DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren
25. Oktober 2017
Semiflexiblen Polymere zeigen einzigartige mechanische Eigenschaften, die ausgiebig von Lebewesen angewendet werden. Systematische Studien über Biopolymere sind jedoch beschränkt, da Eigenschaften wie Polymer Steifigkeit nicht zugänglich sind. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie diese Einschränkung durch programmierbare DNA-Nanoröhren, experimentelle Studien über die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit ermöglicht umgangen wird.
Das übergeordnete Ziel dieses neuen DNA-basierten Modellsystems ist es, die grundlegenden Eigenschaften einer Klasse semiflexibler Polymere zu verstehen, die auch das Verhalten einer lebenswichtigen Klasse von Biopolymeren beschreibt. Diese neue Methode ermöglicht es uns, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der weichen Metaphysik zu untersuchen, insbesondere ermöglicht sie es, das Verhalten von semiflexiblen Filamenten und ihre Anordnung in Netzwerken zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die mechanischen Eigenschaften von intravisiven Filamenten experimentell zugänglich sind und genau abgestimmt werden können.
Semiflexible Polymere zeichnen sich durch die besonderen Eigenschaften der Filamente aus, die bisher aufgrund des Fehlens eines abstimmbaren Versuchssystems nur im theoretischen Rahmen behandelt wurden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die definierende Menge semiflexibler Polymere bietet, kann sie auch als neues Hydrogel eingesetzt werden, um die Zellmigration in Matrizen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen, ohne die darunter liegende Maschenweite zu verändern. Die kleinste sich wiederholende Einheit in der Nanoröhre kann man sich als Einheitsring vorstellen.
Mehrere dieser Einheitsringe stapeln sich während der Hybridisierung. Dies führt zur Bildung von länglichen Nanoröhren. Zu Beginn re-suspendieren Sie lyophilisierte Oligonukleotide in gereinigtem Wasser und befolgen Sie die weiteren Re-Suspensionsschritte, die in der entsprechenden Anleitung des Unternehmens angegeben sind.
Passen Sie die Wassermenge an, um eine Endkonzentration von 200 Mikromolaren zu erreichen. Bestimmen Sie die Konzentrationen der einzelnen DNA-Stränge, um die vom Verteiler angegebenen Werte zu überprüfen, da die exakte Stöchiometrie für den Assemblierungsprozess entscheidend ist. Mischen Sie mit einer Mikropipette die DNA-Stränge mit jeweils der gleichen Konzentration in einem für den Thermocycler geeigneten Behälter, um die gewünschten DNA- und Helix-Röhrchen zu bilden.
Hybridisieren Sie die DNA- und Helix-Röhren in einem Thermocycler unter Verwendung der im Textprotokoll gefundenen Parameter. Lagern Sie die hybridisierten DNA- und Helix-Röhrchen bis zu 3 Wochen bei 4 Grad Celsius ohne nachweisbaren Abbau. Verdünnen Sie die Probe vor der Durchführung der Rheologie vorsichtig auf die gewünschte Endkonzentration, gegebenenfalls mit dem Probenpuffer.
Wählen Sie eine geeignete Geometrie für das dynamische Scherrheometer. Laden Sie dann die Probe auf das Rheometer. Um mögliche Verdunstungseffekte zu vermeiden, passivieren Sie die Luft-Wasser-Grenzfläche zwischen Probe und Umgebung durch 1 von 3 Techniken.
Entweder umgeben Sie die Probe mit 2,5 Millilitern des Probenpufferbads. Oder fügen Sie der Probe ein Tensid knapp unter der Mizellenkonzentration hinzu. Alternativ können Sie die Probe mit der Hamilton-Spritze mit Lipid umgeben, um einen direkten Kontakt der Probe mit Luft zu vermeiden.
Verschließen Sie die Probenkammer mit einer Kappe, die mit feuchten Schwämmen ausgestattet ist. Und, wenn möglich, verwenden Sie ein zusätzliches Wasserbad, um die Verdunstung weiter zu unterdrücken. Starten Sie die Messung mit der Rheometer-spezifischen Software bei Raumtemperatur, so dass die Probe 2 Stunden lang bei Raumtemperatur äquilibriert werden kann.
Die Äquilibrierungszeit ist entscheidend, um das Thermoflect-System in einen vollständigen isotropen randomisierten Zustand zu versetzen, da dies die einzige Bestätigung ist, die einen Vergleich zwischen den verschiedenen Messungen ermöglicht. Verarbeiten Sie die Daten nach der Messung wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie 8 Aliquots à 12 Mikroliter für jede Probe mit 1 bis 4 mikromolaren DNA pro Strang, 12,5 millimolarem Magnesiumchlorid und 1x Nukleinsäure-Gelfärbung vor.
