Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

Das übergeordnete Ziel dieses Verhaltensaufzeichnungsaufbaus und -protokolls ist es, die populationsbasierte chemosensorische Präferenz von C Elegans für lösliche Verbindungen unter Verwendung eines Multi-Kamera-Videoerfassungssystems zu quantifizieren, gefolgt von einer automatisierten Videoanalyse. Diese Methode kann die neurobiologische Forschung von C Elegans erleichtern, indem sie eine schnellere und standardisiertere Verhaltensanalyse genetischer Mutanten ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere Replikate gleichzeitig unter identischen Bedingungen untersucht werden können, während die zeitliche Dynamik der Reaktion der Nematodenpopulation auf lösliche Signale überwacht wird.

Die Montage der Verhaltenskammer wird von Christopher Cronin, einem Wissenschaftler dieses Labors, demonstriert. Bereiten Sie zunächst die Stoffabdeckungen, Kamerahalterungsstangen, Eckhalterungen, Extrusionsstangen und die Montage der Kamerahalterung vor, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Beginnen Sie mit den Endstangen, die an der Mittelstange befestigt sind, und befestigen Sie den Kameraständer und die Holster an der Kamerahalterung.

Bauen Sie als Nächstes den Verhaltenskammerrahmen zusammen. Beginnen Sie damit, vier 1-Fuß-Extrusions-Aluminiumstangen an einer quadratischen Polyesterplatte zu befestigen. Schieben Sie eine Stange auf die beiden T-Muttern der Kugel des Stoffblatts und zentrieren Sie die Stange entlang der Stoffbreite.

Ziehen Sie die Befestigungselemente fest, um die Stoffbahn an jeder Stange zu befestigen. Breiten Sie die quadratische Polyesterplatte mit den vier angebrachten Aluminiumstangen auf der Arbeitsfläche aus. Schieben Sie dann acht Eckhalterungen auf die Oberseiten der vier Aluminiumstangen, eine an jedem Ende jeder Stange.

Positionieren Sie die Eckhalterungen auf den Stangen, wobei die vertikalen Schenkel bündig mit dem Ende der Stangen abschließen, und befestigen Sie sie, indem Sie die Schrauben in den T-Muttern festziehen. Stellen Sie an jeder Ecke ein einfußiges Aluminiumprofil aufrecht auf und schieben Sie das Profil über die T-Muttern an den beiden Eckhalterungsbeinen. Befestigen Sie dann die aufrechte Stange an den horizontalen Stangen, indem Sie die Befestigungselemente festziehen und so die beiden benachbarten horizontalen Stangen verbinden.

Schieben Sie die losen T-Muttern der H-förmigen Kamerahalterung nach unten in die Pfosten des Rahmens. Lassen Sie das H ganz nach unten gleiten, damit es auf den Eckhalterungen an jeder Ecke des Rahmens aufliegt. Befestigen Sie die Kamerahalterung, indem Sie die Schrauben der vier Eckhalterung festziehen.

Verwenden Sie als Nächstes die letzten vier Ein-Fuß-Extrusions-Aluminiumstangen, um die untere Schicht der Kammer zusammenzubauen. Positionieren Sie die Eckhalterungen so, dass die Beine der Halterungen bündig mit dem Ende der Stange abschließen, und ziehen Sie die Schrauben fest, um sie zu sichern. Schieben Sie dann die Stangen zwischen die Rahmenpfosten mit den losen T-Muttern in die Ständerkanäle

Positionieren Sie die Stange so, dass sich die Oberkanten der Eckhalterungen einen Zentimeter unter dem offenen Ende der Pfosten befinden, und befestigen Sie sie, indem Sie die Schrauben der Eckhalterung festziehen. Schieben Sie anschließend die T-Muttern der vier rechteckigen Polyesterplatten nach unten in die Kanäle der aufrechten Extrusionsstangen, um die Seiten der Kammer abzudecken, und ziehen Sie die Befestigungselemente fest, um sie zu sichern. Wählen Sie eine Seite als Tür für den Zugang zum Inneren der Kammer und entfernen Sie die beiden Schrauben und T-Muttern an der unteren Schicht der Kammer.

Platzieren Sie eine Plastikkappe am oberen Ende jeder Ecke, die als Füße für den fertigen Rahmen dient. Drehen Sie den Rahmen mit der rechten Seite nach oben und setzen Sie zwei Plattenhalter pro Folie in die Rahmenabstandsschicht ein und drehen Sie sie, um sie zu fixieren. Legen Sie dann ein 12 x 12 Zoll großes Stück durchsichtiges Acryl auf die Plattenhalter, um eine Bühne für die Assay-Platten zu schaffen.

Positionieren Sie abschließend die Kamera- und Bühnenvorlage wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Legen Sie am Tag vor dem Experiment 28 leere 35-Millimeter-Platten in Stapeln von fünf oder weniger auf eine ebene Fläche. Füllen Sie jede Assay-Platte mit fünf Millilitern Nematoden-Wachstumsmedien-Agar und lassen Sie die Assay-Platten aufrecht mit abgenommenen Deckeln über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

Schalten Sie am Tag des Experiments die Hintergrundbeleuchtung ein, starten Sie den Computer und starten Sie die Videoaufnahmesoftware der Mikroskopkamera. Schließen Sie die Mikroskopkamera an den Computer an und klicken Sie auf das nummerierte Kamera-Miniaturbild oben im Softwarefenster, um den Live-Feed der Kamera anzuzeigen. Um die Einstellungen für die Videoaufzeichnung anzupassen, ziehen Sie das Menü "Videoformat" in der oberen linken Ecke des Kamera-Feeds herunter und wählen Sie MJPG 1280x1024 aus.

