Name: Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Zytokinprofilen in menschlichen Tränen mittels bead-basierter Multiplex-Assays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung multiplier Analyten bei minimalem Probenvolumen und liefert wertvolle Einblicke in entzündliche Augenerkrankungen.

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Die Forschungsarbeit wurde durch das Zentrum Zuschuss von Tan Tock Seng Krankenhaus personalisiert Seed Finanzierung Programm 2015 unterstützt. Singapur Eye Research Institute Pilot Grant und Tan Tock Seng Krankenhaus Stellplatz für Fonds gewähren.

in dieser Studie verwendeten Protokolle wurden von den institutionellen Fachkollegiat Tan Tock Seng Krankenhaus, Singapur genehmigt.
 1. reißen Cytokine Analyse <ol><li>Sammlung von Tränen: <ol><li>bitten, das Thema sitzen bequem auf einem Untersuchungsstuhl und seinen/ihren Kopf gegen die Kopfstütze.</li>
		<li>Bitte das Thema zum Nachschlagen, vorsichtig öffnen die Schirmer-Streifen (aus Filterpapier Whatman Nr. 41) und legen Sie das abgerundete Ende des Streifens auf der unteren Fornix des Auges und anweisen, das Thema zu schließen Sie die Augen für 5 min. Beim Sammeln der Tränen sorgsam um okuläre Kontaktfläche zu minimieren. 30</li> <li>bitten, das Thema seiner/ihrer Augen zu entfernen und legen Sie sie in einen sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu öffnen. Labor oder bei-80 o C das Rohr bis zum Testen für die Profilerstellung Zytokin Sofortüberweisung.</li>
	</ol></li> <li>Elution von Tear-Beispiel vom Fluss Aufreißfaden: <ol><li>schneiden dem Aufreißfaden Fluss auf einer Länge von 0,5 cm (um die Menge der Tränen zu prüfenden standardisieren) und legen Sie sie in einen sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Fügen Sie 30 µL Puffer assay und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min, gefolgt von der Röhre bei 14.000 x g für 1 min. Zentrifugieren</li>
		<li>Übertragung den Überstand in ein anderes 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und entsorgen Sie den Streifen. Legen Sie die Probe mit der Röhre auf dem Eis und der eluierten Tear-Beispiel sofort nutzen, für die Profilerstellung Zytokin.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der Reagenzien: Hinweis: einundvierzig Analyten in jeder Stichprobe von Perle basierte Multiplex-Assay getestet werden sind Interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, Interferon-Alpha (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-Gamma-induzierbaren Protein 10 (IP-10, CXCL10), Makrophagen abgeleitete Chemokin (MDC), Makrophagen entzündliche Protein (MIP)-1α und MIP-1β Monocyte chemotaktische Protein (MCP)-1, MCP-3, Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α), TNF-β, Wachstum reguliert Onkogen (GRO), Tumor-Wachstum Faktor-Alpha (TGF-α), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF)-2, Thrombozytenzahl abgeleitet Wachstumsfaktor (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF), Eotaxin, Fractalkine, löslicher CD40 Ligand (sCD40L), Fms-Like Tyrosin-Kinase 3 Liganden (Flt - 3L) und reguliert bei Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert Protein (RANTES).
	<ol><li>Den Antikörper Wulst Lösung (50 X) Fläschchen auf Raumtemperatur (20-25 o C) und Wirbel bringen die Fläschchen für 1 min.</li>
		<li>Die Anzahl der Brunnen zum Test erforderlich, und berechnen Sie die Menge der insgesamt Bead cocktail Antikörperlösung (25 µL pro Well) und jede Perle Antikörperlösung (50 X) erforderlich für den Assay.</li>
		<li>Cocktail Lösung zubereiten, indem Sie die gewünschte Endvolumen durch Hinzufügen den Restbetrag der Wulst Verdünnungsmittel den berechneten Betrag der einzelnen Perle Antikörperlösung und Füllung hinzufügen. Sicherstellen Sie, dass die letztendliche Konzentration an jeder Antikörper in der Cocktail 1 X. Bereiten Sie immer mindestens 20 % extra Volumen cocktail Lösung Pipettieren Fehlerfällen. 
