3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

Das übergeordnete Ziel der Herstellung elastischer makroporöser 3D-Mikrokryogele mittels Kryogelierung besteht darin, die injizierbare regenerative Therapie und das In-vitro-Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening zu erleichtern. Dieses Video stellt die Protokolle zur Herstellung vielseitiger 3D-Mikrogewebe vor und wendet sie in der regenerativen Therapie und im Wirkstoffscreening an. Die regenerative Therapietechnik verbessert die Stammzellretention, das Überleben und die therapeutischen Funktionen nach der Injektion in eine Wundstelle.

Das Wirkstoffscreening wird auch aufgrund der einfachen Handhabung und des Potenzials für Hochdurchsatz-Screenings verbessert. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in der 3D-Kultur sind, aufgrund der komplizierten Protokolle zu kämpfen. Diese Technik vereinfacht die 3D-Kultur und bietet Forschern eine bessere Kontrolle über das resultierende 3D-Mikrogewebe.

der Demonstration dieser Verfahren werden Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian und You Zhifeng, vier Doktoranden aus unserem Labor, helfen. Waschen Sie die PMMA-Mikroschablonen-Array-Chips mit entionisiertem Wasser, um die von der Lasergravur verbleibenden Rückstände zu entfernen. Trocknen Sie dann die Mikroschablonen-Array-Chips bei 60 Grad Celsius.

Anschließend werden die getrockneten Späne in Vierergruppen in einem Plasmareiniger behandelt. Lassen Sie zunächst die Vakuumpumpe zwei Minuten lang laufen. Verwenden Sie dann drei Minuten lang 18 Watt HF-Leistung, um die Hydrophilie der Chips zu erhöhen.

Stellen Sie nun einen Milliliter Gelatinevorläuferlösung für jeweils fünf Chips her. Lösen Sie die Gelatine in einem 60 Grad heißen Wasserbad auf und inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang auf Eis. Nach dem Abkühlen etwas abgekühlt, aber noch flüssig, mischen Sie Glutaraldehyd gründlich in die Gelatinevorläuferlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,3 % Glutaraldehyd.

Pipettieren Sie nun 200 Mikroliter der vorbereiteten Lösung auf die Oberseite jedes Chips. Verteilen Sie die Lösung mit einem gebogenen Glasstab gleichmäßig auf den Chips. Bringen Sie anschließend die lösungsgeladenen Array-Chips sofort für 16 Stunden in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius zur Kryogelierung.

Kühlen Sie am nächsten Tag einen Gefriertrockner über etwa 30 Minuten auf minus 40 Grad Celsius ab. Laden Sie dann die Array-Chips und lyophilisieren Sie sie zwei Stunden lang unter Vakuum. Unter diesen Bedingungen erhebt sich das Eis und die Chips sind dann einsatzbereit.

Beginnen Sie mit der Ernte einzelner Mikrokryogele aus den Chips. Beginnen Sie mit dem Überlagern des hergestellten Mikrokryogen-Array-Chips auf dem hergestellten PDMS-Ejektor-Pin-Array. Richten Sie jedes Mikrokryogel mit einem Auswerferstift aus.

Drücken Sie dann den Mikrokryogel-Array-Chip in das Array, um die Mikrokryogele aus ihren Vertiefungen zu verdrängen. Ernten Sie nun die ausgestoßenen Mikrokryogele in einem Wasserbad und sammeln Sie sie mit Hilfe eines Zellsiebs. Verwenden Sie ein Sieb, um alle Mikrokryogele von einem Chip zu sammeln.

Waschen Sie anschließend die Mikrokryogele mit Natriumborhydrid auf Eis. Lassen Sie die unvernetzten Aldehydrückstände ca. 20 Minuten abschrecken. Entsorgen Sie dann das Natriumborhydrid und waschen Sie die Mikrokryogele 15 Minuten lang mit fünf Millilitern entionisiertem Wasser.

Führen Sie insgesamt drei bis fünf Wasserwäschen durch, bevor Sie fortfahren. Nachdem Sie die Mikrokryogele aus der letzten Wasserwäsche entfernt haben, übertragen Sie sie mit einer Pinzette aus dem Zellsieb in eine 35-Millimeter-Petrischale. Jede Ansammlung von Mikrokryogelen stellt einen Cluster dar.

Fügen Sie nun 50 bis 70 Mikroliter deionisiertes Wasser zu jedem Cluster von Mikrokryogenen hinzu und decken Sie die Schale ab. Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Schale, um alle gestapelten Mikrokryogele zu nivellieren. Frieren Sie dann die Mikrokryogele bei minus 20 Grad Celsius für vier bis 16 Stunden ein.

Später lyophilisieren Sie sie wie zuvor zwei Stunden lang. Der nächste Schritt besteht darin, die 3D-Mikrogewebe herzustellen. Zuerst werden die Mikrokryogele sterilisiert.