Ziehen Sie als Nächstes das Ordnermenü neben dem Menü für das Videoformat herunter und wählen Sie einen Ordner aus, in dem die Videodateien gespeichert werden sollen. Klicken Sie auf das Symbol für die automatische Belichtung in der oberen rechten Ecke des Kamera-Feeds und schalten Sie die automatische Belichtung aus. Klicken Sie dann auf das LED-Symbol direkt rechts neben dem Symbol für die automatische Belichtung, um die eingebauten LEDs der Mikroskopkamera auszuschalten.

Klicken Sie auf das nebenstehende Einstellungssymbol und wählen Sie Monochrom. Maximieren Sie den Kontrast und passen Sie die Helligkeit an. Richten Sie eine Vorlage für die Platzierung einer Lösung über der Vorlage für die Ausrichtung der Bühnenplatte aus und klicken Sie auf das Symbol für die Zeitraffer-Videoaufzeichnung auf der linken Seite des Kamera-Feeds.

Geben Sie fünf Sekunden für die Dauer und eine Sekunde für das Intervall ein, um ein fünf Sekunden langes Kalibrierungsvideo mit einem Bild pro Sekunde aufzunehmen. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Glaspipette, um 1,2 Milliliter Nematoden-Wachstumsmedienpuffer zu einer Platte mit synchronisierten Würmern hinzuzufügen, und bewegen Sie die Platte vorsichtig, um die Würmer in den Puffer zu verdrängen. Pipettieren Sie den Puffer aus der Platte und geben Sie die Würmer im Puffer in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen.

Lassen Sie die Röhren ein bis zwei Minuten stehen, damit sich die Würmer am Boden absetzen können. Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze aus Kunststoff, um so viel Waschpuffer wie möglich von den Röhrchen zu entfernen, ohne das Pellet aus aggregierten Würmern am Boden der Röhrchen zu stören. Füllen Sie das Röhrchen mit einem Milliliter sauberem Nematoden-Wachstumsmedienpuffer und wiederholen Sie den Waschvorgang noch zwei weitere Male.

Kleben Sie als Nächstes eine Lösungsplatzierungsschablone auf den Tisch eines Präpariermikroskops. Platzieren Sie dann einen Streifen doppelseitiges Klebeband auf beiden Seiten einer Plattenausrichtungsschablone. Richten Sie den Umfang der Assay-Platte am Kreis auf der Plattenausrichtungsschablone aus und drücken Sie sie nach unten, bis die Schablone an der Unterseite der Platte haftet.

Richten Sie dann die Marker für die Assay-Plattenschablone mit den Markern für die Lösungsplatzierungsschablone am Präpariermikroskop aus. Verwenden Sie anschließend eine P2-Pipette, um jeweils einen Mikroliter des M13-Puffers in den Quadranten eins und vier zu platzieren. Verwenden Sie eine neue Spitze, um jeweils einen Mikroliter 10 millimolare CuCl2-Lösung in die Quadranten zwei und drei zu geben.

Verwenden Sie eine Glaspasteurpipette, um die gewaschenen Würmer auf die Testplatten zu übertragen, sobald die Lösungstropfen vollständig in den Agar aufgenommen wurden. Geben Sie einen Tropfen Würmer auf die Bereiche über und unter den kreisförmig behandelten Regionen. Falten Sie das Gewebe viermal und verwenden Sie die stumpfe Kante, um überschüssigen Waschpuffer auf den Assay-Platten zu absorbieren.

Ordnen Sie die Assay-Platten sofort unter den Mikroskopkameras in der Verhaltenskammer an, indem Sie die Nummern der Schablonenecken ausrichten. Warten Sie zwei bis drei Minuten, damit sich die Würmer an die Assay-Platten gewöhnen können. Klicken Sie dann auf das Symbol für die Zeitraffer-Videoaufzeichnung auf der linken Seite des Kamera-Feeds und geben Sie 10 Minuten für die Dauer und eine Sekunde für das Intervall ein, um ein 10-minütiges Video mit einem Bild pro Sekunde aufzunehmen.

Klicken Sie abschließend auf Start, um die Videoaufnahme zu starten. Für jeden Videoframe zählt die Einstellungsindexfunktion die Anzahl der Wurmpixel in jedem Interessenbereich und berechnet den Prozentsatz eines Pixels an der Gesamtzahl der Pixel im Interessenbereich. Hier sind die Präferenzindexwerte dargestellt, die für verschiedene Genotyp- und Behandlungspaare erhalten wurden.

Ein positiver Präferenzindexwert deutet auf eine Anziehungskraft auf die Behandlung hin, während ein negativer Präferenzindexwert auf eine Abstoßung hinweist. Ein Präferenzindex von 0,02 wird erhalten, wenn die M13-Pufferlösung sowohl in den interessierenden Kontroll- als auch in den experimentellen Bereich platziert wurde, was zeigt, dass es keine räumliche Verzerrung gibt. Diese Grafik zeigt auch, dass N2-Würmer die Kupferionen stark mieden, was zu einem Präferenzindex von 0,67 führte.

Darüber hinaus zeigten osm-3, die bei der Bildung sensorischer Zillien defekt sind, und ocr-2-Mutanten, die bei ASH-vermittelten nozizeptiven Reaktionen defekt sind, eine verminderte Vermeidung und sogar eine leichte Anziehungskraft auf Kupferionen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, schnell, aber auch reibungslos und konsistent zu arbeiten. Der Aufzeichnungsaufbau und das Assay-Protokoll können leicht angepasst werden, um populationsbasierte Verhaltensreaktionen zu charakterisieren, die sich aus den Wechselwirkungen zwischen verschiedenen sensorischen Varietäten von C Elegans ergeben.