		Hinweis: Als Beispiel für eine 96-Well-Assay bereiten 3000 µL Antikörperlösung Bead cocktail. Die erforderliche Menge an jeder Perle Antikörperlösung = 3000/Lager Konzentration der jeweiligen Antikörper-Perle-Lösung; 3000/50 = 60 µL jeder Perle Antikörperlösung <ol><li>Hinzufügen 60 µL der einzelnen 41 Antikörper-Perle-Lösungen (60 X 41 = 2460 µL) zu einem Cocktail Flasche und die Antikörper Perle Mischung zu 3000 µL Finale 540 µL Wulst Verdünnungsmittel Lösung hinzufügen funktionierende Lösung (1 X).</li>
			<li>Vor dem Gebrauch, mischen Sie die Wulst cocktail Lösung richtig. Nachdem der Test speichern das restliche Volumen bei 2 – 8 o C für bis zu 30 Tage.</li>
		</ol></li> <li>Bereiten die Qualitätskontrolle (QC) durch QC 1 und QC 2 Aktien 250 µL deionisiertes Wasser hinzufügen.</li>
		<li>Mix richtig durch Umkehrung der Flaschen mehrmals und Vortex für 10 S. Transfer die Lösung ordnungsgemäß beschriftet Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen und speichern die restliche Lösung bei-20 ° C bis zu 30 Tage lang nutzbar.</li>
		<li>Vorbereitung der Waschpuffer durch Zugabe von 270 mL entionisiertem Wasser auf 30 mL 10 X waschen Pufferlösung und gut mischen (vor Verdünnung, 10 X Puffer auf Raumtemperatur bringen und lösen alle Salz Ausscheidungen durch Mischen). Speichern Sie die ungenutzten Waschpuffer (1 X) bei 2 bis 8 ° C, was bis zu 30 Tage lang verwendet werden kann.</li>
		<li>Bereiten die menschliche Zytokin standard Lager (10.000 Pg/mL alle Analyten) indem Sie das Lager Fläschchen 250 µL deionisiertes Wasser hinzufügen. Mischung gut durch invertieren mehrmals und Wirbel das Fläschchen für 10 s. lassen Sie es stehen für 10 min und übertragen der Vorratslösung zu Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen ordnungsgemäß beschriftet. Nach der Probe, speichern die restliche Lösung bei-20 ° C, die bis zu 30 Tage lang verwendet werden kann.</li>
		<li>Bereiten menschlichen Zytokin Arbeitsstandards durch 5-fold Verdünnungsreihen (50 µL - &#62; 200 µL) mit Testpuffer zu 2000, 400, 80, 16 und 3.2 Pg/mL.</li>
		<li>Nach standard Vorbereitung nutzen die Arbeitsstandards innerhalb von 60 min und den Assay-Puffer als Rohling/Hintergrund verwenden (-Pg/mL).</li>
	</ol></li> <li>Zytokin Profilierung durch Wulst Multiplex-Assays basieren: <ol><li>bringen alle Reagenzien auf Raumtemperatur und Wirbel für 5-10 Sekunden vor der Aufnahme in die 96-Well Mikrotiterplatte. Wenn eluierten Träne Proben bei-80 gelagert sind o C vor der Assay die gefrorene Träne Extrakte auf Eis auftauen und Zentrifugieren bei 1000 X g für 5 min.</li>
		<li>Bereiten ein Assay-Arbeitsblatt in eine vertikale Konfiguration für menschliche Zytokin-Normen arbeiten [0 (leer), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 und 10.000 Pg/mL], QC1, DC2 und Samples.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL 1 X Waschpuffer an jeden der Platte gut, versiegeln Sie es mit Platte Versiegelung und halten Sie es auf einem Teller Schüttler bei Raumtemperatur (20-25 o C) für 10 min.</li>
		<li>Dekantieren der 1 X Waschpuffer durch die Platte umdrehen und tippen sie auf saugfähige Handtücher mehrmals, um die Restmenge Waschpuffer in den Brunnen zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 25 µL jeder Arbeit menschliche Zytokin standard, QC1, DC2, leer (Testpuffer) und Proben in die entsprechenden Vertiefungen.</li>
		<li>Fügen Sie 25 µL Testpuffer in jede Vertiefung.</li>
		<li>Fügen Sie 25 µL 1 X Bead cocktail Antikörperlösung in jede Vertiefung. Wie Perle Antikörperlösung lichtempfindlich ist, die Dichtplatte mit Platte Versiegelung und bedecken Sie es mit Alu-Folie zum Schutz vor Licht während des Tests.</li>
		<li>Brüten die Platte bei 4 o C über Nacht auf einem Schüttler.</li>
		<li>Legen die Platte auf die Tellerhalter eine automatische Magnetplatte Unterlegscheibe. Lassen Sie es für 1 min die magnetische Beads an der Unterseite des Brunnens zu begleichen und aspirieren gut Inhalt. 200 µL Waschpuffer pro Bohrloch und lassen Sie es für 1 min sitzen und aspirieren Sie gut Inhalt. Nochmals die Wäsche (waschen, folgen Sie der Hersteller &#39; s Anweisungen).</li>