Führen Sie auch eine Negativkontrolle ohne DNA durch, schließen Sie jedoch die Nukleinsäure-Gelfärbung ein. Übertragen Sie die Aliquote auf eine real-time PCR-Platte und versiegeln Sie sie mit Klebefolie. Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 mal G für 1 Minute bei Raumtemperatur, um die Gasblasen zu entfernen.
Es ist wichtig, die Gasblasen zu entfernen, da sie sich während der Messungen ausdehnen können und die Proben nicht analysiert werden können. Laden Sie die versiegelte Platte nach der Zentrifugation in ein quantitatives Echtzeit-PCR-System. Programmieren Sie ein Glühprogramm, um die DNA 10 Minuten lang bei neunzig Grad Celsius zu denaturieren und die Temperatur schnell auf zweiundsiebzig Grad Celsius zu senken.
Dann sollte die Temperatur alle dreißig Minuten langsam um 0,5 Grad Celsius sinken. Nachdem das Signal abgeklungen ist, beschleunigen Sie die Temperaturrampe. Stellen Sie sicher, dass sich der Deckel des Cyclers auf mindestens hundert Grad Celsius erhitzt, um die Kondensation von verdampfter Probe auf der Klebefolie zu verhindern.
Während der Assemblierung regen Sie die Proben mit einem Argon-Ionenlaser bei vierhundertachtzig Nanometern an und detektieren Sie die Fluoreszenz bei fünfhundertfünfzig Nanometern bei Verwendung eines CY3-Farbstoffs. Für andere Farbstoffe wählen Sie eine geeignete Anregungsemissionskombination. Messen Sie das Fluoreszenzsignal so oft wie möglich, um die Gesamtsignalqualität mit der eingebauten Kamera zu erhöhen.
Es werden repräsentative Rohdaten einer rheologischen Messung gezeigt, die die Elastizität des Netzwerks aufzeigen. Hier ist der Zeitsweep während der Äquilibrierungszeit dargestellt. Dieses Diagramm zeigt das dehnungsabhängige Verhalten des Netzwerks.
In diesem Diagramm ist das frequenzabhängige Verhalten des Netzwerks offensichtlich. An dieser Stelle werden die Werte mit einer bestimmten Frequenz ausgewählt. Die Werte für die spezifische DNA-Helix-Röhrchenpopulation wurden gegen die Konzentration aufgetragen.
Dieser Vorgang wurde für alle DNA- und Helix-Röhrchen wiederholt. Die Steigung wurde dann in einem logarithmischen Diagramm extrahiert, was den Potenzgesetz-Exponenten ergab. Schließlich wurden die Werte gegen die persistente Länge für jede gemessene Konzentration neu aufgetragen.
Diese Diagramme ermöglichen die Extraktion der Skalierung des elastischen Plateaumoduls in Bezug auf die Konzentration und die Persistenzlänge. Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der weichen Materie und der Polymerphysik, um die Wirkung der Filamentsteifigkeit für die Klasse der semiflexiblen Polymere zu untersuchen. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Effekte wie die Rezitation der verschränkten Netzwerke, die Kreuzung von Netzwerken im Allgemeinen und der Strukturbildungsprozess angesprochen werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie DNA-Nanoröhren hybridisiert und wie man die rheologischen Eigenschaften ihrer Netzwerke misst.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein DNA-basiertes Modellsystem zur Untersuchung semiflexibler Polymere vor, die entscheidend für das Verständnis des Verhaltens von Biopolymeren sind. Die Methode ermöglicht den experimentellen Zugang zu den mechanischen Eigenschaften dieser Polymere und eröffnet Einblicke in deren Steifheit und Netzwerkstrukturen.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Biopolymere
- Weiche Materie Physik
- Mechanische Eigenschaften von Polymeren
Hintergrund
- Halbstarre Polymere weisen einzigartige mechanische Eigenschaften auf.
- Frühere Untersuchungen zu diesen Polymeren waren weitgehend theoretisch.
- Das Verständnis ihrer Steifigkeit ist für verschiedene biologische Anwendungen unerlässlich.
- Programmierbare DNA-Nanoröhren bieten einen neuen experimentellen Ansatz.
Zweck der Studie
- Untersuchung des Verhaltens halbstarrer Filamente.
- Untersuchung ihrer Anordnung zu Netzwerken.
- Schaffung eines justierbaren experimentellen Systems zur Untersuchung mechanischer Eigenschaften.
Verwendete Methoden
- Entwicklung programmierbarer DNA-Nanoröhren.
- Experimentelle Einstellung der Filamentsteifigkeit.
- Anwendung des Systems zur Untersuchung der Zellmigration in Hydrogelen.
- Analyse mechanischer Eigenschaften in Bezug auf die Netzwerkbildung.