Ernten Sie dann die Zellen mit Trypsin, quantifizieren Sie ihre Dichte und resuspendieren Sie sie bei acht Millionen Zellen pro Milliliter in Wachstumsmedium. Pipettieren Sie anschließend 60 Mikroliter Zellsuspension auf jedes Cluster von Mikrokryogenen. Bewahren Sie die Schalen in einer befeuchteten Kammer auf und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen in die Gele aufgenommen werden.

Geben Sie nach der Inkubation zwei Milliliter Nährmedium in jede Schale und setzen Sie die Kultur fort, indem Sie das Medium alle zwei Tage wechseln. In zwei Tagen wird sich 3D-Mikrogewebe gebildet haben. Um das 3D-Mikrogewebe in eine Maus zu injizieren, geben Sie es zunächst in eine Fünf-Milliliter-Pipette und laden Sie es dann in ein Zellsieb, um das Kulturmedium zu filtern.

Dann resuspendieren Sie das 3D-Mikrogewebe in einer 15%igen Gelatinelösung. Nachdem Sie das Tier für die Implantation vorbereitet haben, injizieren Sie das Mikrogewebe intramuskulär an drei Stellen des Musculus gracilis. Jede Injektion sollte 150 Mikrokryogele in 150 Mikrolitern Lösung enthalten.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel. Nachdem Sie das Mikrokryogel-Array für die On-Chip-Zellkultur zusammengebaut haben, legen Sie es vorsichtig in eine vorgeheizte Feuchtigkeitskammer, ohne dass es nass wird. Aliquotieren Sie dann vorsichtig drei Mikroliter der gründlich gemischten Zellsuspension direkt auf jede Mikrokrygel-Vertiefung.

Lassen Sie die Pipettenspitze die Oberfläche des Mikrokrygels leicht berühren, bevor Sie die Lösung ausstoßen. Säen Sie die peripheren Vertiefungen nicht aus. Geben Sie nach dem Befüllen der Vertiefungen 10 Mikroliter selektives Medium in jede Vertiefung und fügen Sie Medium zu den peripheren Vertiefungen hinzu, um die Verdampfung mit einem 96-Kanal-Flüssigkeitsspender zu verlangsamen.

Kulturieren Sie die Chips dann 24 Stunden lang in der Feuchtigkeitskammer, um 3D-Mikrogewebe zu bilden. Am nächsten Tag geben Sie mit dem 96-Kanal-Flüssigkeitsspender viermal 10 Mikroliter Arzneimittel in einem Konzentrationsgradienten in jede Vertiefung, um die Zugabe aller 384 Vertiefungen, einschließlich der DMSO-Kontrollen, abzuschließen. Setzen Sie dann die Kultur 24 Stunden lang fort.

Geben Sie nach 24 Stunden medikamentöser Behandlung vier Mikroliter Resazurin-Stammlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang, damit die Zellen das Resazurin verstoffwechseln können. Um den Stoffwechsel von Resazurin in den Zellen zu testen, verwenden Sie ein Plattenlesegerät. Geerntete Gelatine-Mikrokryogele hatten vordefinierte Formen und Größen.

Die Analyse mittels REM zeigte, dass die Mikrokryogele miteinander verbundene makroporöse Strukturen mit Porengrößen im Bereich von 30 bis 80 Mikrometern enthielten. Die Injektionsfähigkeit der Gelatine-Mikrokryogele wurde quantitativ bewertet, indem sie nach der Injektion kultiviert wurden. 1.000 pro Milliliter wurden mit sechs Newton weniger als der klinisch akzeptablen Kraft von 10 Newton injiziert.

Die Stammzellen in Mikrokryogelen behielten nach der Injektion während einer fünftägigen Kultur eine hohe Lebensfähigkeit und eine große proliferative Kapazität bei. Unter Verwendung solcher Zellen wurde das Ischämie-Modell der Mausgliedmaßen therapeutisch behandelt und der physiologische Status der ischämischen Gliedmaßen 28 Tage nach der Operation untersucht. Die Mikrogewebebehandlung mit 100.000 Stammzellen verbesserte die Rettung der Gliedmaßen.

Nur 25% der Mäuse zeigten nach 28 Tagen eine spontane Zehenamputation. In einer anderen Anwendung wurde das 3D-Mikrogewebe-Array für die Hochdurchsatz-Wirkstoffprüfung eingesetzt. Hepatozelluläre Karzinomzellen wurden mit Doxorubicin behandelt, und nicht-kleinzellige Lungenkrebszellen wurden mit IMMLG-8439 behandelt.

In beiden Fällen wurde die Arzneimittelresistenz durch die 3D-Kultivierung erhöht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie elastische mikroporöse 3D-Mikrokryogele für Off-Chip-3D-Kulturen mit injizierbarer regenerativer Therapie oder On-Chip-3D-Zellkultur-Arrays für das In-vitro-Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening hergestellt werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der zellbasierten regenerativen Therapie und des Wirkstoffscreenings den Weg, die 3D-Zellkultivierung zu nutzen und damit beide Forschungsbereiche voranzubringen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Glutaraldehyd und Natriumborhydrid äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Schutzkleidung und das Arbeiten unter einer Laborhaube sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.