		<li>Hinzufügen 25 µL Erkennung Antikörper-Lösung in jedem gut, der Dichtplatte, mit Alufolie bedecken und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 min auf einem Schüttler.</li>
		<li>Fügen Sie 25 µL Streptavidin-Phycoerythrin Lösung in jede Vertiefung der Dichtplatte, mit Alufolie bedecken und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min auf einen Shaker.</li>
		<li>Legen Sie die Platte auf einer Magnetplatte Unterlegscheibe. Lassen Sie es für 1 min sitzen und aspirieren Sie gut Inhalt. Fügen Sie 200 µL Waschpuffer pro Bohrloch. Lassen Sie es für 1 min sitzen und aspirieren Sie gut Inhalt. Die Wäsche noch einmal zu wiederholen.</li>
		<li>Hinzufügen 150 µL Scheide Flüssigkeit jeweils gut und legen Sie die Platte auf einen Shaker für 5 min bei Raumtemperatur, die Antikörper-Perlen Aufschwemmen.</li>
		<li>Die Platte sofort mit der Wulst Multiplex-Assays Platte Leser basierend lesen und analysieren die Zytokin-Konzentrationen mit einem 5-Parameter Kurvenanpassung Algorithmus. Eine schematische Flussdiagramm des Risses Zytokin profiling ist in Abbildung 1 dargestellte.</li>
	</ol></li> <li>Assay Platte (Instrument einrichten) und Datenanalyse zu lesen: <ol><li>Switch auf den Wulst basierte Leser Multiplex-Assays und Pre-Warm der Laser für 30 min.</li>
		<li>Starten Sie die Wulst basierte Multiplex-Assay Software. Unter den &#39; automatisierte Wartung &#39; Registerkarte, wählen Sie die &#39; Kalibrierung-Überprüfung &#39; Option. Vortex jedes Reagens Fläschchen der Kalibrierung und Verifizierung Perlen für 30 s. Platz 5 Tropfen jedes Reagens in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Füllen Sie die dafür vorgesehenen Behälter mit entionisiertem Wasser und 70 % Ethanol.</li>
		<li>Erstellen ein neues Protokoll <ol><li>öffnen die &#39; Protokolle &#39; Seite und dann die &#39; Protokolle &#39; tab. Klick &#34; schaffen neue ProtocolŔ die &#39; Einstellungen &#39; Registerkarte wird geöffnet.</li>
			<li>In den &#39; Namen &#39; box, geben Sie den Namen des Protokolls.</li>
			<li>Geben Sie eine Beschreibung in das Feld rechts neben der &#39; Name &#39; Box.</li>
			<li>In der &#39; Version &#39; geben Sie die Version des Protokolls.</li>
			<li>In der &#39; Hersteller &#39; geben Sie die Angaben des Herstellers für das Protokoll.</li>
			<li>Definieren Einstellungen in den &#39; Erwerb Einstellungen &#39; Abschnitt wie folgt. Set &#39; Volumen &#39;: 100 µL &#39; Timeout &#39;: 60 s; &#39; DD Gating &#39;: 8.000 bis 15.000; &#39; Reporter Gain &#39;: Standard PMT; &#39; Bead Art &#39;: Magnetic Bead.</li>
			<li>Definieren Einstellungen in der &#39; Analyseeinstellungen &#39; Abschnitt, Auswahl &#39; Quantitative &#39; als Art der Analyse. Set &#39; Anzahl der Standards &#39;: 6; &#39; Anzahl von Steuerelementen &#39;: 0; Tick der &#39; bedeuten, repliziert der &#39; box; 
			Tick der &#39; Analyse der Ergebnisse beim Erwerb von Proben &#39; Box.</li>
			<li>Klicken Sie &#34; NextŔ die &#39; Analyten &#39; tab öffnet, klicken Sie auf den gewünschten Analyten (bead ID) im Raster nummerierten Analyt.</li>
			<li>Klicken und eingeben der entsprechenden Analyten zu nennen, in den &#39; Namen &#39; Spalte auf der rechten Seite des Rasters Analyten (Analyten &#39; Namen und deren entsprechenden Perle Region Details wurden in Tabelle 1 genannten).</li>
			<li>Klicken Sie auf und geben Sie die gewünschte Maßeinheit (z.B. Pg/mL) in die &#39; Einheiten &#39; Box auf der linken Seite des der &#39; gelten alle &#39; Taste. Klicken Sie dann auf &#34; gelten alle &#34;.</li>
			<li>Klicken und eingeben die gewünschten Wulst zählen für jeden Analyten (z.B. 50) in der &#39; Graf &#39; Feld. Klicken Sie auf &#34; alle &#34;.</li>
			Klicken Sie auf <li>&#34; NextŔ die Platte Layout-Registerkarte wird geöffnet. Markieren Sie die Brunnen für die Normen und wählen Sie &#34; 2 &#34; unter Graf zu replizieren, und klicken Sie auf die &#34; S &#34; Schaltfläche "Standard". Wiederholen Sie diesen Schritt für den Hintergrund &#34; B &#34; und Proben &#34; U &#34; Brunnen.</li>
			<li>Klicken Sie &#34; sparen &#34;.</li>
