sukzessive in Richtung der des ungebundenen Moleküls, während der thermolabile Ligand bei jedem Scan verbraucht wird. Das 3D-Reifungsprofil dient als Referenz für den Endpunkt der Umwandlung des thermolabilen Liganden. Eine Verlängerung der Hochtemperatur-Gleichgewichtsphase führt im Vergleich zu Datensätzen mit kurzer Gleichgewichtsphase zu stärker ausgeprägten Abnahmen der Konzentration des thermolabilen Liganden bei jedem Scan.Unter Verwendung der optimierten globalen Fit-Konzentrationsparameter aus den beiden Datensätzen kann die Geschwindigkeitskonstante für die Ligandenkonversion bei der hohen Gleichgewichtstemperatur berechnet werden. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 72 Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Biomolekül-Liganden ebenfalls zu entgasen und die DSC-Kapillaren mit der Lade-Pipette von Blasen zu befreien, um Datenartefakte zu vermeiden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und den Artikel gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie DSC-Experimente an Biomolekülen durchgeführt werden, sowie für die Anwendung globaler Anpassungsanalysen, um thermodynamische Parameter, die Faltungs- und Bindungswechselwirkungen steuern, schnell zu ermitteln. Obwohl diese Methode Einblicke in Gleichgewichts-Faltungs- und Bindungswechselwirkungen ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf Biomoleküle, die langsames Faltungverhalten und/oder Ligandenbindungs-Kinetik aufweisen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein allgemeines Protokoll für den Einsatz von isothermen Titrationskalorimetrie, um die Bindung der Thermodynamik für biologische Systeme mit moderaten Bindungsaffinitäten Monitor dargestellt wird.

Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität

Dieses Video demonstriert die dynamische Differenzkalorimetrie — eine Technik zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Biomolekül und einem Liganden. Die Bindung eines DNA-Aptamers und eines thermolabilen Liganden wird untersucht, indem wiederholte Heiz- und Abkühlzyklen auf die Probe angewendet und Scans für die thermodynamische Analyse durchgeführt werden.

Dynamische Differenzkalorimetrie zur Untersuchung der Interaktion zwischen DNA-Aptamer und thermolabilen Liganden

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Die dynamische Differential-Fluorimetrie ist eine weit verbreitete Methode zum Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle auf Wechselwirkungen mit Proteinen. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um diese Analysen zu erweitern, um eine Schätzung der Dissoziationskonstante zwischen einem kleinen Molekül und seinem Proteinpartner zu erhalten.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

Differential-Scanning-Kalorimetrie misst die thermische Übergangstemperatur (en) und die gesamte Wärmeenergie benötigt, um ein Protein zu denaturieren. Die erhaltenen Ergebnisse werden verwendet, um die thermische Stabilität von Proteinantigenen in Vakzin-Formulierungen zu beurteilen.

Differential Scanning Calorimetry - Eine Methode zur Beurteilung der thermischen Stabilität und Konformation von Protein-Antigen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Herstellung und Reinigung von Proteinen, die gekennzeichnet sind mit stabilen Isotopen und anschließende Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Spektroskopie der Kernspinresonanz (NMR) und MicroScale Thermophorese (MST) Experimente.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Die mikroskalige Thermophorese erhält schnell Bindungskonstanten bei geringen Materialkosten. Entweder gekennzeichnete oder markierungsfreie mikroskalige Thermophorese ist kommerziell erhältlich; Die markierungsfreie Thermophorese ist jedoch nicht in der Lage, die Vielfalt der Wechselwirkungsmessungen zu erreichen, die mit fluoreszierenden Markierungen durchgeführt werden können. Wir bieten ein Protokoll für markierte Thermophoresemessungen an.

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

Die Überwachung von Änderungen der Schmelztemperatur eines Zielproteins(z. B.Thermal Shift Assay, TSA) ist eine effiziente Methode zum Screening von Fragmentbibliotheken von einigen hundert Verbindungen. Wir präsentieren ein TSA-Protokoll, das eine robotergestützte Nano-Differential Scanning Fluorimetry (Nano-DSF) zur Überwachung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz und der Lichtrückstreuung für das Fragmentscreening implementiert.

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zum Nachweis der Bindung zwischen Verbindungen und Proteinmolekülen, die die Vorteile eines minimalen Proteinprobenverlusts und einer hohen Datengenauigkeit bietet.

Nachweis der CD40-Protein-Umbelliferon-Wechselwirkung mittels dynamischer Differenzialfluoreszenz

Hier stellen wir den Thermal Shift Assay vor, eine fluoreszenzbasierte Hochdurchsatztechnik, mit der die Bindung kleiner Moleküle an interessante Proteine untersucht wird.

Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Lernen Sie die schnelle Charakterisierung biomolekularer Falt- und Bindungswechselwirkungen mit differentieller Scanningkalorimetrie und thermolabilen Liganden. Diese Methode ermöglicht die effiziente Extraktion thermodynamischer Parameter für die Biokalorimetrie und Arzneimittelentwicklung.

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

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