Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Das übergeordnete Ziel dieses Gentransfers von Adeno-assoziierten Virusvektoren besteht darin, das Gehirn und das Rückenmark der Ratte auf einer großflächigen, großflächigen Basis genetisch zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Gentransfers zu beantworten. Es ist eine sehr effiziente Methode, Gene in vivo einzuführen, und daher eine sehr leistungsfähige, sehr vielseitige Technik.

Dieses Verfahren ist sowohl schnell als auch hochgradig reproduzierbar. Wir haben diesen breit angelegten Gentransfer-Ansatz in mehreren Publikationen verwendet, um ein mit Amyotropher Lateralsklerose verwandtes Protein im gesamten Rückenmark von Ratten zu exprimieren. Mein Kollege Robert Dayton wird das Verfahren vorführen.

Mychal Grames wird Robert assistieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Arbeitsplatzes, reinigen Sie zuerst die Oberfläche mit 70% Ethanol. Lege dann ein Heizkissen in den Arbeitsbereich und stelle es auf 37 Grad Celsius ein.

Lege eine Bankunterlage auf das Heizkissen. Vergewissern Sie sich, dass ausreichend Sauerstoff und Isofluran für den Eingriff vorhanden sind. Reinigen Sie die Induktionskammer und die Anästhesiemaske mit 70% Ethanol und legen Sie die Anästhesiemaske auf die Bankauflage.

Stellen Sie sicher, dass Sie Folgendes in der Hand haben: ein Paraffinfilmquadrat von etwa 5 x 5 Zentimetern pro Tier, ein Alkoholpräparationspad und zwei oder drei Mullkissen pro Tier, Pipettenspitzen und eine Mikropipette. Tauen Sie dann den Vektor bei Raumtemperatur auf und beschriften Sie ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Tier. Pipettieren Sie das erforderliche AAV-Volumen in das entsprechende Röhrchen und bringen Sie das Volumen mit Laktat-Ringerlösung oder Kochsalzlösung auf das gewünschte Injektionsvolumen.

Nach dem Vortexen der Probe für ein oder zwei Sekunden und dann fünf Sekunden lang eine Pulszentrifuge durchführen, um die Probe auf den Boden des Röhrchens zu bringen. Pipettieren Sie das gesamte Injektionsvolumen aus dem Schlauch auf das Quadrat des Paraffinfilms. Legen Sie als Nächstes eine 30-Gauge-Nadel auf eine Ein-Milliliter-Spritze.

Platzieren Sie die Nadel mit der Fase nach unten in den Vektor auf dem Paraffinfilm. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, bis sich das gesamte Virus in der Nadel und der Spritze befindet. Betäuben Sie die Ratte richtig mit dem Anästhesiesystem.

Stellen Sie eine angemessene Anästhesieebene sicher, indem Sie nicht auf ein Einklemmen der Zehen reagieren. Legen Sie dann die Ratte auf die Seite in den Arbeitsbereich und halten Sie die Narkose mit dem Nasenkonus aufrecht. Wenn die Ratte auf der Seite liegt, sollte eine seitliche Schwanzvene nach oben zeigen.

Die Einspritzung erfolgt zu zwei Dritteln über die Länge des Hecks. Wischen Sie die Injektionsstelle mit dem Alkoholvorbereitungskissen ab. Halten Sie den Schwanz fest über dem Injektionsbereich, mit einem Finger direkt über der seitlichen Schwanzvene, dies erweitert die Vene.

Richten Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die gleiche Richtung an der sichtbaren Schwanzvene aus. Durchstechen Sie die Haut über der Schwanzvene, während Sie sehr vorsichtig sind, um zu vermeiden, dass die andere Hand den Schwanz hält und auf die Schwanzvene drückt. Lassen Sie den Druck von der Schwanzvene ab, um einen normalen Blutfluss zu ermöglichen.

Schiebe dann die Nadel in die Vene. Um sicherzustellen, dass die Nadel die Schwanzvene durchstochen hat, ziehen Sie den Kolben leicht zurück. Befindet sich die Nadel in der Vene, fließt Blut in die Nadel.