		</ol></li> <li>Schaffen neue Standards/Kontrolle viel <ol><li>offen die &#39; Protokolle &#39; Seite, und dann die &#39; Standards &#38; Steuerelemente &#39; tab. Klick &#34; schaffen neue Standard/Kontrolle viel &#34;.</li>
			<li>Öffnen der &#39; wählen Sie Protokoll &#39; Feld. Wählen Sie das Protokoll, das in Schritt 1.5.3 erstellt wurde.</li>
			<li>Geben Sie die Informationen der Normen entsprechend: Std/Ctrl-Kit Nummer, Std/Ctrl Set Name, Ablauf und Hersteller.</li>
			<li>Schlüssel den Wert auf höchstem Niveau für jeden Analyten (d. h. 10000 Pg/mL). Geben Sie 5 unter Verdünnung und klicken Sie auf &#34; gelten alle &#34; zum automatischen Generieren von der erwarteten Konzentrationen für den Rest der Normen.</li>
			<li>Klicken Sie &#34; sparen &#34;.</li>
		</ol></li> <li>Erstellen eine neue Charge von einem vorhandenen Protokoll <ol><li>offen die &#39; Chargen &#39; Seite und klicken Sie auf &#34; eine neue Batch-Registerkarte aus einem vorhandenen Protokoll erstellen &#34;.</li>
			<li>Geben Sie den Namen in der &#39;-Blattname &#39; box und geben Sie eine Beschreibung über den Stapel in die &#39; geben Sie Optional eine Beschreibung &#39; Box.</li>
			<li>Klicken Sie auf das Protokoll generiert zuvor (im Schritt 1.5.3).</li>
			<li>Klicken Sie &#34; NextŔ die nächste Registerkarte, die geöffnet wird ist der &#39; sexuell übertragbare Krankheiten &#38; Ctrls &#39; tab. zeigt die Details der Assay-Standards und wählen Sie &#34; nächste &#34;.</li>
			<li>Auf die &#39; Platte Layout &#39;-Register, weisen auch Befehle für diesen Stapel und &#34; sparen &#34; Stapelverarbeitungsinformationen speichern möchten die &#39; ausstehenden Batch &#39; Liste.</li>
			<li>Laden Sie die Platte in der Wulst basierte Multiplex-Assays Platte Leser, schütteln Sie sie für 5 min und die Stapelverarbeitung ausführen, aus der ausstehenden Batchliste. Erfassten Daten werden im CSV-Format gespeichert werden.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Datenanalyse <ol><li>konvertieren die CSV-Datei in das .rbx (Ergebnisse-Datendatei) Dateiformat mit dem Rbx-Konvertierungs-Software aus der Perle basierte Multiplex-Assay Software generiert. Die Konvertierungs-Software zu starten, wählen Sie die CSV-Datei unter select xPONENT Datei(en) und klicken Sie auf die &#34; erzeugen &#34; Taste; die .rbx-Datei wird in der ausgewählten Ausgabe-Ordner gespeichert werden.</li>
		<li>Starten Sie die Analysesoftware und öffnen Sie die Datei .rbx.</li>
		<li>Optimieren die standard Kurven mit Hilfe der 4PL/5PL Kurvenanpassung.
		<ol><li>Wählen Sie Folgendes in die &#39; Standardkurve &#39; Registerkarte: &#39; Regression Typ &#39;: &#39; Logistik-5PLƆ &#39; Achse Transformation &#39;: &#39; Log(x) - Linear (y) Ɔ Tick der &#39; zeigen Conc Bereich Linien &#39; box, kreuzen Sie die &#39; zeigen unbekannt Proben &#39; box; Tick der &#39; zeigen Kontrollproben &#39; box; Tick der &#39; anwenden auf alle Analyten &#39; box; Tick der &#39; zeigen Bericht nach der Optimierung &#39; Box.</li>
			<li>Klicken Sie auf die &#34; optimieren &#34; Taste für die automatische Optimierung.</li>
		</ol></li> <li>Kennzeichnen die Probe Identitäten unter &#39; geben Sie Probe Info &#39; tab.</li>
		<li>Erhalten die beobachteten Konzentrationen in der &#39; Berichtstabelle &#39; Registerkarte, und klicken Sie auf &#34; Berichtstabelle exportieren &#34; zum Generieren der Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei zur weiteren Analyse.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben. Keine finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Zytokine sind kleine zelluläre sekretierten Proteine und potente Immunmodulatoren Regulierung Immunantworten. 32 die Expressionsprofile von verschiedenen Zytokinen in Träne, die Proben sind im Zusammenhang mit verschiedenen pathologischen Zuständen des Auges und Studien über Cytokine Profile helfen zu verstehen, die Mechanismen der Pathogenese der Krankheit, den Zustand der okulären Gesundheit bestimmen, Schwere der Erkrankung, Diagnose und Verlauf. 2 , <sup clas...

