Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist der Nachweis von N-Acetylneuraminsäure und N-Glycolylneuraminsäure in Leber und Milch von Wildtyp- und CMAH-Knockout-Mäusen mittels HPLC-Analyse. Diese Methode kann dazu beitragen, offene Fragen im Bereich der Glykowissenschaft zu klären, insbesondere welchen Einfluss die Genotypen von CMAH-Mausmodellen auf den tatsächlichen Sialinsäuregehalt dieser Tiere haben. Der wesentliche Vorteil dieser Technik im Vergleich zu genetischen Screenings besteht darin, dass auch für heterozygote Mäuse relative Sialinsäurespiegel bestimmt werden können.

Die Evaluierung dieser Methode wird von den beiden Doktoranden Cui Cao und Wang Wenjiao aus unserem Labor durchgeführt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Gewinnung von Mäusemilch und Lebergewebe von CMAH-Knock-out-Mäusen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um Sialinsäuren aus der Milch zu isolieren, überführen Sie 50 µL Milch in ein 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen und geben 1,2 mL der hergestellten wässrigen Essigsäurelösung hinzu.

Um Sialinsäuren aus Lebergewebe zu isolieren, tauen Sie 20 bis 50 Milligramm Mausleber vorsichtig auf und überführen Sie sie in einen Dounce-Gewebemörser. Geben Sie 1,2 Milliliter der wässrigen Essigsäurelösung hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe durch vorsichtiges Scheren für 10 Sekunden. Überführen Sie die resultierende Suspension in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Als Nächstes inkubieren Sie die angesäuerte Milch oder Gewebesuspension vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 ×g für 10 Minuten. Überführen Sie die oberen 1000 µL des Überstandes in ein neues 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen.

Entfernen Sie das Lösungsmittel durch Zentrifugalverdampfung bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Trockne. Lösen Sie die Probe erneut in 500 Mikroliter destilliertem Wasser auf. Bereiten Sie anschließend eine Mikroanionenaustauschsäule vor, indem Sie 200 Milligramm Anionenaustauscherharz pro Probe in leere 3-Milliliter-Röhrchen mit angebranntem Hahn überführen.

Geben Sie 2 Milliliter der wässrigen Essigsäurelösung hinzu, um die Chloridionen im Harz durch Acetat-Ionen zu ersetzen. Schließen Sie den Hahn, sobald das Lösungsmittel die Harzoberfläche erreicht. Fügen Sie vorsichtig 2 Milliliter destilliertes Wasser hinzu und öffnen Sie den Hahn.

Stoppen Sie den Fluss, sobald das meiste Lösungsmittel die Oberseite des Harzes erreicht hat. Stellen Sie sicher, dass das Harz stets mit Lösungsmittel bedeckt ist. Spülen Sie die Harzsäule anschließend noch zweimal mit je zwei Milliliter destilliertem Wasser, um überschüssiges Acetat zu entfernen.

Überführen Sie die resultierenden 500 Mikroliter Probelösungsmittel auf die Harzsäule und verwerfen Sie den Durchlauf. Waschen Sie das Harz vorsichtig mit 2 Milliliter destilliertem Wasser. Eluieren Sie die Probanionen mit 1 Milliliter einer 50 Millimolar-Ammoniumacetat-Lösung vom Harz in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Entfernen Sie das Lösungsmittel durch Zentrifugalverdampfung bei Raumtemperatur bis zur Trockne. Wiegen Sie zwischen 5 und 8 Milligramm N-Acetylneuraminsäure auf einer Analysenwaage in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen ab. Notieren Sie das exakte Gewicht und geben Sie 164 Mikroliter destilliertes Wasser pro Milligramm hinzu.

Beziehen Sie N-Glycolylneuraminsäure in kleineren Mengen zu moderaten Kosten, beispielsweise in 1-Milligramm-Aliquoten. Geben Sie 154 Mikroliter destilliertes Wasser direkt zur Verbindung hinzu, um eine Stammlösung von etwa 20 Millimolar Neu5Gc zu erhalten. Überführen Sie die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Diese Lösung kann bis zu 12 Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Geben Sie 5 Mikroliter jeder Stammlösung in ein frisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Anschließend entfernen Sie das Lösungsmittel durch zentrifugale Verdampfung bei Raumtemperatur bis zur Trockne.

Fügen Sie 20 Mikroliter der OPD-Lösung zu den aus Mäusemilch, Mäuseleber oder dem gemischten Sialinsäure-Standard gewonnenen Sialinsäureproben hinzu. Vortexen Sie die Probe kräftig für 30 Sekunden. Inkubieren Sie anschließend die Proben vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius im Dunkeln.

Nachdem die Proben fünf Minuten lang abgekühlt sind, 80 Mikroliter destilliertes Wasser hinzufügen. Anschließend die Röhrchen eine Minute lang bei 14.000 × g zentrifugieren. Danach 80 Mikroliter aus dem Überstand in ein 300-Mikroliter-Hochrückgewinnungs-HPLC-Gefäß überführen.

Die derivatisierten Sialinsäureproben können vier bis sechs Grad Celsius bis zu einer Woche lang aufbewahrt werden. Analysieren Sie die Proben mithilfe eines Standard-HPLC-Systems, das mit einem Online-Fluoreszenzdetektor verbunden ist. Verwenden Sie für die Analyse eine umgekehrte Phase C18-Säule mit einer Länge von 250 Millimetern und einem Durchmesser von 4,6 Millimetern.

Nachdem die Lösungsmittel A und B vorbereitet und der HPLC-Lauf gemäß dem Protokoll eingerichtet wurde, injizieren Sie 50 Mikroliter der Probe in das HPLC-System. Überwachen Sie die Elution mit dem Fluoreszenzdetektor bei einer Anregungswellenlänge von 373 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 448 Nanometern. Berechnen Sie abschließend die relative Menge an Neu5Gc, wie im Textprotokoll beschrieben.

Hier sind repräsentative HPLC-Chromatogramme von fluoreszenzmarkierten Sialinsäuren aus Milchproben gezeigt, die von homozygoten Knock-out-CMAH-Mäusen und heterozygoten Knock-out-CMAH-Mäusen stammen. Wildtyp-Mäuse sind ebenfalls dargestellt. Ebenso werden Chromatogramme der aus Mäuseleber gewonnenen fluoreszenzmarkierten Sialinsäuren gezeigt.

Der Vergleich der relativen Mengen von Neu5Gc zeigt, dass homozygote CMAH-Knock-out-Mäuse kein Neu5Gc enthalten, während heterozygote CMAH-Knock-outs und Wildtyp-Mäuse zwischen 10 und 75 % Neu5Gc enthalten. Wenn man die Methode beherrscht, können die Proben innerhalb von acht Stunden vorbereitet werden, sofern das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Die Proben können anschließend über Nacht mittels HPLC-Autosampling analysiert werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Isolierung der Sialinsäure und die Derivatisierung am selben Tag durchzuführen. Nach Abschluss des Verfahrens können weitere Methoden wie die massenspektrometrische Analyse durchgeführt werden, um die Art der erhaltenen fluoreszierenden Signale zu bestätigen. Die Entwicklung dieser Technik ermöglicht es Forschern, die Verteilung der Sialinsäure in biologischen Proben zu untersuchen.

Beachten Sie, dass das Arbeiten mit konzentrierter Essigsäure und Ameisensäure äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzausrüstung sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.