Nachdem Sie die Nadel bei Bedarf neu positioniert haben, stabilisieren Sie die Nadel, indem Sie das Ende der Spritze gegen den Schwanz halten. Injizieren Sie den Vektor langsam mit etwa 20 Mikrolitern pro Sekunde in den Schwanz. Im Falle einer schlechten Injektion wird das Tier nur teilweise transduziert und die Ergebnisse sind wahrscheinlich nicht brauchbar.

Mit der Praxis sind gute Injektionen jedoch sehr reproduzierbar und zuverlässig. Wenn der Vektor verabreicht wurde, entfernen Sie die Nadel vom Schwanz und drücken Sie ein Mullkissen gegen die Injektionsstelle, um die Blutung für 30 bis 60 Sekunden zu stillen. Schalten Sie die Isofluran-Anästhesie und den Sauerstoff aus.

Beobachte die Ratte, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt, und bringe sie dann in ihren Käfig zurück. Entsorgen Sie die Materialien, die möglicherweise mit AAV kontaminiert sind, in einem geeigneten Behälter für biologische Gefahrstoffe und reinigen Sie den Arbeitsplatz mit 70 % Ethanol. Erhalten Sie 50-Mikrometer-Koronalschnitte aus dem fixierten und kryogeschützten Gehirn eines AAV-injizierten Tieres unter Verwendung eines gleitenden Mikrotoms mit Gefriertisch.

Nach der Immunfärbung für GFP und der Montage auf Objektträgern wird jeder Schnitt in der definierten Region of Interest mit einer Linse mit geringer Vergrößerung unter Verwendung eines Mikroskops mikrofotografiert. Behalten Sie die Kameraeinstellungen für alle zu analysierenden Proben bei und speichern Sie die Daten als TIFF-Dateien. Öffnen Sie das Mikrofoto im weit verbreiteten Programm Scion Image.

Es öffnen sich zwei Fenster, schließen Sie das Fenster, das als Indexfarbe angezeigt wird. Wählen Sie Optionen und dann Dichte-Slice aus. Eine Reihe von Schattierungen wird im Fenster der Nachschlagetabelle rot angezeigt.

Verwenden Sie den Cursor im Fenster, um nur die spezifische GFP-Beschriftung auszufüllen, und stoppen Sie, wenn der unspezifische Hintergrund im Bild aufgenommen wird. Klicken Sie anschließend auf Analysieren und Skalierung festlegen. In der vierten Zeile sollte Einheiten stehen, wählen Sie aus der Dropdown-Liste Pixel aus und klicken Sie dann auf OK.

Um den Fluoreszenzbereich zu messen, klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen. Klicken Sie dann auf Analysieren und Ergebnisse anzeigen. Ein Ergebnisfenster wird angezeigt, und die Messung des fluoreszierenden Bereichs befindet sich unter der Überschrift "Bereich".

Sobald alle Messungen aufgezeichnet wurden, wird der Durchschnitt der Werte von drei bis sechs Abschnitten pro Tier vorgenommen. Verwenden Sie einen geeigneten statistischen Test, um die transduzierten Bereiche zwischen den Gruppen zu vergleichen. Dieses repräsentative Bild zeigt die GFP-Immunfluoreszenz im Kleinhirn der Ratte, vier Wochen nach einer Schwanzveneninjektion von AAV 9 GFP.

Eine Bildanalysesoftware wurde verwendet, um den fluoreszierenden Bereich selektiv hervorzuheben und die hervorgehobenen Pixel zu quantifizieren. Dies ist das GFP-Bild eines nicht transduzierten Tieres. Die Analyse dieses Bildes unter Verwendung der gleichen Parameter für das GFP-injizierte Tier detektiert einen sehr geringen Pegel des Hintergrundsignals.

Einmal gemeistert, kann die Injektion in etwa fünf Minuten pro Ratte durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik einen Weg beschreibt, Gene effizient in das ZNS der Ratte einzuführen, wobei eine einmalige Genabgabe zu einer dauerhaften Expression und langfristigen Effekten führt. Am wichtigsten ist, dass das zentrale Nervensystem von der Peripherie aus manipuliert wird.

Eine relativ nicht-invasive intravenöse Vektorinjektion erreicht das Gehirn und das Rückenmark, das ZNS.