Tränen sind von der Tränendrüse und Zubehör Drüsen produziert und die äußere Oberfläche des Auges zu beschichten. Tränenfilm besteht aus einer äußeren Lipidschicht und einer inneren wässrigen Schicht, die lösliche Proteine enthält, Schleimstoffe und Membran gebunden Schleimstoffe. Tränen verhindern mikrobielle Invasion, Nährstoffe liefern und bieten Schmierung an der Augenoberfläche. Tränen fungieren als Schnittstelle zwischen der Luft und Gewebe für den Sauerstofftransport in die Hornhaut. 1 die Tränenfilm besteht aus Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden und Elektrolyte. Die Zuordnung zwischen Träne Proteine mit Okular und systemische Erkrankungen wie trockenes Augenkrankheit, vernal Konjunktivitis, Glaukom, Diabetes Mellitus, Schilddrüsen-assoziierten Orbitopathy und Krebs wurde in mehreren Studien identifiziert. 2 , 3 , Träne fließen Streifen (Schirmer Streifen) oder 4 Träne Proben können durch Microcapillary Rohre erfasst werden. Darüber hinaus ist der Schirmer-Test ein Standardverfahren durchgeführt in der Hornhaut und refraktive Chirurgie Kliniken, deren, die Ergebnisse für Zytokin Analyse Assays verwendet werden können. Nicht-invasive Probenentnahme, Zugänglichkeit der Bio-Probe und der Verband der Träne Komposition mit verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen machen Film eine potentielle Quelle von Biomarkern für verschiedene augenfällige und systemische Krankheiten reißen. 4 , 5 , 6
Träne Zytokine spielt eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der okulären Oberfläche Gesundheit und entzündlichen Erkrankungen der verschiedenen augenfälligen Krankheiten. 7 abnorme Konzentrationen von verschiedenen Zytokinen in Träne Proben wurden berichtet, mit trockenen Augen, vernal Keratokonjunktivitis (VKC), atopische Keratokonjunktivitis (AKC), saisonale allergische Konjunktivitis und Uveitis einhergehen. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Träne Proteine können von den traditionellen Methoden wie Massenspektrometrie, westliche Beflecken und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) analysiert werden. 14 , 15 sind jedoch die Grenzen dieser Methoden, schlechte Empfindlichkeit und ein größeres Volumen der Probe für die Analyse von mehreren Träne Zytokinen bei jedem Patienten erforderlich. 16 , 17 Bead basierte Multiplex-Assays wurden entwickelt, um mehrere Analyten in komplexen Mischung Proben analysieren und erfolgreich auf Träne Proben analysieren mehrere Zytokine bei verschiedenen Krankheiten angewendet. 6 , 18 A Kombination der Sandwich ELISA und Flow Cytometry Techniken ermöglichen diese Tests zu empfindlicher als ELISA für die Quantifizierung von mehreren Analyten in einer einzigen Probe. 19 diese Methode kann auf einer Vielzahl von klinischen Proben und Zelle Kultur Überstände und hilft bei der Untersuchung von Immunantworten in mehreren pathophysiologischen Bedingungen angewendet werden. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Es gibt mehrere Studien vergleichen Wulst basierte Multiplex mit ELISA Tests und haben eine Korrelation zwischen den Methoden berichtet. Loo Et Al. verglichen Wulst Multiplex-Assays mit konventionellen ELISA zum Nachweis von Adiponectin, resistin, Leptin und Ghrelin im menschlichen Serum bzw. Plasma-Proben und eine starke Korrelation (R &#62; 0,9) zwischen der Assays. 25 Dupont Et Al. berichteten eine starke Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ und TNF-α in Phytohemagglutinin und Lipopolysaccharid angeregt Vollblut gesammelt von schwangeren Frauen. 26 Pickering Et Al. berichteten eine weitere starke Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Serum-Antikörper gegen Haemophilus Influenza Typ B Polysaccharid (R = 0.96), Kombinationsimpfung von Clostridium Tetani (R = 0.96), und Corynebacterium Diphtheriae (R = 0,91). 27 Biagini Et Al. berichteten eine hohe positive Korrelation (R = 0.852) zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Bacillus Anthracis Anti-PA IgG in Serumproben. 28 Wang Et Al. berichteten eine Korrelation zwischen Wulst basierte Multiplex-Assays und ELISA zum Nachweis von Alzheimer-Krankheit Biomarker Amyloid-β 42 (R = 0.77), total Tau (R = 0,94), und Tau auf Aminosäure 181 phosphoryliert (R = 0,82) in Liquor cerebrospinalis Proben. 29 diese Studien haben gezeigt, dass die Anwendbarkeit der Wulst Multiplex-Assays anhand verschiedener klinischen Proben, kleinere Probe Volumenanforderungen und eine Korrelation mit standard ELISA, die Perle basierte Multiplex-Assays eine vielversprechende machen Alternative zu traditionellen ELISA-Methoden zum Nachweis von mehreren Analyten in der unterschiedlichen Art der Proben in verschiedenen Krankheit Phänotypen. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll für Perle basierte Multiplex-Assay für die Cytokine Profilerstellung für 41 Analyten in Träne Proben von gesunden Probanden mit Schirmer Streifen.