Hauptergebnisse
- Die DNA-Nanoröhren ermöglichen eine präzise Kontrolle über die Steifigkeit der Filamente.
- Es wurden Erkenntnisse über die mechanischen Eigenschaften halbsteifer Polymere gewonnen.
- Die Methode kann angewendet werden, um das Zellverhalten in Matrizen mit variabler Steifigkeit zu untersuchen.
- Experimentelle Ergebnisse stützen die theoretischen Vorhersagen zum Verhalten von Polymeren.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet einen neuen Rahmen zur Erfassung halbstarrer Polymere.
- Programmierbare DNA-Nanoröhren sind ein wertvolles Werkzeug für die experimentelle Biologie.
- Zukünftige Forschung kann diese Methode für weiterreichende Anwendungen in der Biophysik nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Programmierbare DNA-Nanoröhren stellen ein einstellbares experimentelles System zur Untersuchung von semiflexiblen Polymeren dar und beheben damit eine zentrale Einschränkung bei der Modellierung der Mechanik von Biopolymeren. Dies ermöglicht eine mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung, indem die Steifigkeit von Filamenten mit dem Verhalten des Netzwerks in zellulären Umgebungen verknüpft wird. Der Ansatz trägt zur Vorhersagbarkeit und Zuverlässigkeit präklinischer Modelle von Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix sowie von hydrogelbasierten Arzneimittelabgabesystemen bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung, wie die Persistenzlänge die Filamentmechanik und Netzwerkbildung beeinflusst.
- Operativer Wert: Bietet über Wochen hinweg ein stabiles, justierbares System, wodurch die Variabilität bei der Hypothesenprüfung in frühen Stadien verringert wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem semiflexible Biopolymere wie Aktin in einem kontrollierbaren Format modelliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare rheologische Größen (elastisches Plattenau-Modul), die mit der Persistenzlänge und Konzentration korrelieren.
- Operativer Wert: Ermöglicht die standardisierte Herstellung von mikrometerlangen Filamenten mit reproduzierbaren Polymerisationskinetiken.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Entwicklung von Assays zur Untersuchung von Substanzen, die die mechanischen Eigenschaften halbstarrer Polymer-Netzwerke verändern.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert die Mechanik der extrazellulären Matrix, um die Zellmigration in steifigkeitsverstellbaren Hydrogelen zu untersuchen, ohne die Maschenweite zu verändern.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine Langzeitlagerung (bis zu 3 Wochen bei 4 °C) ohne Degradation und unterstützt damit mehrtägige präklinische Assays.
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet Einzelmolekül-Messungen der Persistenzlänge mit der makroskopischen Netzwerkmechanik, um eine translationale Kontinuität zu gewährleisten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur präklinischen Evaluation ein, indem sie eine abstimmbare Plattform bereitstellt, um zu untersuchen, wie die Steifigkeit von Filamenten biologische Ergebnisse in matrixabhängigen Assays beeinflusst.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zum Verhalten semiflexibler Polymere durch präzise experimentelle Einstellung der Steifigkeit.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare rheologische Messwerte, die ein zuverlässiges Substanz-Screening in Hydrogel-Matrizen ermöglichen.
- Analytik: Ermöglicht die Bestimmung von Potenzgesetz-Exponenten und Skalierungsbeziehungen zwischen elastischem Modul, Konzentration und Persistenzlänge für datenbasierte Vergleiche.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Steifigkeit mit netzwerkbezogenen mechanischen Eigenschaften, die für Gewebezüchtung und Zellwanderungsstudien relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der Mechanik semiflexibler Polymere über mehrere Projekte in Biophysik und Biomaterialien hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Untersuchung semiflexibler Polymere, indem ein einstellbares, stabiles Modellsystem bereitgestellt wird.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit durch standardisierte Hybridisierungs-, Verdünnungs- und Rheometrieprotokolle sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der Biomaterialentwicklung, indem Netzwerkmechaniken anhand molekularer Gestaltungsparameter vorhergesagt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Hydrogel-Formulierungen basierend auf validierten Struktur-Eigenschafts-Beziehungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in DNA-Hybridisierung, Rheometrie und fluoreszenzbasierten Quantifizierungsverfahren.
- Benötigt Zugang zu einem Thermocycler, einem dynamischen Scherrheometer und einem Echtzeit-PCR-System für die Herstellung und Validierung.
- Setzt eine Standardisierung der Oligonukleotidkonzentrationen und der Magnesiumchlorid-Bedingungen über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung von Nanoröhrenmechaniken auf natürliche Biopolymere oder Hydrogelsysteme.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit, Verdunstung während der Rheometrie zu verhindern und Gasblasen vor der qPCR-Analyse zu entfernen.