<table><tbody><tr><td>Milliplex MAP Paneel für humane Zytokine / Chemokin-Magnetbeads -1 Kit</td><td>Merck, USA</td><td>HCYTOMAG-60K-41</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D-Lumimex-Instrument</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xPonent Software&nbsp;</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBXGenerator-Software</td><td>BIO-RAD, Frankreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.1</td><td>BIO-RAD, Frankreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plattenschüttler</td><td>Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TECAN Mikroplatten-Waschmaschine</td><td>Tecan, Schweiz</td><td>HydroSpeed</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries inc, USA</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Mettler Toledo, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen, USA</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Schirmer Tränenfluss-Teststreifen</td><td>Eye Care and Cure, USA</td><td>101657</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D Calibration Kit</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-028</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D Verifizierungskit</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-029</td><td></td></tr><tr><td>Untersuchungsstuhl</td><td></td><td></td><td></td> für das Auge</tr></tbody></table>

wulst basierte multiplex-assays für die analyse der träne cytokine profile

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tränenfilm ist ein komplexes Gemisch von Lipiden, Proteinen und Mineralien umfasst die äußere Oberfläche des Auges, wodurch Schmierung, Ernährung und Schutz für die darunter liegenden Zellen. Analyse der Tränen ist eine aufstrebende Gegend für die Identifizierung von Biomarkern für die Vorhersage, Diagnose und Prognose von verschiedenen augenfälligen Krankheiten. Tränen sind leicht zugänglich und ihre Sammlung ist nicht-invasiv. Daher sind fortschreitende Technologien zur Identifikation von mehreren Analyten in Tränen, Veränderungen im Protein oder Metaboliten Zusammensetzung und seine Verbindung mit pathologischen Bedingungen studieren gewinnt an Bedeutung. Träne Zytokine sind ideale Biomarker für die Gesundheit der Augenoberfläche zu studieren und auch in das Verständnis der Mechanismen von verschiedenen augenfälligen Oberfläche Erkrankungen wie trockenes Augenkrankheit und vernal Konjunktivitis helfen. Wulst basierte Multiplex-Assays sind in der Lage mehrere Analyten in einer kleinen Menge der Probe mit einer höheren Empfindlichkeit zu erkennen. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Protokoll der Träne Musterkollektion, Extraktion und Analyse des Cytokine profiling eine Perle mit Multiplex-Assays basieren.

Träne Proben wurden von 8 Augen von 4 gesunden Probanden mit Aufreißstreifen Fluss gesammelt und Zytokin Ebenen wurden unter Verwendung des oben genannten Protokolls analysiert. Alle Probanden waren männlich und das Alter der vier Probanden betrug 36, 42, 44 und 52 Jahren beziehungsweise. Okuläre Oberfläche Gesundheit und trockenes Auge Krankheit wurde durch klinische Tests (Tear Film Pause, Zeit, Schirmer Test, Hornhaut Färbung, Bindehaut Färbung, Deckel/Meibom-Drüse-Prüfung, Hornhaut Tr...

Analyse der Tränenfilm hilft Zytokine in verschiedene augenfällige Krankheiten zu studieren. Wulst basierte Multiplex-Assays sind einfach und empfindlich und ermöglichen das Testen von mehreren Zielen in Proben mit kleinen Volumina. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Tear Film Zytokin Profilierung eines mit Wulst basierte Multiplex-Assays.

Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Zytokinprofile in menschlichen Tränenproben, die mittels Schirmer-Streifen gesammelt wurden, mit einem bead-basierten Multiplex-Assay zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Augenheilkunde zu beantworten, beispielsweise welche Rolle Zytokine bei verschiedenen Augenerkrankungen spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Untersuchung mehrerer Analyten in geringeren Probenmengen eingesetzt werden kann.Den Versuch wird Praveen Balne, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Nachdem Tränen gemäß dem schriftlichen Protokoll von einem Probanden gesammelt wurden, schneiden Sie den Tränenflussstreifen auf eine Länge von 0,5 Zentimetern zu und legen ihn in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 30 Mikroliter Assay-Puffer hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur.Anschließend die Probe bei 14.000 × g für eine Minute zentrifugieren. Den Überstand in ein anderes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und den Streifen entsorgen. Danach das Röhrchen mit der Probe auf Eis stellen und die eluierte Tränenprobe sofort für die Zytokin-Profilierung verwenden.Um den beadbasierten Multiplex-Assay durchzuführen, bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang an. Falls die eluierten Tränenproben vor dem Assay bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, tauen Sie die gefrorenen Tränenextrakte auf Eis auf und zentrifugieren Sie die Proben bei 1.000 × g fünf Minuten lang. Bereiten Sie ein Assay-Arbeitsblatt in vertikaler Anordnung für die Arbeitsstandards für humane Zytokine QC-1, QC-2 und Proben vor.Gegeben Sie 200 Mikroliter 1X Waschpuffer in jedes Loch der Platte und verschließen Sie diese mit einem Plattenverschluss. Inkubieren Sie anschließend die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Plattenrührer. Danach gießen Sie den 1X Waschpuffer durch Umkehren der Platte ab und klopfen mehrmals auf ein absorbierendes Tuch, um Restmengen des Waschpuffers aus den Löchern zu entfernen.Fügen Sie dann 25 µL jedes working human Cytokine Standard QC-1, QC-2, der Leerprobe mit nur Assaypuffer sowie der Proben in die entsprechenden Vertiefungen hinzu. Geben Sie 25 µL Assaypuffer in jede Vertiefung. Anschließend geben Sie 25 µL der 1× Antikörper-Bead-Cocktail-Lösung zu den Vertiefungen hinzu.Da die Antikörper-Perlen-Lösung lichtempfindlich ist, verschließen Sie die Platte und schützen Sie sie mit Aluminiumfolie und Plattenabdeckung vor Licht während des Assays. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler. Am folgenden Tag stellen Sie die Platte auf das Plattengestell eines automatischen magnetischen Plattenwäschers und lassen sie eine Minute lang stehen, damit sich die magnetischen Perlen am Boden der Vertiefung absetzen können.Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen und geben Sie mithilfe eines automatischen magnetischen Plattenwaschers 200 Mikroliter Waschpuffer pro Vertiefung hinzu. Lassen Sie die Platte eine Minute lang stehen, entfernen Sie anschließend die Flüssigkeit aus den Vertiefungen wie zuvor und wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal. Geben Sie 25 Mikroliter der Detektionsantikörperlösung in jede Vertiefung hinzu.Das Plate versiegeln. Mit Aluminiumfolie und Plate-Deckel abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren. Anschließend 25 µL Streptavidin-Phycoerythrin-Lösung in jedes Well geben und nach dem Versiegeln und Abdecken des Plates 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren.Nach der Inkubation die Platte auf einen magnetischen Plattenwascher stellen und eine Minute lang ruhen lassen. Dann den Inhalt der Vertiefungen abpipettieren und 200 µL Waschpuffer pro Vertiefung hinzufügen. Eine Minute lang ruhen lassen, anschließend den Inhalt der Vertiefungen abpipettieren und den Waschschritt erneut einmal wiederholen.Fügen Sie 150 Mikroliter Umhüllungsflüssigkeit zu jedem Well hinzu. Anschließend setzen Sie die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Schüttler, um die Antikörper-Perlen erneut in Suspension zu bringen, bevor Sie die Platte auslesen und die Zytokinkonzentrationen analysieren. Um die Assayplatte gemäß dem Textprotokoll auszulesen, öffnen Sie die Chargenseite und klicken Sie auf den Reiter „Neue Charge aus bestehendem Protokoll erstellen“.Im Feld „Batch-Name“ den Namen des Batches eingeben und im Feld „Optionale Beschreibung eingeben“ eine Beschreibung zum Batch eingeben. Auf das zuvor generierte Protokoll klicken und dann auf „Weiter“ klicken. Der nächste geöffnete Reiter ist der Reiter „Standards und Kontrollen“.Zeigen Sie die Details der Assay-Standards an und wählen Sie „Weiter“. Weisen Sie unter der Registerkarte „Plattenlayout“ die Brunnenbefehle für den Batch zu und klicken Sie auf „Speichern“, um die Batch-Informationen in der Liste der ausstehenden Batches zu speichern. Laden Sie die Platte in den bead-basierten Multiplex-Assay-Plattenleser und führen Sie den Batch aus der Liste der ausstehenden Batches aus.Starten Sie die RBX-Konvertierungssoftware, und wählen Sie unter „Exponent-Dateien auswählen“ die CSV-Datei aus, die von der Software für den bead-basierten Multiplex-Assay generiert wurde. Klicken Sie anschließend auf den Schaltknopf „Generieren“. Eine RBX-Datei wird im ausgewählten Ausgabeordner gespeichert.Starten Sie nun die Analyse-Software und öffnen Sie die rbx-Datei. Optimieren Sie anschließend mithilfe der 4PL-5PL-Kurvenanpassung die Standardkurven. Um die Standardkurven zu optimieren, wählen Sie im Reiter „Standardkurve“ folgende Einstellungen: Regressionsart, Logistik 5PL, und Achstransformation log X, linear Y. Aktivieren Sie dann die folgenden Kontrollkästchen: Konzentrationsbereichslinien anzeigen, unbekannte Proben anzeigen, Kontrollproben anzeigen, auf alle Analyten anwenden und Bericht nach Optimierung anzeigen.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Optimieren“, um die automatische Optimierung durchzuführen. Im Reiter „Probendaten eingeben“ vergeben Sie Bezeichnungen für die Probenidentitäten. Abschließend erhalten Sie die beobachteten Konzentrationen im Reiter „Berichtstabelle“ und klicken auf „Berichtstabelle exportieren“, um die Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei für weitere Analysen zu generieren.Tränenproben wurden von acht Augen von vier gesunden Männern im Alter von 36 bis 52 Jahren gesammelt. Von den 41 mittels der bead-basierten Multiplex-Analyse untersuchten Zytokinen wurden 31 in allen Tränenproben nachgewiesen. Beispielsweise wurden IL-17A, MIP-1b und TNFa bei sieben Augen von vier Probanden nachgewiesen, und IL-4 wurde bei sechs Augen von vier Probanden nachgewiesen.Außerdem wurde Interferon-gamma in sechs Augen von drei Probanden nachgewiesen. Interleukin-1a wurde in fünf Augen von drei Probanden nachgewiesen. Eotaxin und Interleukin-9 wurden in drei Augen von zwei Probanden nachgewiesen.Interleukin-3 wurde in einem Auge nachgewiesen, und MIP-1a wurde in keiner der Proben detektiert. Die mittleren Konzentrationen der 41 nachgewiesenen Zytokine plus oder minus Standardabweichung sind in diesem Streudiagramm dargestellt. Interleukin-1ra war in allen Proben stark exprimiert.Die Zytokine IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, Interleukin-a, EGF, PDGF-BB, VEGF und G-CSF wurden ebenfalls im Bereich von Nanogramm pro Milliliter stark exprimiert, während die übrigen Zytokine im Bereich von Pikogramm pro Milliliter exprimiert wurden. Wie hier zu sehen ist, war die niedrigste gemessene Konzentration eines Tränenzytokins TNF-a mit einem Mittelwert ± Standardabweichung von 27,25 ± 19,97 Pikogramm pro Milliliter. Bei 31 Zytokinen, die in allen Proben nachgewiesen wurden, zeigte sich mittels T-Test kein statistisch signifikanter Unterschied in der Konzentration zwischen dem rechten und linken Auge.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von 1-1/2 Tagen durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen beadbasierten Multiplex-Assay zur Zytokinfingerprinting in Tränenflüssigkeit durchführt.

bead-based-multiplex-assay-for-analysis-of-tear-cytokine-profiles

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Bead-basierten Multiplex-Assay zur Analyse von Zytokinen in menschlichen Tränen. Die Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Zytokine aus einer einzigen Probe und bietet eine erhöhte Sensitivität für die Untersuchung von Immunantworten unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen.

Ein Multiplex-Bead-basierter Assay zur Analyse von Zytokinen in menschlichen Tränenproben

Dieses Video zeigt einen Multiplex-Bead-basierten Immunoassay zur Quantifizierung mehrerer Zytokinziele in einer Probe. Eine Mischung aus unterschiedlichen Mikrosphären, die an zytokinspezifische Antikörper konjugiert sind, wird verwendet, um die in der Probe vorhandenen Zytokine zu binden. Streptavidin-markierte Reporter werden mit biotinylierten Nachweisantikörpern an den gebundenen Zytokinen immobilisiert. Die Durchflusszytometrie identifiziert die gebundenen Zytokine anhand der...

Ein Multiplex-Bead-basierter Immunoassay zur Quantifizierung mehrerer Zytokinziele

Wir beschreiben ein Verfahren zum Profilieren von Speichelproteinen mit gemultiplexten Basis von Mikroarrays Antikörper. Monoklonale Antikörper wurden kovalent an Fluoreszenzfarbstoff-codierten 4,5 &amp;mgr; m-Mikrokugeln unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie gebunden. Die modifizierten Mikrosphären wurden in faseroptischen Mikrovertiefungen abgeschieden, um Protein-Spiegel im Speichel mittels Fluoreszenz-Sandwich-Immunoassays zu messen.

Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles

Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mehrere Zytokin Ziele gleichzeitig in Gewebekultur Überstände von stimulierten Maus Splenocyten Multiplex-Perle-basierte Immunoassay-Plattform mit einem Durchflusszytometer gesammelt.

Multiplex-Zytokin Profilierung der stimulierten Maus Splenocyten mit Hilfe einer durchflusszytometrischen Bead-basierte Immunoassay-Plattform

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Entnahme von Tränenproben unter Verwendung von Schirmer-Streifen und einen integrierten quantitativen Workflow zur Entdeckung nicht-invasiver Tränenprotein-Biomarker. Der Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung ermöglicht eine schnelle und robuste Vorbereitung von Tränenproben und massenspektrometrische Analysen, was zu einer höheren Ausbeute an Peptidrückgewinnung und Proteinidentifikation führt als bei Standardverfahren in Lösung.

Eine Proteinsuspensions-Trapping-Probenvorbereitung für die Tränenproteomik mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

Die Verwendung von Referenzreagenzien für Zytokinfreisetzungsassays ermöglicht reproduzierbarere und standardisierte In-vitro-Sicherheitsprofile von immuntherapeutischen monoklonalen Antikörpern. Im Folgenden wird beschrieben, wie Zytokin-Freisetzungsassays zusammen mit einem Referenzreagenzienpanel verwendet werden können, um die Sicherheit einiger therapeutischer monoklonaler Antikörper vorherzusagen.

Verwendung von Referenzreagenzien zur Bestätigung der Robustheit von Zytokin-Freisetzungsassays für die Vorhersage der Sicherheit monoklonaler Antikörper

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Sammlung und Erkennung von miR-15a aus Tränen als neues diagnostisches Werkzeug für diabetische Retinopathie.

Tränenabgeleitetes exosomales miR-15a als neues diagnostisches Werkzeug für diabetische Retinopathie

Die Identifizierung von RNA- und Protein-Biomarkern aus Rissen in Mausmodellen ist vielversprechend für die Frühdiagnostik verschiedener Krankheiten. Dieses Manuskript bietet ein umfassendes Protokoll zur Optimierung der Wirksamkeit und Effizienz der mRNA- und Proteinisolierung aus Maustränen.

Optimierung der Tränensammlung bei Mäusen für die mRNA- und Proteinanalyse

Dieses Protokoll beschreibt ein einzigartiges klinisches Protokoll zur Entnahme menschlicher Tränenflüssigkeitsproben mittels roter Phenolfäden und auf Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-basierendem Workflow, um das Rippenlipidom-Profil zu entdecken. Die einfache Methyl-tert-Butylether-(MTBE)/methanol-biphasische Trennmethode ermöglicht eine schnelle Tränenlipidextraktion mit hoher Rückgewinnung für die Entdeckung von Tränenbiomarkern.

Phenolrot-Faden-basierte Probenahme für ungezielte Tränenflüssigkeitslipidomik in der Biomarker-Entdeckung

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte enzymgebundene Immun-Sorbent-Methode (ELISA) zur Nachweisung und Quantifizierung von 17β-Estradiol und Testosteron in menschlicher Tränenflüssigkeit, die über Mikrokapillarröhrchen gesammelt wird. Dieser Ansatz ermöglicht eine minimalinvasive Messung der Tränenhormonspiegel.

Nachweis von Sexualhormonen im menschlichen Tränenfilm mittels enzymgebundener Immunsorbent-Assays

Lernen Sie die Analyse von Zytokinprofilen in menschlichen Tränen mittels bead-basierter Multiplex-Assays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung multiplier Analyten bei minimalem Probenvolumen und liefert wertvolle Einblicke in entzündliche Augenerkrankungen.

Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile

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